Summary
Hier presenteren we een protocol bij een semi-high throughput celmigratie analyse uit te voeren op een 96-well celcultuur plaat. Dit protocol is een snelle, eenvoudige en economische methode om consistente kras wonden op een cel monolaag te creëren.
Abstract
De celmigratie / verwonden assay is een veelgebruikte werkwijze om celmigratie en andere biologische processen zoals angiogenese en tumormetastase bestuderen. In deze assay worden cellen gekweekt tot een confluente monolaag te vormen en een mechanische wond door krassen met een inrichting. Vervolgens de migratie snelheid van de cellen naar het blootgelegde gebied kan worden gevolgd door beeldvorming. De 8-kanaals mechanische wounder is ontworpen om de meeste van de problemen bij de celmigratie assay pakken. Ten eerste kunnen onze wounder gemakkelijk worden gesteriliseerd door autoclaveren of gewone ontsmettingsmiddelen. In de tweede plaats, laat de individuele verstelbare pinnen zelfs contact op met de celkweek plaat zodat scherpe en reproduceerbare wonden kunnen worden gemaakt. Ten derde, de geleidingsstaven aan beide zijden van de wounder consistente verwonding positie in elk putje. Het gebruik van wegwerp plastic pipet tips voor het verwonden kunnen verder betere hantering van de wounder en cross-contaminat minimaliserenion. Concluderend kan onze mobiele wounder onderzoekers met gebruiksvriendelijke en reproduceerbare inrichting voor het uitvoeren van de celmigratie assay met behulp van de standaard 96-well kweekplaat.
Introduction
Celmigratie speelt een belangrijke rol in de cellulaire processen zoals embryogenese, neurogenese, angiogenese, wondheling, mucosale reparatie, epitheliale-mesenchymale-overgangen in normale ontwikkeling en ziekte situatie 1. Het is een ingewikkeld proces waarbij de coördinatie van een groot aantal inter- en intra-cellulaire evenementen, waaronder signalering molecuul interacties, cel polarisatie, cytoskelet reorganisatie matrix remodeling, membraan uitsteeksel en dynamische cel-cel adhesie modulatie 2 gaat. Door het bestuderen van celmigratie, kan de ontdekking en validatie van chemicaliën of biomoleculen leidt tot cel beweging en de bijbehorende biochemische pathways worden bepaald. Deze fundamentele werkwijze kan met voordeel worden gebruikt als indicatie voor diverse toepassingen, zoals behandeling van ziekten en drug targeting.
Het verwonden assay is een van de celmigratie assays 3. Hier wordt eenindividueel monster van cellen wordt deels mechanisch verwijderd worden om een ontbloot waar cellen migreren naar het gebied te dekken te produceren. Het percentage herstel op een bepaald tijdstip wordt gecontroleerd. Bij het hanteren groot aantal monsters, kan kwesties zoals de experimentele kosten en kruisbesmetting binnen monsters problematisch zijn. Hoewel vele commerciële instrumenten en testen beschikbaar voor het bestuderen celmigratie 4, 5, 6, velen vereist kostbare en geavanceerde apparatuur en verbeteringen zijn nog steeds nodig. Om deze redenen is een 8-kanaals mechanische cel wounder (figuur 1) ontwikkeld.
De 8-kanaals mechanische cel wounder heeft een aantal unieke kenmerken opgenomen in het oplossen van de bovengenoemde problemen. Het biedt de flexibiliteit om cel migratie uit te voeren / verwonden assays in de 96-well cultuur plaat formaat. De verstelbare guIding bar ontwerp zorgt ervoor dat de kras gebied is in de centrale positie van elk putje. Ook kan de hoogte van de geleidingsstaven worden aangepast zodat de wounder geldt voor verschillende merken van kweekplaten. Tot slot, de verstelbare verwonding pin ontwerp maakt een gelijkmatige contact van de pipetpunten met de cultuur plaat oppervlak om gelijktijdige en reproduceerbare verwonden 7, 8 te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inleiding tot de onderdelen van de wounder (figuur 1)
- Bereid de penhouder door de vaststelling van het verwonden pinnen op gelijke afstanden. Houd de pipet tips en pas de hoogte tip door het bewegen van de verstelbare verwonding pinnen op en neer.
- Breng de verstelbare geleiding-balk verschillende merken 96 putjes en zorgen dat de verwonding gebied zich in een vaste positie.
- Bevestig de verstelbare verwonding pen vast door de zeskante schroef. Bevestig de leidende-bar in positie vast door de zeskante kop caps aan beide uiteinden.
2. De breedte van de penhouder instellen (figuur 2)
- Draai de zeskante kop caps met de M5 inbussleutel.
- Plaats een geschikt aantal stelringen aan beide zijden van de penhouder, zodat de geleidingsstaven sluiten perfect aan de breedte van de 96-well kweekplaat.
LET OP: Corning en Iwaki platen vereist 1 paar grote ringen en 1 paar kleine ringen. Falcon en Nunc plAtes nodig 1 paar grote ringen. - Draai de zeskante kop caps om de leidende bar op te lossen.
3. Instellen van de Guiding Bars (figuur 3)
- Monteer de verwonden pinnen met een steriele 10-ul plastic pipetpunten.
- Draai de zeskante kop caps met de M5 inbussleutel.
- Houd de wounder en dompel het verwonden kunnen in een kolom van een 96-well kweekplaat.
- De hoogte van de geleidingsstaven totdat alle tips nauwelijks de bodem van de putjes raken.
- Draai de zeskante kop caps. Zorg ervoor dat de wounder nu perfect past op de cultuur plaat en dat de pennen zijn goed gepositioneerd in het midden van de putten.
4. Kalibratie van de Pins
- Houd de wounder loodrecht op een vlakke ondergrond steriel (dwz petrischaal) en draai de zeskantschroeven met de M3 inbussleutel.
- Tik op de wounder totdat alle tips gelijkmatig de vlakke steriel oppervlak raken. </ Li>
- Draai de zeskante schroeven opnieuw om de pennen vergrendelen.
- Controleer de gelijkheid van elke tip door de wounder zachtjes tikken op het platte steriel oppervlak.
Krassen 5. Cel monolaag (figuur 4)
- Seed menselijke navelstreng vasculaire endotheliale cellen op een 0,1% gelatine gecoate 96-well celkweek plaat. Kweekcellen in Medium 199 aangevuld met 20% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine en 0,09 g / l heparine. Handhaaf cellen in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 ° C overnacht vóór gebruik. De cellen moeten 100% samenvloeiing bereiken voordat verwonden.
- Plaats de verwonding tips op de meest linkse (of meest rechtse) zijde van elk putje in dezelfde kolom van de kweekplaat. Schuif de wounder over naar de andere kant van de put; zorg ervoor dat de verwonding tips zijn de bodem van de put te raken.
- Herhaal de krabben (Stap 5.2) voor alle kolommen.
- Na verwonding, verwerp tHij medium in elk putje en te vervangen door vers medium met het testen van verbindingen.
6. Data Acquisition en beeldanalyse
- Afbeelding doorgaans gunstig met de mechanische gewikkeld op de cel monolaag met een laag vermogen microscoop met digitale camera (bijvoorbeeld 10X objectief) onmiddellijk na verwonding (t = 0 h).
- Voeg testverbindingen indien gewenst en incubeer gedurende de gewenste tijdsduur. Het imago van de hele goed met de wond gebied opnieuw nadat de gewenste incubatietijd (t = Ah).
- Met behulp van beeldanalyse-software zoals ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), het meten van de gewonde gebied op de afbeelding met de losse hand.
- Bereken het percentage wondsluiting:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze 8-kanaals mechanische wounder is geconstrueerd om een cel monolaag krabben om de celmigratie analyse uit te voeren. Het is een gebruiksvriendelijk apparaat dat cel krassen assays in 96-well platen in minder dan een minuut kan uitvoeren zonder speciale opleiding. Dit kan wounder wondgebieden introduceren op celmonolagen met een uniforme breedte van ongeveer 600 micrometer en met scherpe randen (figuren 5 en 6). De breedte van de wonden afhankelijk van het merk van pipetpunten en de prestaties van de gebruiker. Deze reeks wond breedte is geschikt voor gewone beeldopname onder lage-vermogenvergroting (Figuur 7). Na het vastleggen van het beeld, kan het percentage wondsluiting berekend. Deze cel wounder heeft verschillende strategieën opgenomen in het oplossen van problemen met de celmigratie assay. Daarnaast zorgt deze flexibiliteit bij celmigratie testen in verschillende 96-well kweek plat formaten.
Figuur 1: Acht-kanaals mechanische cel wounder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Pas de breedte van de penhouder. Plaats de stelringen om de 96-wells plaat past. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Pas de leidende bars om verschillende plaatformaten te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Krassen op de richting van de tip. Krassen op de cellen in door de wounder van de ene kant van de putbodem naar de andere kant van de putbodem.
Figuur 5: Overzicht van de 96-well plaat na verwonding. De cel monolaag is gewond door de wounder produceren scherpe randen met een uniforme breedte van ongeveer 600 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. < / P>
Figuur 6: Representatieve beelden van een rij en een kolom putjes direct na krabben. Kwantitatieve analyse van de breedte van elke wond. Beelden worden vastgelegd in het kader van een 10x doelstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Gevangen wond afbeeldingen (10X objectief) bij t = 0 h en t = Ah. De gestippelde lijn geeft de wond en de vaste lijn geeft de cel migratie gebied. A) Menselijke navelstrengader endotheliale cellen. B) mensenhaar huid fibroblast.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze cel wounder heeft een aantal unieke functies in het oplossen van de problemen van de traditionele celmigratie assays. De 8-kanaals mechanische cel wounder is gemaakt van hoogwaardig roestvrij staal (staal 304) met een lange levensduur die kan worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Bijna alle commerciële merken van 96 putjes op de markt kan worden gebruikt met deze mechanische cel wounder vanwege de verstelbare geleidingsstaaf. Het ontwerp van de verstelbare geleiding balk zorgt er ook voor dat de scharrelruimte is in het midden van elk putje. De wond in een centrale positie van de put kan vastleggen van het beeld te vergemakkelijken met behulp van een microscoop. De beelden beschikken over een aantal variaties, terwijl genomen op verschillende tijdstippen, maar ze hebben geen invloed op data-analyse, omdat bijna 90% van de put gebied door de microscoop kunnen worden bekeken met een lage vergroting doelstelling (dwz 10X). Derhalve kan een semi-high throughput analyse worden uitgevoerd op 96-putjes 7, <sup class = "xref"> 8. Deze werkwijze vereist nog steeds een groot aantal afbeeldingen, die langdurige gegevensanalyse vereist. Dit kan worden opgelost als een automatisch beeld overnemende systeem beschikbaar.
Het ontwerp van de individuele instelbare pennen van de wounder maakt ook contact met de 96-well plaat oppervlak identiek glad en scherpe wonden bereiken op de cel monolaag. De krassen pinnen commerciële plastic pipetpunten, die kan worden gesteriliseerd en afgevoerd na elke krassen, en kunnen grote elasticiteit contact met het bronoppervlak zonder mechanische schade bieden. Deze voordelen kunnen kruiscontaminatie van monsters verder te minimaliseren tijdens het experiment en de invloed op mobiele verkeer over de Denuded omgeving. In de toekomst, zullen we een verend gecontroleerde pen die de pen hoogteverstelling stap kan elimineren ontwikkelen. De meest kritische stap om dit apparaat te gebruiken is de kracht die wordt uitgeoefend op de cel monolaag tijdens het krassen. De wounder moetgehouden loodrecht tegen de kweekplaat, zodat acht pipetpunten de bodem van de put raken. Inderdaad, de wounder een werkwijze voor de celmigratie assay uit te voeren zonder het gebruik van dure en ingewikkelde apparatuur. Het protocol voor dit wounder is eenvoudig en ongecompliceerd.
Tot slot, onze 8-kanaals mechanische wounder is een gebruiksvriendelijk apparaat voor celmigratie testen die geen speciale vaardigheden vereist. Gebruikers kunnen de celmigratie assay 96-wells platen uit te voeren met een relatief groot aantal monsters op een snelle en eenvoudige wijze 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag aan de heer Tam Po Leung, de heer Wong Chi Kin en de technische staf van de FNWI Workshop, Hong Kong Baptist University, om hun technische vaardigheden en advies te bedanken bij het maken van het prototype van deze wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
