Summary
Hier stellen wir ein Protokoll eine halb hohem Durchsatz Zellmigrationsassay auf einer 96-well Zellkulturplatte durchzuführen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfache und wirtschaftliche Verfahren in Übereinstimmung Kratzwunden auf einer Zell-Monoschicht zu erzeugen.
Abstract
Die Zellmigration / Test verwunden ist eine häufig verwendete Methode der Zellmigration und andere biologische Prozesse, wie Angiogenese und Tumormetastasierung zu studieren. In diesem Assay werden die Zellen gezüchtet eine konfluente Monoschicht und eine mechanische Verwundung durch Kratzen mit einem Gerät erzeugt wird, zu bilden. Dann wird die Migrationsrate der Zellen gegenüber dem entblößten Bereich kann durch Bildgebung überwacht werden. Unsere 8-Kanal-mechanischen wounder soll die meisten Probleme mit der Zellmigrationsassay zugeordnet zu bewältigen. Zum einen können unsere wounder leicht durch Autoklavieren oder mit üblichen Desinfektionsmittel sterilisiert werden. Zweitens erlauben die individuell einstellbare Stifte auch mit der Zellkulturplatte in Verbindung, damit scharf und reproduzierbar Wunden geschaffen werden kann. Drittens sorgen die Führungsstäbe auf beiden Seiten der wounder konsistente Verwundung Position in jeder Vertiefung. Die Verwendung von Einweg-Kunststoff-Pipettenspitzen für Verwundung weiter eine bessere Handhabung des wounder bieten kann sowie Quer VERSCHMUTZ zu minimierenIon. Abschließend kann unsere Zelle wounder Forscher bieten mit einer benutzerfreundlichen und reproduzierbare Vorrichtung zur Durchführung des Zellmigration Test, um die Standard-96-Well-Kulturplatte verwendet.
Introduction
Zellmigration spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Prozessen, wie der Embryonalentwicklung, der Neurogenese, Angiogenese, Wundheilung, Schleimhautreparatur, epithelial-mesenchymalen-Übergänge unter normalen Entwicklung und Krankheitslage 1. Es ist ein komplizierter Prozess, der die Koordination zahlreicher inter- und intrazelluläre Ereignisse , einschließlich Signalmolekül - Wechselwirkungen, Zellpolarisation, Zytoskelett - Reorganisation, Matrixumbau, Membran Vorsprung und dynamische Zell-Zell - Adhäsion Modulation 2 beinhaltet. Durch das Studium der Zellmigration, die Entdeckung und Validierung von Chemikalien oder Biomoleküle, die zu Zellbewegung und seine verwandten biochemischen Wege bestimmt werden. Dieser grundlegende Prozess kann für verschiedene Anwendungen, wie zum Beispiel der Behandlung von Krankheiten und Drug-Targeting-nutzbringend als Proxy verwendet werden.
Die Verwundung Assay ist einer der Zellmigrationsassays 3. Hier wird eineinzelne Probe von Zellen teilweise durch mechanische Mittel entfernt werden, um ein entblößten Bereich zu produzieren, wo Zellen, die den Bereich abdecken wird migrieren. Der Prozentsatz der Rückgewinnung zu einem bestimmten Zeitpunkt wird überwacht werden. Wenn eine große Anzahl von Proben Umgang mit Themen wie der experimentellen Kosten und Kreuzkontamination innerhalb Proben kann problematisch sein. Obwohl viele kommerzielle Tools und Tests für 4 Migration Studium Zelle vorhanden sind, 5, 6, benötigt viele von ihnen teure und komplizierte Ausrüstung und Verbesserungen werden noch benötigt. Aus diesen Gründen ist ein 8-Kanal mechanischen Zell wounder (Abbildung 1) entwickelt.
Unsere 8-Kanal-mechanischen Zell wounder hat bei der Lösung der oben genannten Probleme einige einzigartige Eigenschaften eingearbeitet. Es bietet die Flexibilität, die Zellmigration / Verwundung Assays in 96-Well-Kulturplattenformat durchzuführen. Der einstellbare guIding Bar-Design sorgt dafür, dass die Kratzfläche in der zentralen Position jedes gut ist. Auch kann die Höhe der Führungsstangen verstellt werden, so dass die wounder für verschiedene Marken von Kulturplatten anwendbar ist. Schließlich ermöglicht die einstellbare Verwundung Pin - Design einen noch Kontakt der Pipettenspitzen mit der Kulturplatte Oberfläche zu erreichen gleichzeitige und reproduzierbare Verwundung 7, 8.
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Protocol
1. Einführung in die Teile des wounder (Abbildung 1)
- Bereiten Sie den Stifthalter durch die Verwundung Stifte in gleichen Abständen zu fixieren. Halten Sie die Pipettenspitzen und stellen Sie die Spitzenhöhe und die einstellbaren Verwundung Stifte nach oben und unten durch Bewegung.
- Den verstellbaren Führungsschiene auf verschiedene Marken von 96-Well-Kulturplatten und stellen Sie sicher, dass die Verwundung Bereich in einer festen Position ist.
- Befestigen Sie den verstellbaren Verwundung Stift durch die Sechskantschraube anziehen. Befestigen Sie den Führungsgriff in der Position, die durch die Kopfkappen Sechskant Anzugs an beiden Enden.
2. Einstellen der Breite des Stifthalters (Abbildung 2)
- Lösen Sie die Sechskantkappen mit dem M5 Inbusschlüssel.
- Legen Sie eine geeignete Anzahl von Ringen auf beiden Seiten des Stifthalters so eingestellt wird, dass die Führungsstangen passen perfekt mit der Breite der 96-Well-Kulturplatte.
HINWEIS: Corning und Iwaki Platten erfordert ein Paar von großen Ringen und 1 Paar kleine Ringe. Falcon und Nunc plAtes benötigen ein Paar große Ringe. - Ziehen Sie die Sechskantkappen der Führungsstange zu befestigen.
3. Einstellen der Führungsstangen (Abbildung 3)
- Montieren Sie die Verwundung Stifte mit sterilen 10-ul Kunststoff Pipettenspitzen.
- Lösen Sie die Sechskantkappen mit dem M5 Inbusschlüssel.
- Halten Sie die wounder und tauchen Sie die Verwundung Stifte in eine Spalte einer 96-Well-Kulturplatte.
- Stellen Sie die Höhe der Führungsstangen, bis alle Spitzen kaum den Boden der Vertiefungen berührt.
- Ziehen Sie die Sechskantkappen. Stellen Sie sicher, dass die wounder jetzt perfekt auf der Kulturplatte passt und dass die Stifte sind gut positioniert in der Mitte der Brunnen.
4. Kalibrierung der Pins
- Halten Sie die wounder senkrecht zu einer flachen sterilen Oberfläche (dh Petrischale) und lösen Sie alle Sechskantschrauben mit dem M3 - Inbusschlüssel.
- Tippen Sie auf die wounder bis alle Spitzen gleichmäßig flach sterile Oberfläche berühren. </ Li>
- Ziehen Sie die Sechskantschrauben wieder die Stifte in Position zu verriegeln.
- Schauen Sie sich die Gleichmäßigkeit jeder Spitze durch die wounder sanft auf der flachen sterilen Oberfläche aus.
5. Verkratzen Zellmonolayer (Figur 4)
- Seed humane Nabelschnur vaskuläre Endothelzellen auf einer 0,1% Gelatine beschichtete 96-Well-Zellkulturplatte. Kulturzellen in Medium 199 mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 0,09 g / L Heparin. Pflegen Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 ºC über Nacht vor der Verwendung. Die Zellen sollten 100% Konfluenz erreichen, bevor der Verwundung.
- Legen Sie die Verwundung Spitzen an der linken (oder der ganz rechten) Seite jeder Vertiefung innerhalb der gleichen Spalte der Kulturplatte. Schieben Sie die wounder auf die andere Seite des Bohrlochs; sicherstellen, dass die Verwundung Tipps, um den Boden des Bohrlochs berühren.
- Wiederholen Sie das Kratzen (Schritt 5.2) für alle Spalten.
- Nach Verwundung Verwerfungs ter Medium in jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch frisches Medium, das Testen von Verbindungen.
6. Datenerfassung und Bildanalyse
- Bild das ganze auch mit der mechanischen Wunde auf der Zellschicht ein Low-Power - Mikroskop mit Digitalkamera (zB 10X - Objektiv) unmittelbar nach der Verwundung (t = 0 h) verwendet wird .
- In Testverbindungen, wenn für die gewünschte Länge der Zeit gewünscht und brüten. Bild das ganze gut mit dem Wundbereich nach der gewünschten Inkubationszeit (t = & Delta; h).
- Mit Hilfe der Bildanalyse - Software wie ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), messen Sie den verwundeten Bereich auf dem Bild mit dem Freihand - Werkzeug.
- Berechnen Sie den Prozentsatz des Wundverschlusses:
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Representative Results
Dieser 8-Kanal-mechanische wounder ist so konstruiert, eine Zellschicht, um Kratzer auf der Zellmigration Test durchzuführen. Es ist ein benutzerfreundliches Gerät, das Zell Kratzen Assays in 96-Well-Platten in weniger als einer Minute ohne spezielles Training durchführen können. Diese wounder können Wundflächen auf Zellmonoschichten mit einer gleichmßigen Breite von etwa 600 um und mit scharfen Kanten (5 und 6) einzuführen. Die Breite der Wunden hängt von der Marke von Pipettenspitzen und die Leistung des Benutzers. Dieser Bereich der Wundbreite eignet sich für gemeinsame Bildaufnahme unter niedriger Leistung Vergrößerung (Abbildung 7). Nach der Aufnahme des Bildes kann der Prozentsatz des Wundverschlusses berechnet werden. Diese Zelle wounder hat verschiedene Strategien integriert die Lösung von Problemen mit der Zellmigration Test aufgetreten. Außerdem bietet es Flexibilität bei der Durchführung von Zellmigration Assays in verschiedenen 96-Well-Kultur plate-Formate.
Abbildung 1: Acht-Kanal - mechanischen Zell wounder. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Passen Sie die Breite des Stifthalters. Setzen Sie die Stellringe, um die 96-Mulden Platte passen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Passen Sie die Führungsstangen unterschiedliche Plattenformate passen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Verkratzen Richtung der Spitze. Zerkratzen die Zellen durch die wounder von der einen Seite des Vertiefungsboden auf die andere Seite des Vertiefungsbodens gleitet.
Abbildung 5: Übersicht der 96-Well - Platte nach der Verwundung. Die Zellschicht wird durch die wounder Herstellung von scharfen Kanten von etwa 600 & mgr; m mit gleichbleibender Breite verwundet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. < / P>
Abbildung 6: Repräsentative Bilder von einer Reihe und eine Spalte von Vertiefungen unmittelbar nach Kratzen. Quantitative Analyse der Breite der jeweiligen Wunde. Die Bilder werden unter einem 10X-Objektiv erfasst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Aufgenommene Bilder Wunde (10X - Objektiv) bei t = 0 h und t = & Delta; h. Die gestrichelte Linie zeigt den Wundbereich und die durchgezogene Linie zeigt die Zellmigration Bereich. A) an menschlichen Nabelschnurvenen - Endothelzellen. B) Humane dermale Fibroblasten.erhalten = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Unsere Zelle wounder hat einige einzigartige Eigenschaften in die Probleme der traditionellen Zellmigration Assays zu lösen. Der 8-Kanal-mechanischen Zell wounder ist aus hochwertigem Edelstahl (Stahl 304) mit einer langen Lebensdauer hergestellt, die im Autoklaven sterilisiert werden kann. Fast alle Handelsmarken von 96-Well-Kulturplatten auf dem Markt mit dieser mechanischen Zell wounder verwendet werden, da der verstellbaren Führungsstange. Die Konstruktion der verstellbaren Führungsleiste gewährleistet auch, dass das Zerkratzen Bereich in der Mitte jeder Vertiefung ist. Die Wunde in einer zentralen Position des Bohrlochs kann die Bildaufnahme unter Verwendung eines Mikroskops zu erleichtern. Die Bilder besitzen einige Variationen , während zu verschiedenen Zeitpunkten genommen, aber sie haben nicht die Datenanalyse beeinflussen , da fast 90% der Muldenbereich durch das Mikroskop mit einem schwach vergrößerndes Objektiv (dh 10X) betrachtet werden können. Somit wird eine semi-Hochdurchsatzanalyse kann 7 auf 96-Well - Kulturplatten durchgeführt werden, <sup class = "xref"> 8. Jedoch erfordert dieses Verfahren immer noch eine große Anzahl von Bildern, die langen Datenanalyse erfordern. Dies kann gelöst werden, wenn ein automatisches Bildaufnahmesystem verfügbar ist.
Die Gestaltung der einzelnen einstellbaren Stifte des wounder Kontakt ermöglicht auch bei der 96-Well-Plattenoberfläche identisch sind, glatt und scharf Wunden auf der Zell-Monoschicht zu erreichen. Die Kratzen Stifte sind kommerzielle Kunststoff-Pipettenspitzen, die nach jedem Kratzen sterilisiert und entsorgt werden kann und eine gute Elastizität zur Verfügung stellen kann, die gut Oberfläche ohne mechanische Beschädigungen zu kontaktieren. Diese Vorteile können weiter zu minimieren Kreuzkontamination von Proben während des Experiments und der Einfluss auf die Zellbewegung über die denuded Bereich. In der Zukunft werden wir einen federgesteuerten Stift zu entwickeln, die den Stift Höhenverstellung Schritt zu beseitigen. Der wichtigste Schritt zur Verwendung dieses Geräts ist die Kraft, die auf der Zellschicht während des Kratzen aufgetragen. Der wounder musssenkrecht gegen die Kulturplatte gehalten werden, so dass acht Pipettenspitzen den Boden des Bohrlochs berühren. Tatsächlich stellt die wounder ein Verfahren mit den Zellmigrationsassay ohne die Verwendung von teuren und komplizierten Geräten auszuführen. Das Protokoll für dieses wounder ist einfach und unkompliziert.
Abschließend ist unser 8-Kanal-mechanische wounder ein benutzerfreundliches Gerät für die Zellmigration Assays, die keine speziellen Fähigkeiten erfordert. Benutzer können die Zellmigrationsassay in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer relativ großen Anzahl von Proben in einer schnellen und einfachen Weise 9, 10, 11 durchführen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Herr Tam Po Leung, Mr. Wong Chi Kin und das technische Personal der Fakultät Werkstatt, Hong Kong Baptist University, für ihre technischen Fähigkeiten und Beratung bei der Herstellung der Prototyp dieser wounder danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
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