Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en cellmigrationsassay halv hög genomströmning på en 96-brunnars cellodlingsplatta. Detta protokoll är en snabb, enkel och ekonomisk metod att skapa enhetliga skrap sår på ett cellmonolager.
Abstract
Migreringen cell / sårbildning analys är en vanligt använd metod för att studera cellmigrering och andra biologiska processer, såsom angiogenes och tumörmetastas. I denna analys odlas celler till att bilda ett sammanflytande monoskikt och ett mekaniskt sår skapas genom att skrapa med en enhet. Då migreringshastigheten för cellerna mot blottlagda området kan övervakas genom avbildning. Vår 8-kanals mekanisk wounder är utformad för att ta itu med de flesta av de problem som är förknippade med analyscellmigration. För det första kan vår wounder lätt steriliseras genom autoklavering eller med vanliga desinfektionsmedel. För det andra tillåter de individuella justerbara stift även kontakt med cellodlingsplatta så att man kan skapa skarpa och reproducerbara sår. För det tredje, de vägledande barer på båda sidor av wounder säkerställa konsekvent sårskada position i varje brunn. Användningen av engångsplast pipettspetsar för skadade kan ytterligare ge bättre hantering av wounder samt för att minimera kors contaminatJon. Sammanfattningsvis kan vår cell wounder ge forskare en användarvänlig och reproducerbar anordning för att utföra analysen av cellmigration genom att använda standard 96-brunnars odlingsplatta.
Introduction
Cell migrationen spelar en viktig roll i cellulära processer, såsom embryogenes, neurogenes, angiogenes, sårläkning, mucosal reparation, epitelceller-mesenkymala-övergångar vid normal utveckling och sjukdomssituationen en. Det är en komplicerad process som innebär samordning av många inter- och intra-cellulära händelser, inklusive signalmolekyl interaktioner, cell polarisering, cytoskelettala omorganisation, matrix remodeling, membran utsprång och dynamisk cell-cell adhesion modulering 2. Genom att studera cell migration, kan upptäckten och validering av kemikalier eller biomolekyler som leder till cellrörelse och dess relaterade biokemiska vägar bestämmas. Denna grundläggande process kan med fördel användas som en proxy för olika tillämpningar, såsom behandling av sjukdomar och läkemedel inriktning.
Den såra analysen är en av de cellmigrationsanalyser 3. Här, enindividuella prov av celler kommer att delvis avlägsnas på mekanisk väg för att producera en blottlagda område där cellerna kommer att migrera för att täcka området. Procentandelen av återhämtning vid en viss tidpunkt kommer att övervakas. Vid hantering av stort antal prover, kan frågor som den experimentella kostnader och korskontaminering inom proverna vara problematiskt. Även om många kommersiella verktyg och analyser är tillgängliga för att studera cell migration 4, 5, 6, många av dem krävs dyr och avancerad utrustning och fortfarande behövs förbättringar. Av dessa skäl är en 8-kanals mekanisk cell wounder (Figur 1) utvecklats.
Vår 8-kanals mekanisk cell wounder har införlivat ett flertal unika egenskaper för att lösa de ovan nämnda problemen. Det ger flexibilitet att utföra cellmigration / såra analyser i 96-brunnars odlingsplattformat. Den justerbara guIding bar design säkerställer att repa området är i den centrala positionen av varje brunn. Dessutom kan höjden på de vägledande barer justeras så att wounder är tillämpbar för olika märken av odlingsplattor. Slutligen, den justerbara såra stift konstruktion möjliggör en jämn kontakt pipettspetsarna med odlingsplatta ytan för att uppnå samtidig och reproducerbar såra 7, 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Introduktion till de delar av den Wounder (Figur 1)
- Förbered stifthållaren genom att fastställa skadades stift på lika avstånd. Håll pipettspetsarna och justera spetshöjden genom att flytta de justerbara sårskada stiften upp och ner.
- Montera den justerbara styr-bar på olika märken av 96-brunnsodlingsplattor och se till att såra området är i ett fast läge.
- Fäst justerbara såra stift genom att dra åt sexkantskruven. Fäst leds bar på plats genom att dra åt hex socket head lock i båda ändarna.
2. Inställning Bredden på låsstifthållare (Figur 2)
- Lossa hex insex kapsyler med M5 insexnyckel.
- Sätt ett lämpligt antal inställningsringarna på båda sidor av stifthållaren så att styrstänger passar perfekt med bredden på 96-brunnars odlingsplatta.
OBS: Corning och Iwaki plattor kräver ett par stora ringar och ett par små ringar. Falcon och Nunc plates behöver ett par stora ringar. - Dra åt insex huvudet lock för att fixera styrskena.
3. Justering av Vägledande Bars (Figur 3)
- Montera skadades stift med sterila 10-mikroliter plast pipettspetsar.
- Lossa hex insex kapsyler med M5 insexnyckel.
- Håll wounder och doppa sårandet stiften i en kolumn i en 96-brunnars odlingsplatta.
- Justera höjden av styrstänger tills alla tips knappt vidröra botten av brunnarna.
- Dra åt hex socket head lock. Se till att wounder nu passar perfekt på odlingsplattan och att stiften är väl positionerat i mitten av brunnarna.
4. Kalibrering av Pins
- Håll wounder vinkelrätt mot en plan steril yta (dvs petriskål) och lossa alla insexskruvarna med M3 insexnyckel.
- Tryck på wounder tills alla tips jämnt vidrör den plana steril yta. </ Li>
- Dra åt insexskruvarna igen för att låsa stiften i läge.
- Kontrollera jämnhet varje spets genom att trycka på wounder försiktigt på den plana steril yta.
5. Skrapning cellmonoskiktet (fig 4)
- Utsädes humana umbilikala vaskulära endotelceller på en 0,1% gelatin-belagda 96-brunnars cellodlingsplatta. Kulturceller i Medium 199 kompletterat med 20% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin och 0,09 g / L heparin. Upprätthålla celler i en fuktad inkubator med 5% koldioxid vid 37 ° C över natt innan de användes. Celler bör uppgå till 100% konfluens innan såra.
- Placera sårskada tips på längst till vänster (eller längst till höger) sida av varje brunn inom samma kolumn i odlingsplattan. Skjut wounder över till den andra sidan av brunnen; se till att såra spetsar ligger an mot botten av brunnen.
- Upprepa repor (steg 5,2) för alla kolumner.
- Efter sårskada, kassera than medium i varje brunn och ersätta med färskt medium innehållande testföreningar.
6. Datainsamling och bildanalys
- Bild hela väl med den mekaniska sår på cellmonoskiktet med hjälp av en låg effekt mikroskop med digitalkamera (t.ex. 10X objektiv) omedelbart efter skada (t = 0 h).
- Lägga testföreningar, om så önskas och inkubera under den önskade tidslängden. Bild hela väl med sårområdet igen efter önskad inkubationstiden (t = Ah).
- Använda bildanalys programvara som ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), mäta skadade området på bilden med hjälp av frihand verktyg.
- Beräkna procentandelen av sårtillslutning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta 8-kanals mekanisk wounder är konstruerad för att skrapa en cell monoskikt för att utföra analysen cellmigration. Det är ett användarvänligt enhet som kan utföra cell repa analyser in 96-brunnsplattor i mindre än en minut utan speciell träning. Denna wounder kan införa lindade områden på cellmonoskikt med en enhetlig bredd på omkring 600 | j, m och med skarpa kanter (fig 5 och 6). Bredden av såren beror på vilket märke av pipettspetsar och användarens prestanda. Denna serie av sår bredd är lämplig för vanliga bildfångande under låg effekt förstoring (Figur 7). Efter att fånga bilden, kan den procentuella andelen av sårtillslutning beräknas. Denna cell wounder har införlivat olika strategier för att lösa problemen med analyscellmigration. Dessutom ger det flexibilitet i att utföra cellmigrationsanalyser i olika 96-brunnars odlings plåt format.
Figur 1: Åtta-kanals mekanisk cell wounder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Justera bredden på stifthållaren. Sätt justeringsringarna för att passa 96-brunnar platta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Justera styrstänger för att passa olika plattformat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: sprätta riktningen av spetsen. Skrapa cellerna genom att skjuta wounder från en sida av brunnens botten till den andra sidan av brunnen botten.
Figur 5: Översikt över 96-brunnar efter sårbildning. Cellmonoskiktet är sårad av wounder producerar skarpa kanter med en enhetlig bredd på ca 600 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. < / P>
Figur 6: representativa bilder av en rad och en kolumn av brunnar omedelbart efter repor. Kvantitativ analys av bredden på varje sår. Bilderna är tagna under ett 10X objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Tagna sår bilder (10X objektiv) vid t = 0 h och t = Ah. Den prickade linjen anger sårområdet och den heldragna linjen indikerar den cellmigration området. A) Humana navelvenendotelceller. B) humana dermala fibroblaster.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår cell wounder har flera unika egenskaper för att lösa problemen med traditionella cellmigrationsanalyser. Den 8-kanals mekanisk cell wounder är tillverkad av högvärdigt rostfritt stål (stål 304) med en lång livslängd som kan steriliseras genom autoklavering. Nästan alla kommersiella märken av 96-brunnars odlingsplattor som finns på marknaden kan användas med denna mekaniska cell wounder på grund av den justerbara styraxel. Utformningen av den justerbara styraxel säkerställer också att sprätta området är vid centrum av varje brunn. Såret i ett centralt läge i brunnen kan underlätta bild fånga användning av ett mikroskop. Bilderna har vissa variationer medan tagna vid olika tidpunkter, men de påverkar inte dataanalys eftersom nästan 90% av brunnen området kan ses genom mikroskopet med en låg förstoring mål (dvs 10X). Således kan utföras en semi-hög genomströmning analys på 96-brunnars odlingsplattor 7, <sup class = "xref"> 8. Emellertid kräver denna metod fortfarande ett stort antal bilder, som kräver långa dataanalys. Detta kan lösas om en automatisk bild förvärva systemet är tillgängligt.
Utformningen av de individuella justerbara stiften i wounder tillåter jämn kontakt med den 96-brunnars platta ytan för att uppnå identiska, jämna och skarpa sår på cellmonoskiktet. De skrapa stift är kommersiella plast pipettspetsar, som kan steriliseras och anordnade efter varje enskild repor, och kan ge stor elasticitet att kontakta brunnens yta utan mekanisk skada. Dessa fördelar kan ytterligare minimera korskontaminering av prover under experimentet och påverkan på cellrörelse över blottlagda området. I framtiden kommer vi att utveckla en fjäderstyrd tapp som kan eliminera steget stiftet höjdjustering. Den mest kritiska steget för att använda den här enheten är den kraft som anbringas på cellmonoskiktet under repor. Den wounder musthållas vinkelrät mot odlingsplattan, så att åtta pipettspetsar vidröra botten av brunnen. I själva verket tillhandahåller wounder en metod för att utföra analysen av cellmigrering utan användning av dyrbar och komplicerad utrustning. Protokollet för denna wounder är enkel och okomplicerad.
Sammanfattningsvis är ett användarvänligt anordning för cellmigrationsanalyser som inte kräver några speciella färdigheter vår 8-kanals mekanisk wounder. Användare kan utföra analys av cellmigration i 96-brunnars plattor med en relativt stort antal prover på ett snabbt och enkelt sätt 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Tam Po Leung, Mr Wong Chi Kin och teknisk personal av fakulteten Workshop, Hong Kong Baptist University, för deras tekniska kompetens och råd för att göra en prototyp av denna wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
