Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre en semi høy gjennomstrømning cellemigrasjon analyse på en 96-brønners cellekulturplate. Denne protokollen er en rask, enkel og økonomisk metode for å lage konsistente skrape sår på en celle monolag.
Abstract
Den cellemigrering / såre-analysen er en vanlig brukt metode for å studere cellemigrering og andre biologiske prosesser, slik som angiogenese og tumormetastase. I denne analysen blir celler dyrket for å danne et konfluent monolag, og en mekanisk sår er skapt ved å skrape med en enhet. Da migrasjonsrate av cellene mot ribbet området kan bli overvåket ved avbildning. Våre 8-kanals mekanisk wounder er utformet for å håndtere de fleste av de problemer som er forbundet med cellemigrering analysen. For det første, kan vår wounder være lett steriliseres ved autoklave eller med vanlige desinfeksjonsmidler. For det andre, de individuelle justerbare pinnene tillater jevn kontakt med cellekulturplaten, slik at skarpe og reproduserbare sår kan opprettes. For det tredje, de veiledende barer på begge sider av wounder sikre konsekvent såret posisjon i hver brønn. Bruk av engangs plast pipetter for såret kan videre gi bedre håndtering av wounder samt å redusere risikoen for kryss contamination. Som konklusjon kan vår celle wounder tilveie forskere med et brukervennlig og reproduserbar anordning for å utføre cellemigrering analyse ved bruk av standard 96-brønners kulturplate.
Introduction
Celle migrasjon spiller en viktig rolle i cellulære prosesser, slik som embryogenesen neurogenesis, angiogenese, sårheling, mucosal reparasjon, epiteliale-mesenchymale-overganger ved normal utvikling og sykdom situasjon 1. Det er en komplisert prosess som innebærer samordning av en rekke inter- og intra-cellulære hendelser, inkludert signalmolekyl interaksjoner, celle polarisering, cytoskeletal omorganisering, matrix ombygging, membran protrusion og dynamisk celle-celle adhesjon modulasjon to. Ved å studere celle migrasjon, kan oppdagelsen og validering av kjemikalier eller biomolekyler som fører til celle bevegelse og relaterte biokjemiske mekanismer bestemmes. Denne grunnleggende prosessen kan med fordel brukes som en proxy for ulike programmer, for eksempel sykdom behandling og narkotika målretting.
Den såret analysen er en av de cellemigrerings analysene 3. Her, enindividuell prøve av cellene blir delvis fjernet ved mekaniske midler for å fremstille en ribbet område hvor cellene vil migrere til å dekke området. Prosentandelen gjenvinning på et bestemt tidspunkt vil bli overvåket. Ved håndtering av stort antall prøver, kan spørsmål som eksperimentell kostnader og krysskontaminering innenfor prøvene være problematisk. Selv om mange kommersielle verktøy og analyser er tilgjengelige for å studere cellemigrering 4, 5, 6, mange av dem som kreves kostbart og avansert utstyr og forbedringer er fortsatt nødvendig. Av disse grunner er en 8-kanals mekanisk celle wounder (figur 1) som er utviklet.
Våre 8-kanals mekanisk celle wounder har innarbeidet flere unike trekk i å løse de ovennevnte problemer. Det gir fleksibilitet til å utføre cellemigrasjon / såret analyser i 96-brønn kultur plate format. Den justerbare guiding bar design sikrer at grunnen området er i den sentrale plasseringen av hver brønn. Dessuten kan høyden på guiding barer justeres slik at wounder gjelder for ulike merker av kulturplater. Til slutt, den justerbare såret pin design gir en jevn kontakt pipettespissene med kulturen plate overflaten for å oppnå samtidig og reproduserbar såret syv, åtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Introduksjon til Deler av wounder (figur 1)
- Forbered pinneholderen ved å feste såret pinnene i samme avstand. Hold pipettespissene og justere tuppen høyden ved å flytte de justerbare såret pinnene opp og ned.
- Monter den justerbare guiding-bar på forskjellige merker av 96-brønners kulturplater og sørge for at såret området er i en fast stilling.
- Fest den justerbare såret pinnen ved å stramme sekskantskruen. Fest guiding-bar i posisjon ved å stramme hodet caps hex socket på begge ender.
2. Sette bredden på Pin Holder (figur 2)
- Løsne hode caps hex socket med M5 unbrakonøkkelen.
- Sette inn et passende antall justeringsringer på begge sider av pinneholderen, slik at førings stolpene passer perfekt sammen med bredden på 96-brønners kulturplate.
MERK: Corning og Iwaki plater krever en par store ringer og en par små ringer. Falcon og Nunc plAtes trenger en par store ringer. - Stram sekskant socket hodet caps for å fikse det styrende bar.
3. Justering av Veil Bars (figur 3)
- Monter såret pins med sterile 10-mL plast pipettespisser.
- Løsne hode caps hex socket med M5 unbrakonøkkelen.
- Hold wounder og dypp såret pinnene inn i en kolonne av en 96-brønners kulturplate.
- Juster høyden på de veiledende barer til alle tipsene knapt berøre bunnen av brønnene.
- Stram hodet caps hex socket. Kontroller at wounder nå passer perfekt på kultur plate og at pinnene er godt posisjonert i midten av brønnene.
4. Kalibrering av pinnene
- Hold wounder vinkelrett på en flat steril overflate (dvs. petriskål) og løsne alle sekskantskruer med M3 unbrakonøkkelen.
- Trykk på wounder til alle tipsene jevnt berøre flat steril overflate. </ Li>
- Trekk til sekskantskruer igjen for å låse pinnene på plass.
- Sjekk jevnhet av hver spiss ved å trykke på wounder forsiktig på den flate steril overflate.
5. Kloring Cell ett lag (figur 4)
- Seed humane navlestreng vaskulære endotelceller på en 0,1% gelatin-belagte 96-brønners cellekulturplate. Kultur celler i medium 199 supplert med 20% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin og 0,09 g / l heparin. Opprettholde celler i en fuktig inkubator med 5% karbondioksyd ved 37 ° C over natten før bruk. Cellene skal nå 100% confluency før såret.
- Plasser såret tips på den lengst til venstre (eller lengst til høyre) side av hver brønn i den samme kolonne i kulturplaten. Skyv wounder over til den andre siden av brønnen; sørge for at såret tips berører bunnen av brønnen.
- Gjenta skrape (trinn 5.2) for alle kolonner.
- Etter såret, kast than medium i hver brønn, og erstatte med friskt medium som inneholdt testforbindelser.
6. Data Acquisition og bildeanalyse
- Bilde hele godt med den mekaniske sår på cellemonolaget ved hjelp av en lav-effekt mikroskop med digitalt kamera (f.eks 10X objektiv) umiddelbart etter såret (t = 0 t).
- Legg testforbindelser hvis ønskelig og inkuberes i det ønskede tidsrom. Bilde hele godt med sårområdet igjen etter at den ønskede inkubasjonstiden (t = Ah).
- Ved hjelp av bildeanalyse programvare som ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), måle sårede området på bildet ved hjelp av frihånd verktøyet.
- Beregn prosentandelen for sårheling:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette 8-kanals mekanisk wounder er konstruert for å skrape en celle monolag for å utføre cellemigrering analysen. Det er en brukervennlig enhet som kan utføre celle skrape analyser i 96-brønners plater på mindre enn et minutt uten spesiell opplæring. Dette wounder kan innføre viklede områder på cellemonolagene med en ensartet bredde på omtrent 600 um og med skarpe kanter (figurene 5 og 6). Bredden på sårene avhenger helt av pipetter og brukerens ytelse. Denne serien av sår bredde er egnet for felles bildeopptaks under lavt strømforbruk forstørrelse (figur 7). Etter at bildet er tatt, kan andelen for sårheling beregnes. Denne cellen wounder har innarbeidet ulike strategier for å løse problemene med celle migrasjon analysen. Dessuten gir det fleksibilitet i å utføre celle migrasjon analyser i ulike 96-brønn kultur plspiste formater.
Figur 1: Åtte-kanals mekanisk celle wounder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Juster bredden på pinneholderen. Sett justeringsringer for å passe 96-brønner plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Juster guiding barer for å passe ulike plateformater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: risser retning av spissen. Skrap celler ved å skyve wounder fra den ene side av bunnen av brønnen til den andre siden av brønnbunnen.
Figur 5: Oversikt over 96-brønns plate etter såret. Den celle monolag blir skadet av den wounder å produsere skarpe kanter med ensartet bredde på ca 600 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. < / P>
Figur 6: Representative bilder av en rad og en søyle av brønner umiddelbart etter riper. Kvantitativ analyse av bredden av hvert sår. Bildene er tatt under en 10X objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Captured sårbilder (10X objektiv) ved t = 0 t og t = Ah. Den stiplede linjen viser det sårområdet og den heltrukne linjen angir den cellemigrering området. A) Menneskelige umbilikalvene endotelceller. B) Menneskelig dermal fibroblast.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår celle wounder har flere unike funksjoner i å løse problemene med tradisjonelle celle migrasjon analyser. Den 8-kanals mekanisk celle wounder er laget av høy klasse rustfritt stål (stål 304) med lang levetid som kan steriliseres ved autoklavering. Nesten alle kommersielle merkevarer av 96-brønners kulturplater på markedet kan brukes med denne mekaniske celle wounder på grunn av den justerbare guiding bar. Utformingen av den justerbare guiding bar sikrer også at skrape området er i midten av hver brønn. Såret i en sentral posisjon i brønnen kan lette image fange ved hjelp av et mikroskop. Bildene har noen variasjoner mens tatt på forskjellige tidspunkter, men de påvirker ikke dataanalyse fordi nesten 90% av brønnområdet kan sees av mikroskop med en lav forstørrelse objektiv (dvs. 10X). Således kan en semi-høy gjennomstrømning analyse bli utført på 96-brønners kulturplater 7, <sup class = "xref"> 8. Imidlertid krever denne metoden likevel et stort antall bilder som krever lange dataanalyse. Dette kan løses dersom en automatisk bilde anskaffe system er tilgjengelig.
Utformingen av de individuelle justerbare stiftene på wounder tillater jevn kontakt med den 96-brønns plate overflate for å oppnå identiske, glatte og skarpe sår på cellemonolaget. Skrape pins er kommersielle plast pipettespisser, noe som kan steriliseres og destrueres etter hver eneste skrape, og kan gi stor elastisitet å kontakte vel overflate uten mekaniske skader. Disse fordelene kan ytterligere redusere risikoen for kryssforurensning av prøvene under eksperimentet og påvirkning på celle bevegelse på tvers av ribbet området. I fremtiden vil vi utvikle en fjærstyrt tapp som kan eliminere pinnen høydejustering trinn. Den mest kritiske trinnet for å bruke denne enheten er kraften på cellen monolayer under kløingen. Den wounder måholdes vinkelrett mot kulturplaten, slik at åtte pipettespissene berører bunnen av brønnen. Faktisk gir de wounder en fremgangsmåte for å utføre cellemigrering analysen uten bruk av kostbart og komplisert utstyr. Protokollen for dette wounder er enkel og grei.
I konklusjonen, er vår 8-kanals mekanisk wounder en brukervennlig enhet for celle migrasjon analyser som krever ingen spesielle ferdigheter. Brukere kan utføre cellemigrering analyse i 96-brønners plater med et forholdsvis stort antall prøver på en rask og enkel måte 9, 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Mr. Tam Po Leung, Mr. Wong Chi Kin og den tekniske staben av teknisk- naturvitenskapelige fakultet Workshop, Hong Kong Baptist University, for sine tekniske ferdigheter og råd i å lage prototypen på dette wounder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Other brands of 96-well cell culture plate can also be used |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Short P10 pipette tip is more easy to create a clear wound |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | For cell culture of human umbilical vein endothelial cells. Use appropirate culture medium and condition for other type of cells. |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980 (2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
