Introduction
Geschat wordt dat planten dan 200.000 verschillende soorten chemische verbindingen 1. Slechts de minderheid van deze verbinding lijkt een primaire rol in het metabolisme van de plant, waarin brandstoffen groei en reproductie; de meerderheid zogenaamde secundaire metabolieten. Ondanks hun naam, secundaire metabolieten zijn vaak van cruciaal belang voor planten overleving en voortplanting, omdat ze dienen om bestuivers aan te trekken of om de plant tegen pathogenen en herbivoren 1 te verdedigen.
Glucosinolaten een diverse klasse van secundaire metabolieten die zijn onderzocht op meer dan 150 jaar 2. Tot op heden zijn meer dan 130 verschillende glucosinolaten structureel geïdentificeerd 3. In grote lijnen kan glucosinolaten worden onderverdeeld in verschillende klassen op basis van het aminozuur waaruit zij gesynthetiseerd. Indoolglucosinolaten bijvoorbeeld worden gesynthetiseerd uit het aminozuurtryptofaan, fenylalanine bepaalt dat het basisskelet voor de synthese van aromatische glucosinolaten 4. De klassen, is er een hoge structurele diversiteit, die teweeg wordt gebracht door opeenvolgende ketenverlenging stappen in de biosynthetische routes, zoals de klasse van alifatische glucosinolaten, of zijketen modificaties (bijvoorbeeld hydroxylering) 4, 5. Eén glucosinolaat plantensoorten kan tot 37 verschillende glucosinolaten die behoren tot verschillende structurele klassen 6 bevatten. Hoewel plantensoorten hebben typisch glucosinolaat profielen, is intraspecifieke variatie voor de typen glucosinolaten vaak gevonden tussen individuen en bevolkingsgroepen 6, 7. Intacte glucosinolaten worden opgeslagen in de vacuole van plantencellen en kunnen worden gevonden in een bovengrondse of ondergrondse orgaan 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Bij cel breuk (bijvoorbeeld door herbivorie), zijn glucosinolaten vrijgegeven en worden gemengd met het enzym myrosinase, verrekening een mosterdolie bom 10. Door de werking van myrosinase, en afhankelijk van de structuur van de glucosinolaten, de reactiecondities en de aanwezigheid van modificerende enzymen worden verschillende scherpe, giftige of schadelijke verbindingen gevormd, zoals nitrillen en (iso) 11 thiocyanaten. De reactieproducten hebben een hoge biologische activiteit; bijvoorbeeld, ze dienen als insectenwerende middelen van generalistische insect herbivoren 12. De erfelijkheid en biosynthetische paden van glucosinolaten zijn goed bestudeerd, vooral als gevolg van hun belang voor herbivoor en resistentie tegen pathogenen, hun waarde als aromacomponenten in mosterd en kool, en hun negatieve (progoitrin) en positieve (glucoraphanin) effecten op de gezondheid van de mens 5, 13, 14.
Vanwege de grote belangstelling in glucosinolaten als biologisch actieve verbindingen, extractie en detectiemethoden gebaseerd op omgekeerde-fase hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) voorzien van ultraviolet (UV) of fotodiode array (PDA) detector zijn vaak gebruikt sinds de jaren 1980 15 . Op basis van deze methode, de Europese Gemeenschappen gaf een standaardprotocol dat werd getest en gevalideerd in verschillende laboratoria voor het analyseren van glucosinolaten in oliehoudende zaden (Brassica napus, koolzaad, canola 16). Anderen toegevoegd aan deze methode (bijvoorbeeld door het bepalen van extra responsfactoren voor glucosinolaten die niet aanwezig zijn in koolzaad zijn) 17. Ondanks de toenemende beschikbaarheid van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms en high-throughput protocollen voor glucosinolaat analyse 18
Protocol
1. Bereiding van oplossingen nodig zijn voor de glucosinolaat Extraction
- Bereid 500 ml 70% methanol (MeOH) in water (ultrazuiver) in een glazen fles. Voor monsters 100 en 5 standaards, 420 ml 70% MeOH nodig.
- Bereid 20 mM natriumacetaat (NaOAc) (pH = 5,5) door toevoeging van 0,82 g NaOAc en 1,36 g NaOAc x 3 H 2 O in 500 ml water; breng de pH met zoutzuur (HCl). Bewaar de NaOAc in de koelkast. Voor 100 monsters en 5-normen, 370 ml van 20 mM NaOAc (pH = 5,5) in water nodig is.
- Het kolommateriaal te bereiden, mengen 10 g verknoopt dextran gel (type G-25) met 125 ml ultrazuiver water. Bewaar het verkregen mengsel in een koelkast (4 ° C).
- Bereiding van de oplossing sulfatase
- Ontbinden 10.000 eenheden van aryl sulfatase (type H-1 van Helix pomatia) in 30 ml ultrapuur water en voeg 30 ml absolute ethanol (EtOH). Meng de oplossing goed en overbrengen naar een 250-mL centrifuge buis of meerdere kleinere buizen, afhankelijk van de beschikbaarheid.
- Centrifugeer het mengsel bij 2650 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT). Breng de bovenstaande (en) naar een bekerglas; voeg 90 ml EtOH en meng het. Centrifugeer de mengsel in een of meer centrifuge buizen bij 1030 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi de supernatanten. Lossen en combineren de pellets in totaal 25 ml ultrazuiver water. Vortex goed, afzien in 1-mL buizen, en op te slaan in een vriezer bij -20 ° C; ze gedurende ten minste één jaar.
- Bereiding van de sinigrine referentieoplossing
- Weeg in ongeveer 9 mg sinigrine monohydraat met 1-ug nauwkeurigheid (bijvoorbeeld 8,769 mg). Overbrengen naar een 10 ml maatkolf en los de sinigrin monohydraat in 10,0 ml ultrapuur water.
- Bereken de molariteit van de voorraad oplossing en voor te bereiden vijf sinigrine verwijzingen tussen 50-750 uM door het verdunnen van de voorraad oplossing. Voor een gedetailleerd voorbeeld, zie Aanvullende File S1 .
- Verdeel de verschillende sinigrin gevonden in 1,5 ml reactiebuizen en invriezen bij 20 ° C. Zijn een reeks van vijf sinigrine Wanneer in batch extractie. Gebruik altijd de juiste molariteit waarden voor de momenteel gebruikte sinigrin referenties bij de berekening van de concentraties.
2. Voorbereiding van de Extraction Setup
- Bereid een kolom rek voor de Pasteur pipet kolommen (voor de bereiding van kolommen, zie stap 3,1). Label het rek of de kolommen te houden van de aantallen monsters te houden (zie figuur 1).
- Bereid een blok met hetzelfde aantal gelabelde 2 ml microcentrifugebuizen (zie stap 3,3 en Figuur 1)
5 / 55425fig1.jpg "/>
Figuur 1: Rek voor glucosinolaat extractie. Vooraanzicht (links) en bovenaanzicht (rechts) van een self-made column rek en blok voor de glucosinolaat extractie. Hoogte: 100 mm, afstand tussen verschoven gaten (de Pasteur pipet kolommen houden): 30 mm (x-as) x 15 mm (y-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bereiding van de kolommen en microcentrifugebuizen
- Bereid één kolom per monster en vijf extra kolommen voor de vijf sinigrine referentiemonsters.
- In elk glas pipet, plaats een stuk glaswol ongeveer 1 cm x 1 cm. Gebruik een houten of glazen staafje op de glaswol beneden te duwen tot het punt waar de pipet versmalt. De glaswol moet voorkomen dat de kolom materiaal van het lopen, maar niet te veel te gebruiken, omdat dit de uitwassen van de kolommen zal vertragen. Draag handschoenen when het werken met de glaswol.
- Plaats de kolommen op de kolom rek (zie figuur 1). Plaats de kolom rek in een lab tray (afvalbak) naar de elutiemiddelen gebruikt voor de opeenvolgende kolom wast vangen.
- Snijd de eerste 5 mm van het uiteinde van een plastic 1 ml pipetpunt en Pipetteer 0,5 ml van de bereide kolom materiaal (G-25 gel in water, zie stap 1,3) in elke kolom. Schud de fles met de kolom materiaal ruim voor pipetteren. Gooi lekkende columns (G-25 materiaal loopt via de glaswol laag) en vervangen door nieuwe.
- Na pipetteren de kolom materiaal in de kolommen, voeg 1 ml ultrapuur water te spoelen door het materiaal.
- Bereid een 2-mL reageerbuis per monster en vijf buizen voor de vijf sinigrine referentiemonsters; label ze. Gebruik een dissectie naald gaten in de kappen later vriesdrogen maken en plaats de bereide buizen in de buis blok in exact hetzelfde schema als dekolommen (stap 2,2, zie figuur 1).
4. Extractie van glucosinolaten
- Weeg gevriesdroogd en fijn gemalen plantenmateriaal (meestal 50,0-100,0 mg drooggewicht, de uiteindelijke concentraties glucosinolaten in het extract moet in het bereik van de referentiecurve) tot op 0,1 mg in 2 ml, gemerkt round -Bottom reactie buizen. Voeg twee metalen kogeltjes (3 mm in diameter) als kokende middelen aan elke buis.
OPMERKING: Het protocol kan worden toegepast voor, snel bevroren materialen, die onder vloeibare stikstof gemalen zijn en bevroren gehouden tot extractie. Verhoog de hoeveelheid materiaal gewogen voor extractie en het percentage MeOH in de extractievloeistof tot 85% te compenseren voor verdunning door het water in het materiaal 19. - Pipetteer 1 ml van 70% MeOH in elke buis en vortex kort. Sluit de buizen en verzegelen ze met de veiligheid kappen voordat u ze zo snel mogelijk in een hete water bad (90-92 ° C) gedurende enkele minuten (~ 5 min), totdat het 70% MeOH juist kookt. Let op: Draag een veiligheidsbril tijdens deze stap!
- Plaats de monsterbuizen in een ultrasoon bad gedurende 15 min. Ondertussen nemen de sulfatase en de vijf sinigrin verwijzing monsters uit de vriezer om ze te ontdooien bij kamertemperatuur.
- Na ultra-sonicatie, gecentrifugeerd monsterbuizen bij 2700 xg in een benchtop centrifuge gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur; een pellet moet vormen in elke buis. Voeg de supernatanten met de gedeclareerde kolommen en pipet vijf referentiemonsters op aparte kolommen.
- Terwijl pipetteren de supernatanten, houdt u de tip ruim boven de pellet te pipetteren plantaardige materialen te voorkomen. Merk op dat wanneer gedroogde monsters worden gebruikt, zal de supernatant volume minder dan 1,0 ml.
- Voeg 1 ml 70% MeOH om de resterende pellets in de monsterbuizen en vortex de buizen voordat ze in een ultrasoon bad gedurende 15 min. Centrifugeer de buizen weer, zoals in stap 4,4 en voeg het Supernafen aan de respectieve kolommen; als gevolg van de eigenschappen van het kolommateriaal, wordt de negatief geladen sulfaatgroep van de glucosinolaten specifiek op de kolom.
- Was de kolommen met de extracten in drie opeenvolgende stappen.
- Pipetteer 2 x 1 ml 70% MeOH op elke kolom. Wacht tot de kolom droog komt te staan voordat u de volgende 1 ml; Dit zal meer apolaire verbindingen uit de extracten (bijvoorbeeld chlorofyl) verwijderen.
- Spoelen van de MeOH door het toevoegen van 1 ml ultrapuur water om elke kolom.
- Pipetteer 2 x 1 ml 20 mM NaOAc buffer aan elke kolom de optimale omstandigheden voor de reactie sulfatase maken.
- Neem het rek met de kolommen van de opvangbak en droog de voeten van het rek met een tissue. Plaats het rooster op het blok met flesjes en gelabeld buizen. Zorg ervoor dat elke tip kolom in de overeenkomstige, label, 2-mL buis (zie figuur 1).
- Voeg 20 ul van sulfatase Solutiop de kolommen. Waarborgen dat de sulfatase het oppervlak van het kolommateriaal bereikt. Pipetteer 50 ul van NaOAc buffer op elke kolom te spoelen naar beneden de sulfatase. Bedek de kolommen met aluminiumfolie en laat een nacht staan.
Opmerking: Door de activiteiten van de sulfatase, de sulfaatgroep wordt verwijderd, het vrijgeven van de desulfoglucosinolates van de kolom zodat ze elueren met water. Voor een gedetailleerde beschrijving, zie Crocoll et al. 19. - De volgende dag, elueren de desulfoglucosinolates pipetteren 2 x 0,75 ml ultrazuiver water op elke kolom. Wanneer alle kolommen droog hebt uitgevoerd, til de kolom rack en verwijder deze uit de reactie buizen.
- Cap de buizen (zorg ervoor dat er gaten in de caps) en vries ze in vloeibare stikstof of in een -80 ° C vriezer voor 30 min. Vriesdrogen de monsters gedurende 12-24 uur (afhankelijk van het aantal monsters en de capaciteit van de vriesdroger) om al het water te verwijderen.
<li> Na vriesdrogen opnieuw los het residu in een juiste volume (gewoonlijk 1,0 ml) ultrazuiver water. Breng de monsters en vijf sinigrin verwijzingen gelabelde HPLC flesjes. Houd de monsters in de koelkast (4 ° C) tot twee weken of een vriezer (-20 ° C) gedurende een jaar voor deze analyse met HPLC. - Laat de glazen zuilen te drogen onder de motorkap 's nachts en gooi ze als het droog. Herstellen van de metalen ballen uit de steekproef buizen gebruikt in stap 4.5 voor hergebruik en zet de buizen in de afvalverwijdering bin.
5. HPLC metingen van de afgezogen Samples
- Scheid de glucosinolaten op een omgekeerde fase C 18 kolom (4,6 x 150 mm, 3 urn, 300 A) met een acetonitril-water gradiënt (zie tabel 1) en een stroomsnelheid van 0,75 ml / min en een kolomtemperatuur van 40 ° C . Voer detectie en kwantificatie bij 229 nm.
- Meet de sinigrin referenties op dezelfde kolom, maar met een aangepaste gradiëntmethode om het gebruik van oplosmiddelen te verminderen (zie tabel 2). Begin met het injecteren van de vijf sinigrine gevonden, te beginnen met de referentie met de laagste concentratie. Injecteer daarna de monsters, zoals methanol injectie (blanco) na elk tiende monster op de kolom te reinigen en de overdracht van pieken voorkomen.
| Tijd [min] | Flow [ml / min] | % Water | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 35 | 0.750 | 65 | 35 |
| 40 | 0.750 | 98 | 2 |
| Column temperatuur 40 ° C. | |||
Tabel 1: acetonitril-water gradiënt voor glucosinolaat scheiding en analysis op omgekeerde-fase HPLC.
| Tijd [min] | Flow [ml / min] | % Water | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 10 | 0.750 | 89.3 | 10.7 |
| 11 | 0.750 | 98 | 2 |
| Column temperatuur 40 ° C. | |||
Tabel 2: Verkorte acetonitril-water gradiënt voor het kwantificeren van de vijf sinigrine referenties gebruikt voor de kwantificering van glucosinolaten.
6. glucosinolaat Identificatie en kwantificering
- Identificatie
- Vergelijk de UV spectra en retentietijden van de pieken in de monsters met handel verkrijgbarestaat, pure glucosinolaat gevonden. Zie figuur 2 voor voorbeelden van UV-spectra van de verschillende klassen glucosinolaat.
- Identificeer onbekende glucosinolaten met referentienormen of LC-MS 18, 19, indien mogelijk.
- Identificeer onbekende glucosinolaten met kernmagnetische resonantie (NMR), indien mogelijk.
- Vergelijk de UV spectra en retentietijd pieken met die in figuur 2 en tabel 3, databases of literatuur gevonden.
Figuur 2. UV-spectra van de meest voorkomende glucosinolaat klassen. UV absorptiespectra (200-350 nm) van zes desulfoglucosinolates (GSL), gebaseerd op oplossingen van commercieel verkrijgbare referentieverbindingen geëxtraheerd zoals hier beschreven, die de meest voorkomende structurele klassen. De gemeenschappelijke naam, structural naam (tussen haakjes), en structurele klasse ziet. (A) sinigrin (2-propenyl GSL) alkenyl; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinyl; (D) glucobrassicine (indol-3-ylmethyl GSL) indool; (E) gluconasturtiine (2-fenylethyl GSL), aromatische; (F) sinalbin (4-hydroxybenzyl GSL), aromatisch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- kwantificatie
- Integratie van het oppervlak onder de pieken van de vijf sinigrin referenties en de monsters.
- Bereken een kalibratie-curve van de vijf gemeten sinigrin referenties op basis van de integrale gebiedsontwikkeling. Gebruik de vergelijking van de regressielijn (zie vergelijking 1) met de geïnterpoleerde hoeveelheid glucosinolaten (zie Vergelijking 2) te berekenen.
- Om de concentratie van de verschillende glucosinolaten vermenigvuldigt de geïnterpoleerde hoeveelheid (x) Door de responsfactor (M) voor detectie bij 229 nm van EG (1990) 16, Buchner (1987) 15, en Brown et al. (1993) 17; de consensus responsfactoren van de meest gedetecteerde desulphoglucosinolates worden in tabel 3.
OPMERKING: responsfactoren kan variëren tussen systemen-dit kan de reden zijn dat er verschillende waarden van de verschillende referenties (zie referenties 15-17). Niettemin zijn de waarden meestal vrij dichtbij en in een vergelijkbare reeks structurele klassen. Na het verdrag, stellen de responsfactor van ongeïdentificeerde glucosinolaten 1, maar onbekende indoolglucosinolaten met een UV-spectrum vergelijkbaar met die van glucobrassicine en andere indoolglucosinolaten (figuur 2), zou het raadzaam zijn gebruik 0,25 als responsfactor te verkrijgeneen realistische schatting van de concentratie (Tabel 3). - Om de uiteindelijke hoeveelheid glucosinolaten (x t) in het monster te berekenen, neemt de verdunningsfactor (D) en de massa van het monster (w) gebruikt bij de analyse in aanmerking (zie vergelijking 3).
(1) 
(2) 
(3)
y = Peak area
m = helling van de referentie-5-punts regressiecurve
c = de intercept van de regressielijn met de y-as
x = hoeveelheid glucosinolaten in het extract
x t = concentratie van glucosinolaten in de plant monster
D = verdunningsfactor
M = responsfactor voor detectie bij 229 nm van Buchner (1987) en Brown et al. (1993)
m = massa van het monster gebruikt voor de extractie
(1) 
(2) 
(3) Representative Results
Deze werkwijze maakt de detectie en scheiding van desulfoglucosinolates vaak gevonden in alle structurele klassen (figuur 3). De schadelijke 2-hydroxyglucosinolate progoitrin komt relatief vroeg in het chromatogram en wordt duidelijk gescheiden van de gunstige glucosinolaat glucoraphanin, de enige methylsulfinylglucosinolate in deze steekproef. Sinigrine, gluconapin en glucobrassicanapin vormen een eluotrope reeks van glucosinolaten alkenyl met toenemende zijketen lengten (C3, C4 en C5, respectievelijk). Een soortgelijke logische serie is toegankelijk voor de twee methylthioalkenyl glucosinolaten, glucoiberverin (C3) en glucoerucin (C4). De toppen van de drie indoolglucosinolaten, glucobrassicine en zijn derivaten 4-hydroxy-1 en methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), ook duidelijk gescheiden. Opgemerkt wordt dat de pieken van neoglucobrassicin en glucoerucin, alsmede gluconasturtiine, enige aromatische glucosinolate in dit voorbeeld, bijzonder hoog in deze Brassica extract door toevoeging van wortelextracten de mix 9.
Figuur 3: Chromatogram van een glucosinolaat extract. Detail (1-32 min) van een HPLC chromatogram resulterend uit de analyse van gecombineerde wortel en spruit monsters van Brassica nigra, B. rapa en B. oleracea. De piek labels geven de retentietijd en de afkortingen voor geïdentificeerde desulfoglucosinolates (GSL). PRO = progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrine (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicine (indol-3-ylmethyl GSL); NAS = gluconasturtiine (2-fenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Langere keten methylsulfinyl glucosinolaten, die gewoonlijk worden aangetroffen in de modelplant Arabidopsis, tonen ook een eluotrope reeks, gezien in een wortelextract van Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) en glucoarabin (C9) op regelmatige afstanden op het chromatogram (figuur 4). Samen met de UV spectra van de pieken, kunnen dergelijke eluotropic logische reeksen worden gebruikt om te classificeren, en voorlopig identificeren onbekende glucosinolaten.
Figuur 4: Chromatogram (frame 9-30 min) Van de desulfoglucosinolates in een Rorippa austriaca wortel extract. De piek labels geven de retentietijd en de afkortingen voor geïdentificeerde desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicine (indol-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gemeenschappelijke naam | Side ketenstructuur | Rt (min) * | 229 nm | referentie# |
| aliphatic glucosinolaten | ||||
| Glucocapparin | methyl- | 3.5 | 1 | Bruin |
| sinigrine | 2-propenyl | 5.5 | 1 | Brown, EC |
| Gluconapin | 3-butenyl | 9.5 | 1.11 | EC |
| Glucobrassicanapin | 4-pentenyl | 13.5 | 1.15 | EC |
| Glucoiberverin | 3-methylthiopropyl | 10.9 | 0.8 | Bruin |
| Glucoerucin | 4-methylthiobutyl | 14.0 | 0.9 | Bruin |
| Glucoiberin | 3-methylsulfinylpropylglucosinolaten | 3.7 | 1.2 | Bruin |
| glucoraphanin | 4-methyl- | 4.9 | 0.9 | Bruin |
| Glucoalyssin | 5-methylsulfinylpentyl | 7.6 | 0.9 | Bruin |
| Glucohesperin | 6-methylsulfinylhexyl | 10.5 | 1 | Bruin |
| Glucosiberin | 7-methylsulfinylheptyl | 13.5 | 1 | Bruin |
| Glucohirsutin | 8-methylsulfinyloctyl | 16.8 | 1.1 | Bruin |
| Glucoarabin | 9-methylsulfinylnonyl | 20.5 | 1 | |
| Glucocheirolin | 3-methylsulfonylpropyl | 4.2 | 0.9 | Bruin |
| Progoitrin | 2 (R) -OH-3-butenyl | 4.5 | 1.09 | Buchner, EC |
| Gluconapoleiferin | 2-OH-5-pentenyl | 8.3 | 1 | EC |
| indoolglucosinolaten | ||||
| 4-hydroxyglucobrassicin | 4-hydroxyindol-3-ylmethyl | 11.2 | 0.28 | Buchner, EC |
| glucobrassicine | indol-3-ylmethyl | 15.3 | 0.29 | Buchner, EC |
| 4-Methoxyglucobrassicin | 4-methoxyindol-3-ylmethyl | 18.2 | 0.25 | Buchner, EC |
| Neoglucobrassicin | 1-methoxyindol-3-ylmethyl | 22.5 | 0.2 | Buchner, EC |
| aromatische glucosinolaten | ||||
| Sinalbin | 4-hydroxybenzyl | 8.1 | 0.5 | Buchner |
| Glucosibarin | 2 (R) -OH-2-fenylethyl | 12.1 | zie volgende | |
| glucobarbarine | 2 (S) -OH-2-fenylethyl | 12.7 | 0.95 | Buchner |
| Glucotropaeolin | benzyl | 13.8 | 0.95 | Buchner, EC |
| gluconasturtiine | 2-fenylethyl | 18.0 | 0.95 | Buchner, EC |
| onbekend - alifatische / aromatische zoals UV-spectrum | 1 | EC | ||
| onbekend - indool zoals spectrum | 0.25 | EC | ||
| * Geschatte retentietijd (Rt) afgerond op de dichtstbijzijnde 0,1 min (± 0,3 min, afhankelijk van de kolom, eluent kwaliteit). Retentietijden worden bepaald op ThermoFisher / Dionex Ultimate HPLC platforms uitgerust met een kolom C 18 (150 x 4,6 mm, 3 micrometer deeltjesgrootte) plus C 18 Tabel 1. | ||||
| # Referenties voor respons factoren: Buchner, R. in glucosinolaten in koolzaad (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Variatie van glucosinolaten accumulatie tussen de verschillende organen en ontwikkelingsstadia van Arabidopsis thaliana. Fytochemie. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00.549-6, (2003); EC. Oliehoudende zaden - bepaling van glucosinolaten High Performance Liquid Chromatography. Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen. L 170/28. Bijlage VIII 03.07.27-34 (1990). | ||||
Tabel 3: Reactie factoren van de meest voorkomende desulfo-glucosinolaten in plantenextracten en hun verwachte retentietijden op C 18 kolommen. Elutiemiddelen, gradient, kolomtemperatuur en stroomsnelheid zoals in tabel 1.
Discussion
De grootste voordelen van deze gevestigde en algemeen toegepaste methode is dat het robuust, vrij eenvoudig en relatief lage kosten per monster. De meeste van de voor de extractie en analyseapparatuur moet beschikbaar zijn in een standaard laboratorium of kunnen zelfgebouwde zijn, met uitzondering van de HPLC-PDA. Een ander voordeel is dat desulfoglucosinolates opgelost in water zijn chemisch zeer stabiel bij bewaring koel en luchtdicht (HPLC) flesjes, zodat de extracten kan gemakkelijk worden geleverd voor HPLC analyse elders. In tegenstelling tot de LC-MS platforms, die vereisen gespecialiseerde opleiding en uitgebreide hands-on ervaring voor het beheer van de software en het analyseren van de data, HPLC-UV / PDA's kunnen eenvoudig worden uitgevoerd na een korte inwerkperiode. Dit vermindert niet alleen de kosten van de procedure, maar maakt deze methode ook beter toegankelijk zijn voor een breed scala van wetenschappers, waaronder studenten.
In het algemeen, als de bovenbeschreven procedures worden gevolgd carefully, moet weinig problemen voordoen. In het algemeen worden de glucosinolaten pieken goed gescheiden in het chromatogram. Indien dit niet het geval is, kan het gradiëntprogramma worden aangepast door het verlagen van de snelheid van toename van acetonitril in het eluent. Als alternatief, de bouw van een nieuwe pre-kolom (200-500 injecties) of kolom (1500 -2000 injectie) kan het probleem op te lossen. Af en toe kan chromatogrammen van afzonderlijke monsters in een batch zeer kleine of geen pieken vertonen. Dit is meestal het gevolg van pipetteren fouten bij het toevoegen van de sulfatase (bijvoorbeeld een kolom is overgeslagen of sulfatase was niet goed naar beneden in de kolom gewassen). Als alternatief kan het glucosinolaat concentratie in het experimentele materiaal lager zijn dan verwacht en te weinig materiaal worden geëxtraheerd. Indien dit laatste het geval is kan het injectievolume worden verhoogd tot 100 pl, of een exacte hoeveelheid (bijvoorbeeld 800 ui) van het extract kan worden geconcentreerd. Het laatste kan worden bereikt door vriesdrogening het extract, oplossen van het residu in een kleiner volume (bijvoorbeeld 100 ui) water en reinjecting met dezelfde referentiecurve. In de berekeningen voor de oorspronkelijke concentratie van het extract, moet het aantal worden vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. Als dit het probleem niet oplost, moet het materiaal opnieuw worden gewonnen met behulp van meer uitgangsmateriaal. Wanneer dit groter dan 100 mg, moet het volume van de extractiemiddelen en de grootte van de buizen verhoudingsgewijs aangepast aan de extractie-efficiëntie te handhaven.
Een bijkomend voordeel is dat deze methode is goed gevalideerd. Dit is omdat het is beschreven als standaardmethode voor de kwantificering van glucosinolaten in raapzaad, waarvan de procedures en de nauwkeurigheid in verschillende laboratoria 16 bevestigd. Bovendien, de genetische achtergrond, biosynthese en biologische functies van glucosinolaten onder zware onderzoeksinspanningen, in de model plantensoorten Arabidopsis thaliana onder andere 4, 6, 12. Daarom zijn veel respons factoren voor de exacte kwantificering van desulfoglucosinolates in relatie tot sinigrin goed gedefinieerd en openbaar 15,17. Hoewel LS-MS-gebaseerde protocollen meer high-throughput, gevoeliger en kunnen (voorlopig) bepalen glucosinolaten waarvoor geen normen beschikbaar 18, 19, 20, het gebrek aan universele responsfactoren voor LC-MS beperkt de exacte kwantificering van glucosinolaten concentraties 18. Bovendien zijn deze werkwijzen gewoonlijk bevatten geen vriesdroogstap, en de hoeveelheid water in het verse plantenmateriaal vermist in de berekening, waardoor nauwkeurige kwantificering moeilijk. Tenslotte, omdat onze extractiemethode behelst een kolom gebaseerdezuivering en concentratiestap kan het ook worden toegepast op "vuile" monsters met lage concentraties glucosinolaten, zoals bodems 21.
Vergeleken met LC-MS-gebaseerde methoden die gewoonlijk extraheren vers bevroren materialen, gebruikt 96-well platen voor extractie en bevatten geen sulfatase stap 18, 19, onze methode is relatief tijdrovend en arbeids- intensief. Met de kolom racks beschreven in dit document, kan een enkele persoon onttrekken ongeveer 100-150 monsters per dag. Elutie (volgende dag), vriesdrogen ( 's nachts), en opnieuw oplossen kan plaatsvinden binnen de volgende twee dagen. Met een geautomatiseerde HPLC-injector, een run en verevening tijd van 40-45 min per injectie, en er geen onvoorziene gebeurtenissen, zou het 3-4 dagen duren om de gegevens te verwerven voor deze sample set. Wanneer de HPLC-software maakt het mogelijk automatische kwantificering op basis van de sinigrine curve, een handmatige controle van de chromatogrammen en peak opdrachten 100 monsters mag alleen nog 1 of 2 uur voordat de gegevens kunnen worden gebruikt voor statistische analyse.
Ondanks de toenemende beschikbaarheid van glucosinolaten normen, maar een kleine fractie van de meer dan 130 kandidaten kan nog worden commercieel gekocht. Echter, met enkele referenties voor elk van de biosynthetische klassen; toegang tot literatuur databases met vermelding van de verbindingen eerder gevonden in de plantensoort (bv Fahey et al. 22); basiskennis van chromatografische principes, zoals de logica van eluotrope reeks (bijvoorbeeld voor steeds meer Cs op de zijketen alifatische verbindingen, figuren 3 en 4); en de validatie van enkele samples op LC-MS 19 of geïsoleerde glucosinolaten op NMR 23, kan men gemakkelijk deze beperking te overwinnen. De meeste protocollen voor glucosinolaat analyses gebruiken interne referentie curves(Dat wil zeggen, een bepaalde concentratie voor de winning van sinigrine of sinalbin aan het extractieoplosmiddel 16, 17, 19). In principe, interne referentie curves zijn meer geschikt voor het corrigeren van individuele monster verwerking fouten en dus theoretisch leveren een hogere precisie. Ondanks dit voordeel, we liever vijfpuntenvoorstel externe referentiecurve gebruiken, zoals we vaak analyseren verschillende wilde soorten, waarvan sommige bevatten veel sinigrine (bijvoorbeeld Brassica nigra 24) of sinalbin (bijvoorbeeld Sinapis alba 25), de twee glucosinolaat referenties waarvoor responsfactoren beschikbaar zijn. Bovendien, het toevoegen van interne standaarden aan elk monster verhoogt de kosten van de analyses, zoals hoogwaardige glucosinolaat referentienormen zijn meestal vrij duur.
Concluderend, ondanks de tijdrovende stappen, dit protocolbiedt een eenvoudige en toegankelijke methode te extraheren en kwantificeren van glucosinolaten in planten monsters. Het is echter belangrijk om te overwegen dat de glucosinolaat niveaus zelf louter de mogelijke biologische activiteit, gezien de noodzaak om te reageren met myrosinase en variatie in de reactieproducten kunnen voortvloeien uit een glucosinolaat 11. Validatie assays worden uitgevoerd om de biologische relevantie bevestigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20864.320 | |
| Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
| HCl | VWR | 1.09057.1000 | |
| Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
| (−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
| Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
| Ethanol | VWR | 20816.298 | |
| Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
| Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
| Glass/wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
| 2 mL reaction tubes | VWR | 211-2120 | |
| Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
| Rotilabo-sealing clips | Carl Roth | N217.1 | |
| Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
| Acetonitril super gradient grade | VWR | 83639.320 | |
| Water bath | VWR | 462-5112 | |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
| PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
| Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
| Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
| HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
| Flask 1,000 mL | VWR | 215-1595 | |
| Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
References
- Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
- Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
- Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
- Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
- Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
- Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
- van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
- Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
- van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
- Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
- Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
- Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57 (2009).
- Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).
- Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
- Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
- Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
- Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
- Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
- Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
- Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
- Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
- de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).
- van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
- Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).
