Introduction
Det er anslått at plantene produserer mer enn 200 000 forskjellige typer av kjemiske forbindelser 1. Bare et mindretall av disse sammensatte synes å spille en rolle i plantenes primær stoffskiftet, noe som brensel Veksten og reproduksjon; de fleste er såkalte sekundære metabolitter. Til tross for navnet, sekundære metabolitter er ofte avgjørende for anlegget overlevelse og reproduksjon, som de tjener til å tiltrekke pollinatorer, eller å forsvare anlegget mot patogener og planteetere 1.
Glukosinolater er en svært uensartet klasse av sekundære metabolitter som har blitt studert i over 150 år 2. Hittil har mer enn 130 strukturelt forskjellige glukosinolater blitt identifisert tre. Grovt sett kan glukosinolater deles i forskjellige klasser basert på aminosyren som de er syntetisert. Indol glukosinolater, for eksempel syntetiseres fra aminosyrentryptofan, mens fenylalanin gir basen skjelettet for syntese av aromatiske glukosinolater 4. Innenfor klasser, er det en høy grad av strukturell diversitet, som er forårsaket av sekvensielle kjedeforlengelsestrinn i den biosyntetiske reaksjonsveier, for eksempel i klassen av alifatiske glukosinolater, eller ved sidekjedemodifiseringer (for eksempel, hydroksylering) 4, 5. En glucosinolate plantearter kan inneholde opp til 37 ulike glukosinolater som tilhører ulike strukturelle klasser 6. Selv om plantearter har typiske glucosinolate-profiler, er intraspesifikk variasjon for de typer glukosinolater ofte funnet blant individer og bestander 6, 7. Intakte glukosinolater er lagret i vakuoler av planteceller og kan bli funnet i noen aboveground eller belowground organ 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Ved cellen ruptur (for eksempel ved herbivory), er glukosinolater løslatt og er blandet med enzymet myrosinase, innstilling av en sennep olje bombe 10. På grunn av aktiviteten av myrosinase, og avhengig av strukturen av den glucosinolate, reaksjonsbetingelsene, og nærværet av modifiserende enzymer, ulike bitter, toksiske eller skadelige forbindelser dannes, så som nitriler og (iso) tiocyanater 11. Reaksjonsproduktene har høy biologisk aktivitet; for eksempel, tjener de som repellents av generainsekt planteetere 12. Arvbarheten og biosyntetiske veier av glukosinolater er godt undersøkt, hovedsakelig på grunn av deres betydning for herbivore og patogen motstand, deres verdi som smakskomponenter i mustards og kål, og deres negative (progoitrin) og positive (glucoraphanin) effekter på menneskers helse 5, 13, 14.
På grunn av den store interessen i glukosinolater som biologisk aktive forbindelser, utvinning og påvisningsmetoder basert på reversert fase høytrykks-væskekromatografi (HPLC) utstyrt med ultrafiolett (UV) eller fotodiode array (PDA) detektorer har blitt brukt siden 1980-tallet 15 . Basert på denne metoden, De europeiske fellesskap utstedt en standard protokoll som ble testet og validert i flere laboratorier for analyse av glukosinolater i oljefrø (Brassica napus, rybs, raps 16). Andre lagt til denne metoden (for eksempel ved å bestemme flere responsfaktorer for glukosinolater som ikke finnes i raps) 17. Til tross for den økende tilgjengeligheten av væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) plattformer og high-throughput protokoller for glucosinolate analyse 18
Protocol
1. Utarbeidelse av Solutions Trengs for glucosinolate Extraction
- Fremstille 500 ml av 70% metanol (MeOH) i vann (ultrarent) i en glassflaske. For 100 prøver og 5 standarder, 420 ml av 70% MeOH er nødvendig.
- Fremstille 20 mM natriumacetat (NaOAc) (pH = 5,5) ved tilsetning av 0,82 g NaOAc og 1,36 g NaOAc x 3 H 2 O i 500 ml vann; justere pH med hydrogenklorid (HCl). Oppbevar NaOAc i kjøleskapet. For 100 prøver og standarder, 5 370 ml av 20 mM NaOAc (pH = 5,5) i vann er nødvendig.
- For å fremstille kolonnematerialet, bland 10 g kryssbundet dekstran-gel (type G-25) med 125 ml ultrarent vann. Lagre den resulterende blanding i et kjøleskap (4 ° C).
- Tilberedning av sulfatase løsning
- Oppløs 10.000 enheter av aryl- sulfatase (type H-1 fra Helix pomatia) i 30 ml ultrarent vann og tilsett 30 ml av absolutt etanol (EtOH). Bland løsningen brønnen og overføre den til en 250-ml CENtrifuge tube eller flere mindre rør, avhengig av tilgjengelighet.
- Sentrifuger blandingen ved 2650 xg i 20 minutter ved romtemperatur (RT). Overfør supernatanten (e) til et begerglass; legge til 90 ml EtOH og bland det. Sentrifuger blandingen i en eller flere sentrifugerør ved 1030 xg i 15 min ved RT.
- Kast supernatantene. Løs opp og kombineres for pelletene i en total av 25 ml ultrarent vann. Vortex godt, dispensere i 1-ml rør, og i fryser ved -20 ° C; de vil holde i minst ett år.
- Fremstilling av referanseløsningen sinigrin
- Vei inn rundt 9 mg sinigrin monohydrat med en-mikrogram nøyaktighet (f.eks 8,769 mg). Overføre den til en 10 ml målekolbe og oppløse sinigrin monohydrat i 10,0 ml ultrarent vann.
- Beregn molariteten av stamløsningen og forberede fem sinigrin referanser mellom 50-750 mikrometer ved å fortynne av stamløsningen. For en detaljert eksempel se Supplerende File S1 .
- Tilsett de ulike sinigrin referanser i 1,5 ml reaksjonsrørene og fryse dem ved 20 ° C. Ta med en serie på fem sinigrin referanser i hvert utvinning batch. Bruk alltid riktig molaritet verdier for tiden brukes sinigrin referanser ved beregning av konsentrasjoner.
2. Utarbeidelse av Extraction Setup
- Forbered en kolonne rack for de Pasteur pipette kolonner (for utarbeidelse av søyler, se trinn 3.1). Merk stativet eller kolonnene for å holde oversikt over prøvenumrene (se figur 1).
- Fremstille en blokk som holder det samme antall av merkede 2 ml mikrosentrifugerør (se trinn 3.3 og figur 1)
5 / 55425fig1.jpg "/>
Figur 1: Rack for glucosinolate utvinning. Sett forfra (venstre) og sett ovenfra (til høyre) i en selvlaget kolonne rack og blokk for glucosinolate utvinning. Høyde: 100 mm, avstanden mellom hullene forskjøvet (til å holde Pasteur pipette kolonner): 30 mm (x-aksen) x 15 mm (y-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Utarbeidelse av kolonner og Mikrosentrifugerør
- Forbered en kolonne per prøve og fem ekstra kolonner for de fem sinigrin referanseprøver.
- I hvert glass pipette, plassere et stykke glass ull ca 1 cm x 1 cm. Bruk en av tre eller glass pinne for å presse glassull ned til det punktet hvor pipetten smalner. Den glassull skal hindre kolonne materiale fra å gå ut, men ikke bruk for mye, da det vil redusere eluering av kolonnene. Bruk hansker whno arbeider med glassull.
- Plasser kolonner på kolonne stativet den (se figur 1). Plasser kolonne rack i en lab brett (avfallsbeholderen) å fange utvasking som brukes til de påfølgende kolonne vasker.
- Kutt de første 5 mm fra spissen av en plast-1 ml pipette tupp og pipette 0,5 ml av den fremstilte kolonne materiale (G-25 gel i vann, se trinn 1.3) i hver kolonne. Rist flasken inneholder kolonnematerialet godt før pipettering. Kast lekker kolonner (G-25 materiale kjører ut gjennom glassull lag) og erstatte med nye.
- Etter pipettering av kolonnematerialet i kolonnene, tilsett 1 ml ultrarent vann for å skylle ned materialet.
- Forbered en 2-mL reaksjonsrøret per prøve og fem rør for de fem sinigrin referanseprøver; merke dem. Bruk en dissekere nål for å lage hull i landskamper for senere frysetørking og plassere de preparerte rør i røret blokken i nøyaktig samme mønster somkolonner (trinn 2.2, se figur 1).
4. Utvinning av glukosinolater
- Veie fryse-tørket og finmalt plantemateriale (vanligvis 50,0 til 100,0 mg tørrvekt, de endelige glucosinolate konsentrasjonene i ekstraktet bør være i området fra referansekurven) til nærmeste 0,1 mg i 2 ml-merket, rund -bottom reaksjonsrørene. Legg to små metallkuler (3 mm i diameter) som koker hemmende midler til hvert rør.
MERK: Protokollen kan også brukes på friske, flash-frosset materiale, som er grunnen under flytende nitrogen og holdt frosset inntil utvinning. Øke mengden av materiale veiet for ekstraksjon og prosentandelen av MeOH i ekstraksjonsvæsken til 85% for å kompensere for fortynning med vann i materialet 19. - Pipetter 1 ml 70% MeOH i hvert rør og vortex kort. Lukk rørene og forsegle dem med sikkerhets caps før du legger dem så raskt som mulig inn i en varm water bath (90-92 ° C) i et par minutter (~ 5 min), inntil 70% MeOH bare koker. Forsiktig: Bruk vernebriller under dette trinnet!
- Plasser prøverørene i et ultralydbad i 15 min. I mellomtiden tar sulfatase, og de fem sinigrin referanseprøvene ut av fryseren for å tine dem ved RT.
- Etter ultra-sonikering, sentrifuger prøverørene ved 2700 xg i en bord- sentrifuge i 10 minutter ved romtemperatur; en pellet bør danne i hvert rør. Legg supernatantene til de merkede kolonner og pipetter de fem referanseprøver på separate kolonner.
- Mens pipettering supernatantene, holde spissen godt over pelleten å unngå pipettering plantematerialer. Legg merke til at når det tørkede prøvene blir brukt, vil den overliggende volum være mindre enn 1,0 ml.
- Tilsett 1 ml 70% MeOH til de resterende pellets i prøverør og vortex rørene før du legger dem i et ultralydbad i 15 min. Sentrifuger rørene igjen, som i trinn 4.4, og tilsett supernabyggere til de respektive kolonner; på grunn av egenskapene til kolonnematerialet, vil de negativt ladede sulfatgruppen av glukosinolater være spesielt holdes tilbake på kolonnen.
- Vask kolonnene med ekstraktene i tre trinn etter hverandre.
- Pipetter 2 x 1 ml 70% MeOH på hver kolonne. Vent til kolonne for å gå tørr før du legger de neste 1 ml; Dette vil fjerne flere polare forbindelser fra ekstrakter (f.eks klorofyll).
- Skylle ut MeOH ved tilsetning av 1 ml ultrarent vann til hver kolonne.
- Pipetter 2 x 1 ml av 20 mM NaOAc-buffer til hver kolonne for å skape de optimale betingelser for sulfatase reaksjonen.
- Ta rack med kolonnene ut av avfallsbeholderen og tørke beina på stativet med en vev. Plasser stativet over blokken med ampuller og merkede rør. Kontroller at kolonnen tips hver er i tilsvarende, merket, 2-ml tube (se figur 1).
- Tilsett 20 mL av sulfatase solutipå kolonnene. Sørge for at sulfatase når overflaten av kolonnematerialet. Pipetter 50 mL av NaOAc buffer på hver kolonne for å skylle ned sulfatase. Dekk kolonner med aluminiumsfolie og la stå over natten.
MERK: På grunn av virksomheten til sulfatase, sulfat gruppen vil bli fjernet, slippe desulfoglucosinolates fra kolonnen slik at de kan elueres med vann. For en detaljert beskrivelse, se Crocoll et al. 19. - Neste dag, eluere desulfoglucosinolates ved å pipettere 2 x 0,75 ml av ultrarent vann på hver kolonne. Når alle kolonner har gått tom, løfte kolonne stativet og ta det ut av reaksjonsrørene.
- Lukk rørene (sørg for at det er hull i caps) og fryse dem i flytende nitrogen eller i en -80 ° C fryser i 30 min. Fryse-tørke prøvene i 12-24 timer (avhengig av antallet prøver og kapasiteten til frysetørkeren) for å fjerne alt vann.
<li> Etter frysetørking gjenoppløses resten i et nøyaktig volum (vanligvis 1,0 ml) av ultrarent vann. Overfør prøvene og de fem sinigrin referanser til merket HPLC ampuller. Hold prøvene i kjøleskap (4 ° C) i opptil to uker eller en fryser (-20 ° C) i inntil ett år før analysere dem med HPLC. - La glasset kolonner tørke under panseret over natten og kast dem når den er tørr. Gjenopprette metallkuler fra prøverørene som brukes i trinn 4.5 for gjenbruk og sette rørene i avfallsbøtte.
5. HPLC Målinger utklippede Samples
- Skill glukosinolater på en reversfase C18-kolonne (4,6 x 150 mm, 3 um, 300 Å) med en acetonitril-vann gradient (se tabell 1) og en strømningshastighet på 0,75 ml / min og kolonnetemperaturen til 40 ° C a . Utfør deteksjon og kvantifisering ved 229 nm.
- Mål sinigrin referanser på den samme kolonnen, men med en tilpasset gradientFremgangsmåte for å redusere bruk av løsemidler (se tabell 2). Start med å injisere de fem sinigrin referanser, som begynner med referanse med lavest konsentrasjon. Deretter injiserer prøvene, inkludert en metanolinjeksjon (blank) etter hver tiende prøve for å rense kolonnen og for å hindre overføring av topper.
| [Min] | Flow [ml / min] | % Et vann | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 35 | 0.750 | 65 | 35 |
| 40 | 0.750 | 98 | 2 |
| Kolonnetemperatur 40 ° C. | |||
Tabell 1: Acetonitril-vann-gradient for glucosinolate separering og måling as på reversfase HPLC.
| [Min] | Flow [ml / min] | % Et vann | % B ACN |
| 1 | 0.750 | 98 | 2 |
| 10 | 0.750 | 89,3 | 10.7 |
| 11 | 0.750 | 98 | 2 |
| Kolonnetemperatur 40 ° C. | |||
Tabell 2: Forkortet acetonitril-vann-gradient for kvantifisering av de fem sinigrin referanser som benyttes for kvantifisering av glukosinolater.
6. glucosinolate identifisering og kvantifisering
- Identifikasjon
- Sammenlign UV spektra og oppholdstider på toppene i prøvene med kommersielt nyttestand, ren glucosinolate referanser. Se figur 2 for eksempler på UV-spektrene fra de ulike glucosinolate klasser.
- Identifisere ukjente glukosinolater med referansestandarder eller på LC-MS 18, 19, hvis det er mulig.
- Identifisere ukjente glukosinolater med kjernemagnetisk resonans (NMR), hvis mulig.
- Sammenlign UV spektra og oppholdstider på toppene med de i figur 2 og tabell 3, databaser, eller litteraturreferanser.
Figur 2. UV-spektra av de mest vanlige glucosinolate klasser. UV-absorpsjonsspektra (200-350 nm) på seks desulfoglucosinolates (GSL), basert på løsninger laget av kommersielt tilgjengelige referanseforbindelser ekstrahert som beskrevet her, representerer de mest vanlige strukturelle klasser. Den vanlige navn, structural navn (i parentes), og strukturell klasse er gitt. (A) sinigrin (2-propenyl GSL), alkenyl; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinyl; (D) glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL), indol; (E) gluconasturtiin (2-fenyletyl GSL), aromatisk; (F) sinalbin (4-hydroksybenzyl GSL), aromatiske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- kvantifisering
- Integrer arealet under toppene av de fem sinigrin referanser og prøvene.
- Beregne en kalibreringskurve av de fem målte sinigrin referanser basert på det integrerte området. Bruk ligning av regresjonslinjen (se ligning 1) for å beregne det interpolerte mengden av glukosinolater (se ligning 2).
- For å beregne konsentrasjonen av de forskjellige glukosinolater, multiplisere det interpolerte mengde (x) av en responsfaktor (M) for påvisning ved 229 nm fra EC (1990) 16, Buchner (1987) 15, eller Brown et al. (1993) 17; konsensus responsfaktorene for de mest vanlig detektert desulphoglucosinolates er gitt i tabell 3.
MERK: Respons faktorer kan variere mellom systemer-dette kan være grunnen til at det er forskjellige verdier gitt av ulike referanser (se referanser 15-17). Ikke desto mindre verdiene er for det meste ganske nær og i et lignende område med strukturelle klasser. Etter konvensjonen, sett responsfaktor uidentifiserte glukosinolater til en, men for ukjente indol glukosinolater med en UV-spekteret lik som glucobrassicin og andre indol glukosinolater (figur 2), ville det være tilrådelig å bruke 0,25 som en responsfaktor for å oppnåen realistisk estimat av den konsentrasjon (tabell 3). - For å beregne den endelige mengden av glukosinolater (x t) i prøven, ta fortynningsfaktoren (D) og massen av prøven (w) som benyttes for analysen i betraktning (se ligning 3).
(1) 
(2) 
(3)
y = Peak område
m = helling av referanse 5-punkts regresjonskurve
c = skjæringspunktet på regresjonslinjen med y-aksen
x = mengde av glucosinolates i ekstraktet
x t = konsentrasjon av glucosinolates i anlegget prøven
D = fortynningsfaktoren
M = responsfaktor for deteksjon ved 229 nm fra Buchner (1987) eller Brown et al. (1993)
w = massen av prøven som brukes for ekstraksjon
(1) 
(2) 
(3) Representative Results
Denne metoden gjør det mulig for påvisning og separering av vanligvis finnes desulfoglucosinolates i alle strukturelle klasser (figur 3). Den ødeleggende 2-hydroxyglucosinolate progoitrin kommer relativt tidlig i kromatogrammet og er klart adskilt fra den reelle glucosinolate glucoraphanin, den eneste methylsulfinylglucosinolate i dette utvalget. Sinigrin, gluconapin, og glucobrassicanapin danner en eluotropic serie alkenyl glukosinolater med økende sidekjedelengder (C3, C4, og C5, henholdsvis). En tilsvarende logisk serien er synlig for de to methylthioalkenyl glukosinolater, glucoiberverin (C3) og glucoerucin (C4). Toppene i tre indol glukosinolater, glucobrassicin og dets derivater 4-hydroxy og en-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), er også klart adskilt. Det skal bemerkes at toppene av neoglucobrassicin og glucoerucin, samt gluconasturtiin, det eneste aromatiske glukosinolate i denne prøven, er spesielt høy i denne Brassica ekstrakt på grunn av tilsetningen av roten ekstrakter til blandingen 9.
Figur 3: kromatogram av en glucosinolate ekstrakt. Detaljer (1-32 min) av et HPLC-kromatogram som resulterer fra analyse av kombinerte rot og skyteprøver fra Brassica nigra, B. rapa og B. oleracea. Topp etikettene angir oppholdstid og forkortelsene for identifiserte desulfoglucosinolates (GSL). PRO = progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); Raph = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-metyltiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL); NAS = gluconasturtiin (2-fenyletyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Lengre kjede metylsulfinyl glukosinolater, som vanligvis finnes i modell anlegg Arabidopsis, viser også en eluotropic serien, som sett i en rot ekstrakt av Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), og glucoarabin (C9) vises med jevne mellomrom på kromatogrammet (figur 4). Sammen med UV-spektra av toppene, kan en slik eluotropic logisk serien brukes til å klassifisere, og foreløpig identifisere, ukjente glukosinolater.
Figur 4: kromatogram (frame 9-30 min) Av desulfoglucosinolates i en Rorippa austriaca rot ekstrakt. Topp etikettene angir oppholdstid og forkortelsene for identifiserte desulfoglucosinolates (GSL). HMS = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vanlig navn | Side kjedestruktur | Rt (min) * | 229 nm | henvisning# |
| alifatiskc glukosinolater | ||||
| Glucocapparin | metyl | 3,5 | 1 | brun |
| sinigrin | 2-propenyl | 5.5 | 1 | Brown, EC |
| Gluconapin | 3-butenyl | 9.5 | 1.11 | EC |
| Glucobrassicanapin | 4-pentenyl | 13.5 | 1.15 | EC |
| Glucoiberverin | 3-metyltiopropyl | 10.9 | 0.8 | brun |
| Glucoerucin | 4-methylthiobutyl | 14,0 | 0.9 | brun |
| Glucoiberin | 3-methylsulfinylpropyl | 3.7 | 1.2 | brun |
| glucoraphanin | 4-methylsulfinylbutyl | 4.9 | 0.9 | brun |
| Glucoalyssin | 5-methylsulfinylpentyl | 7.6 | 0.9 | brun |
| Glucohesperin | 6-methylsulfinylhexyl | 10.5 | 1 | brun |
| Glucosiberin | 7-methylsulfinylheptyl | 13.5 | 1 | brun |
| Glucohirsutin | 8-methylsulfinyloctyl | 16.8 | 1.1 | brun |
| Glucoarabin | 9-methylsulfinylnonyl | 20.5 | 1 | |
| Glucocheirolin | 3-methylsulfonylpropyl | 4.2 | 0.9 | brun |
| Progoitrin | 2 (R) -OH-3-butenyl | 4.5 | 1,09 | Buchner, EC |
| Gluconapoleiferin | 2-OH-5-pentenyl | 8.3 | 1 | EC |
| indol glukosinolater | ||||
| 4-hydroxyglucobrassicin | 4-hydroxyindol-3-ylmetyl | 11.2 | 0,28 | Buchner, EC |
| Glucobrassicin | indol-3-ylmetyl | 15.3 | 0,29 | Buchner, EC |
| 4-Methoxyglucobrassicin | 4-methoxyindol-3-ylmetyl | 18.2 | 0,25 | Buchner, EC |
| Neoglucobrassicin | 1-methoxyindol-3-ylmetyl | 22.5 | 0.2 | Buchner, EC |
| aromatiske glukosinolater | ||||
| Sinalbin | 4-hydroksybenzyl | 8.1 | 0.5 | Buchner |
| Glucosibarin | 2 (R) -OH-2-fenyletyl | 12.1 | se neste | |
| Glucobarbarin | 2 (S) -OH-2-fenyletyl | 12.7 | 0.95 | Buchner |
| Glucotropaeolin | benzyl | 13.8 | 0.95 | Buchner, EC |
| Gluconasturtiin | 2-fenyletyl | 18,0 | 0.95 | Buchner, EC |
| ukjent - alifatiske / aromatiske som UV-spekteret | 1 | EC | ||
| ukjent - indol som spektrum | 0,25 | EC | ||
| * Omtrentlig retensjonstiden (Rt) avrundet til nærmeste 0,1 min (± 0,3 min avhengig av kolonnen, elueringsmiddel kvalitet). Tilbakeholdelsestider er fastsatt på ThermoFisher / Dionex Ultimate HPLC plattformer utstyrt med en C 18 kolonne (150 x 4,6 mm, tre mikrometer partikkelstørrelse) pluss C 18 tabell 1. | ||||
| # Referanser for responsfaktorer: Buchner, R. i glukosinolater i raps (red JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Variasjon av glucosinolate opphopning mellom ulike organer og utviklingsstadier av Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); EF. Olje frø - Bestemmelse av glukosinolater High Performance væskekromatografi. Tidende De europeiske fellesskap. L 170/28. Vedlegg VIII 03.07.27-34 (1990). | ||||
Tabell 3: Svar faktorer av oftest desulfo-glukosinolater i planteekstrakter og deres omtrentlige tilbakeholdelsestider på C 18 kolonner. Utvasking, gradient, kolonnetemperatur, og strømningshastighet som i tabell 1.
Discussion
De største fordelene med denne etablert og mye brukt metode er at det er robust, ganske enkelt, og forholdsvis lave kostnader per prøve. Det meste av utstyret som er nødvendig for ekstraksjon og analyse bør være tilgjengelig i en standard laboratorium eller kan være selv bygget, med unntak av HPLC-PDA. En annen fordel er at desulfoglucosinolates oppløst i vann er kjemisk ganske stabilt når det oppbevares kjølig og i lufttett (HPLC) ampuller, slik ekstraktene kan lett sendes til HPLC-analyse andre steder. I motsetning til LC-MS-plattformer, som krever spesialisert opplæring og omfattende praktisk erfaring for å håndtere programvaren og analysere data, HPLC-UV / PDAer kan lett løpe etter en kort treningsperiode. Dette reduserer ikke bare kostnadene ved inngrepet, men også gjør denne metoden mer tilgjengelig for et bredt spekter av forskere, blant annet studenter.
Vanligvis, når fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor blir fulgt carefully, bør noen problemer oppstår. Generelt er glucosinolate toppene meget godt adskilt i kromatogrammet. Hvis dette ikke er tilfelle, kan den gradientprogram tilpasses ved å redusere økningen av acetonitril i elueringsmiddel. Alternativt, bygge en ny pre-kolonne (200-500 injeksjoner) eller kolonnen (1500 -2000 injeksjoner) kan løse problemet. Av og til kan kromatogrammer av enkeltprøver i en batch viser svært liten eller ingen topper. Dette er vanligvis på grunn av pipettering feil når du legger den sulfatase (for eksempel en kolonne har blitt hoppet over eller sulfatase var ikke ordentlig vasket ned inn i kolonnen). Alternativt kan glucosinolate-konsentrasjonen i de eksperimentelle materialer har vært lavere enn forventet, og for lite materiale ble anvendt for ekstraksjonen. Hvis sistnevnte er tilfelle, kan injeksjonsvolumet økes til 100 ul, eller en nøyaktig alikvot (for eksempel 800 ul) av ekstrakten kan konsentreres. Det sistnevnte kan oppnås ved frysetørring ekstrakten, oppløsning av resten i et mindre volum (for eksempel 100 ul) av vann, og å reinjisere ved hjelp av samme referansekurven. I beregningene for det opprinnelige konsentrering av ekstraktet, bør tallene multipliseres med fortynningsfaktoren. Hvis dette ikke løser problemet, bør materialene hentes ut igjen med mer startmateriale. Dersom dette er mer enn 100 mg, bør volumet av ekstraksjons-løsningsmidler og størrelsen av rørene reguleres proporsjonalt for å opprettholde ekstraksjonseffektiviteten.
En ytterligere fordel er at denne metoden har blitt vel validert. Dette er fordi det er blitt beskrevet som en standard metode for kvantifisering av glukosinolater i raps, for hvilke prosedyrer og nøyaktighet ble bekreftet i flere laboratorier 16. I tillegg er genetisk bakgrunn, biosyntese og biologiske funksjoner av glukosinolater er gjenstand for intens forskning innsats, i model plantearter Arabidopsis thaliana blant annet 4, 6, 12. Derfor er mange responsfaktorer for nøyaktig kvantifisering av desulfoglucosinolates i forhold til sinigrin veldefinert og allment tilgjengelig 15,17. Selv om LS-MS-baserte protokoller er mer high-throughput, mer følsomt, og er i stand til (forsøksvis) identifisere glukosinolater for hvilke ingen standarder er tilgjengelige 18, 19, 20, mangel på universelle responsfaktorer for LC-MS begrenser presis kvantifisering av glucosinolate konsentrasjoner 18. Videre er disse fremgangsmåter vanligvis ikke inkluderer et frysetørketrinn, og mengden av vann i det friske plantematerialet er ikke gjort rede for i beregningene, noe som gjør nøyaktig kvantifisering vanskelig. Til slutt, fordi vår utvinning metoden innebærer en kolonne basertrensing og konsentrasjonstrinn, kan det også bli brukt for å "skitne" prøver med lave konsentrasjoner av glukosinolater, slik som jord 21.
Sammenlignet med LC-MS-baserte metoder som vanligvis trekke fersk frosne materialer, bruker 96-brønners plater for utvinning, og ikke inneholder et sulfatase trinn 18, 19, er vår metode relativt tidkrevende og arbeidskrevende intens. Med kolonne stativer som er beskrevet i denne artikkelen, kan en enkelt person trekke ca 100-150 prøver på en dag. Eluering (neste dag), frysetørking (over natten), og re-oppløsning kan skje i løpet av de neste to dagene. Med en automatisert HPLC injektor, en joggetur og likevekt tid på 40-45 min per injeksjon, og ingen uforutsette hendelser, vil det ta 3-4 dager å skaffe data for denne prøvesett. Når HPLC programvaren tillater automatisk kvantifisering basert på sinigrin kurve, en manuell sjekk av kromatogrammene og peak oppdrag for 100 prøver kan bare ta en annen en eller to timer før dataene kan brukes til statistiske analyser.
Til tross for den økende tilgjengeligheten av glucosinolate standarder, bare en liten brøkdel av de mer enn 130 kandidater kan i dag kommersielt kjøpt. Men med noen referanser for hver av de biosyntetiske klasser; adgang til litteraturdatabaser angivelse av forbindelser som tidligere er funnet i plantearter (f.eks Fahey et al. 22); grunnleggende kjennskap til kromatografiske prinsipper, som logikken eluotropic serien (dvs. for et økende antall Cs på sidekjeden i alifatiske forbindelser, figurene 3 og 4); og validering av enkeltprøver på LC-MS 19 eller isolerte glukosinolater på NMR 23, kan man lett overvinne denne begrensningen. De fleste protokoller for glucosinolate analyserer bruke interne referansekurver(Dvs. en viss konsentrasjon for utvinning av sinigrin eller sinalbin til ekstraksjonsløsningsmidlet 16, 17, 19). Prinsipielt interne referansekurver er mer hensiktsmessig å korrigere for de enkelte prøvebehandlingsfeil og således teoretisk gir høyere presisjon. Til tross for denne fordel foretrekkes det å bruke en fem-punkts ekstern referansekurve, som vi ofte analysere forskjellige ville arter, hvorav noen inneholder høye nivåer av sinigrin (f.eks, Brassica nigra 24) eller sinalbin (f.eks, Sinapis alba 25), den to glucosinolate referanser som responsfaktorer er tilgjengelige. Videre tilsetning av interne standarder for hver prøve øker kostnadene av analysene, som høy grad av glucosinolate referansestandarder er vanligvis ganske dyre.
Som konklusjon, til tross for de tidskrevende trinnene, denne protokollengir en enkel og tilgjengelig metode for å trekke ut og kvantifisere glukosinolater i planteprøver. Imidlertid er det viktig å vurdere at glucosinolate nivåene selv er bare en indikasjon på den potensielle biologiske aktivitet, betraktes som nødvendigheten av å reagere med myrosinase, og variasjonen i reaksjonsproduktene kan oppstå fra en enkelt glucosinolate 11. Validerings analyser må utføres for å bekrefte biologisk relevans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20864.320 | |
| Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
| HCl | VWR | 1.09057.1000 | |
| Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
| (−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
| Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
| Ethanol | VWR | 20816.298 | |
| Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
| Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
| Glass/wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
| 2 mL reaction tubes | VWR | 211-2120 | |
| Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
| Rotilabo-sealing clips | Carl Roth | N217.1 | |
| Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
| Acetonitril super gradient grade | VWR | 83639.320 | |
| Water bath | VWR | 462-5112 | |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
| PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
| Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
| Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
| HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
| Flask 1,000 mL | VWR | 215-1595 | |
| Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
References
- Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
- Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
- Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
- Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
- Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
- Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
- van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
- Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
- van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
- Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
- Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
- Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57 (2009).
- Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).
- Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
- Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
- Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
- Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
- Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
- Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
- Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
- Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
- de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).
- van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
- Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).
