Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Geschat wordt dat planten dan 200.000 verschillende soorten chemische verbindingen 1. Slechts de minderheid van deze verbinding lijkt een primaire rol in het metabolisme van de plant, waarin brandstoffen groei en reproductie; de meerderheid zogenaamde secundaire metabolieten. Ondanks hun naam, secundaire metabolieten zijn vaak van cruciaal belang voor planten overleving en voortplanting, omdat ze dienen om bestuivers aan te trekken of om de plant tegen pathogenen en herbivoren 1 te verdedigen.
Glucosinolaten een diverse klasse van secundaire metabolieten die zijn onderzocht op meer dan 150 jaar 2. Tot op heden zijn meer dan 130 verschillende glucosinolaten structureel geïdentificeerd 3. In grote lijnen kan glucosinolaten worden onderverdeeld in verschillende klassen op basis van het aminozuur waaruit zij gesynthetiseerd. Indoolglucosinolaten bijvoorbeeld worden gesynthetiseerd uit het aminozuurtryptofaan, fenylalanine bepaalt dat het basisskelet voor de synthese van aromatische glucosinolaten 4. De klassen, is er een hoge structurele diversiteit, die teweeg wordt gebracht door opeenvolgende ketenverlenging stappen in de biosynthetische routes, zoals de klasse van alifatische glucosinolaten, of zijketen modificaties (bijvoorbeeld hydroxylering) 4, 5. Eén glucosinolaat plantensoorten kan tot 37 verschillende glucosinolaten die behoren tot verschillende structurele klassen 6 bevatten. Hoewel plantensoorten hebben typisch glucosinolaat profielen, is intraspecifieke variatie voor de typen glucosinolaten vaak gevonden tussen individuen en bevolkingsgroepen 6, 7. Intacte glucosinolaten worden opgeslagen in de vacuole van plantencellen en kunnen worden gevonden in een bovengrondse of ondergrondse orgaan 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Bij cel breuk (bijvoorbeeld door herbivorie), zijn glucosinolaten vrijgegeven en worden gemengd met het enzym myrosinase, verrekening een mosterdolie bom 10. Door de werking van myrosinase, en afhankelijk van de structuur van de glucosinolaten, de reactiecondities en de aanwezigheid van modificerende enzymen worden verschillende scherpe, giftige of schadelijke verbindingen gevormd, zoals nitrillen en (iso) 11 thiocyanaten. De reactieproducten hebben een hoge biologische activiteit; bijvoorbeeld, ze dienen als insectenwerende middelen van generalistische insect herbivoren 12. De erfelijkheid en biosynthetische paden van glucosinolaten zijn goed bestudeerd, vooral als gevolg van hun belang voor herbivoor en resistentie tegen pathogenen, hun waarde als aromacomponenten in mosterd en kool, en hun negatieve (progoitrin) en positieve (glucoraphanin) effecten op de gezondheid van de mens 5, </sup> 13, 14.
Vanwege de grote belangstelling in glucosinolaten als biologisch actieve verbindingen, extractie en detectiemethoden gebaseerd op omgekeerde-fase hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) voorzien van ultraviolet (UV) of fotodiode array (PDA) detector zijn vaak gebruikt sinds de jaren 1980 15 . Op basis van deze methode, de Europese Gemeenschappen gaf een standaardprotocol dat werd getest en gevalideerd in verschillende laboratoria voor het analyseren van glucosinolaten in oliehoudende zaden (Brassica napus, koolzaad, canola 16). Anderen toegevoegd aan deze methode (bijvoorbeeld door het bepalen van extra responsfactoren voor glucosinolaten die niet aanwezig zijn in koolzaad zijn) 17. Ondanks de toenemende beschikbaarheid van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms en high-throughput protocollen voor glucosinolaat analyse 18 <sup>, 19, wordt de oorspronkelijke HPLC-UV / PDA methode nog steeds veel gebruikt door wetenschappers. De belangrijkste redenen hiervoor zijn dat deze methode eenvoudig, kosteneffectief en relatief toegankelijk labs zonder chemisch sterk analytische kennisinfrastructuur. Om deze gemeenschap te dienen, dat we hier detail het protocol voor de winning van glucosinolaten uit plantaardig materiaal en de analyse van hun desulfo-formulieren met HPLC-PDA.
De grootste voordelen van deze gevestigde en algemeen toegepaste methode is dat het robuust, vrij eenvoudig en relatief lage kosten per monster. De meeste van de voor de extractie en analyseapparatuur moet beschikbaar zijn in een standaard laboratorium of kunnen zelfgebouwde zijn, met uitzondering van de HPLC-PDA. Een ander voordeel is dat desulfoglucosinolates opgelost in water zijn chemisch zeer stabiel bij bewaring koel en luchtdicht (HPLC) flesjes, zodat de extracten kan gemakkelijk worden geleverd voor HPLC analyse elders. In tegenstelling tot de LC-MS platforms, die vereisen gespecialiseerde opleiding en uitgebreide hands-on ervaring voor het beheer van de software en het analyseren van de data, HPLC-UV / PDA's kunnen eenvoudig worden uitgevoerd na een korte inwerkperiode. Dit vermindert niet alleen de kosten van de procedure, maar maakt deze methode ook beter toegankelijk zijn voor een breed scala van wetenschappers, waaronder studenten.
In het algemeen, als de bovenbeschreven procedures worden gevolgd carefully, moet weinig problemen voordoen. In het algemeen worden de glucosinolaten pieken goed gescheiden in het chromatogram. Indien dit niet het geval is, kan het gradiëntprogramma worden aangepast door het verlagen van de snelheid van toename van acetonitril in het eluent. Als alternatief, de bouw van een nieuwe pre-kolom (200-500 injecties) of kolom (1500 -2000 injectie) kan het probleem op te lossen. Af en toe kan chromatogrammen van afzonderlijke monsters in een batch zeer kleine of geen pieken vertonen. Dit is meestal het gevolg van pipetteren fouten bij het toevoegen van de sulfatase (bijvoorbeeld een kolom is overgeslagen of sulfatase was niet goed naar beneden in de kolom gewassen). Als alternatief kan het glucosinolaat concentratie in het experimentele materiaal lager zijn dan verwacht en te weinig materiaal worden geëxtraheerd. Indien dit laatste het geval is kan het injectievolume worden verhoogd tot 100 pl, of een exacte hoeveelheid (bijvoorbeeld 800 ui) van het extract kan worden geconcentreerd. Het laatste kan worden bereikt door vriesdrogening het extract, oplossen van het residu in een kleiner volume (bijvoorbeeld 100 ui) water en reinjecting met dezelfde referentiecurve. In de berekeningen voor de oorspronkelijke concentratie van het extract, moet het aantal worden vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. Als dit het probleem niet oplost, moet het materiaal opnieuw worden gewonnen met behulp van meer uitgangsmateriaal. Wanneer dit groter dan 100 mg, moet het volume van de extractiemiddelen en de grootte van de buizen verhoudingsgewijs aangepast aan de extractie-efficiëntie te handhaven.
Een bijkomend voordeel is dat deze methode is goed gevalideerd. Dit is omdat het is beschreven als standaardmethode voor de kwantificering van glucosinolaten in raapzaad, waarvan de procedures en de nauwkeurigheid in verschillende laboratoria 16 bevestigd. Bovendien, de genetische achtergrond, biosynthese en biologische functies van glucosinolaten onder zware onderzoeksinspanningen, in de model plantensoorten Arabidopsis thaliana onder andere 4, 6, 12. Daarom zijn veel respons factoren voor de exacte kwantificering van desulfoglucosinolates in relatie tot sinigrin goed gedefinieerd en openbaar 15,17. Hoewel LS-MS-gebaseerde protocollen meer high-throughput, gevoeliger en kunnen (voorlopig) bepalen glucosinolaten waarvoor geen normen beschikbaar 18, 19, 20, het gebrek aan universele responsfactoren voor LC-MS beperkt de exacte kwantificering van glucosinolaten concentraties 18. Bovendien zijn deze werkwijzen gewoonlijk bevatten geen vriesdroogstap, en de hoeveelheid water in het verse plantenmateriaal vermist in de berekening, waardoor nauwkeurige kwantificering moeilijk. Tenslotte, omdat onze extractiemethode behelst een kolom gebaseerdezuivering en concentratiestap kan het ook worden toegepast op "vuile" monsters met lage concentraties glucosinolaten, zoals bodems 21.
Vergeleken met LC-MS-gebaseerde methoden die gewoonlijk extraheren vers bevroren materialen, gebruikt 96-well platen voor extractie en bevatten geen sulfatase stap 18, 19, onze methode is relatief tijdrovend en arbeids- intensief. Met de kolom racks beschreven in dit document, kan een enkele persoon onttrekken ongeveer 100-150 monsters per dag. Elutie (volgende dag), vriesdrogen ( 's nachts), en opnieuw oplossen kan plaatsvinden binnen de volgende twee dagen. Met een geautomatiseerde HPLC-injector, een run en verevening tijd van 40-45 min per injectie, en er geen onvoorziene gebeurtenissen, zou het 3-4 dagen duren om de gegevens te verwerven voor deze sample set. Wanneer de HPLC-software maakt het mogelijk automatische kwantificering op basis van de sinigrine curve, een handmatige controle van de chromatogrammen en peak opdrachten 100 monsters mag alleen nog 1 of 2 uur voordat de gegevens kunnen worden gebruikt voor statistische analyse.
Ondanks de toenemende beschikbaarheid van glucosinolaten normen, maar een kleine fractie van de meer dan 130 kandidaten kan nog worden commercieel gekocht. Echter, met enkele referenties voor elk van de biosynthetische klassen; toegang tot literatuur databases met vermelding van de verbindingen eerder gevonden in de plantensoort (bv Fahey et al. 22); basiskennis van chromatografische principes, zoals de logica van eluotrope reeks (bijvoorbeeld voor steeds meer Cs op de zijketen alifatische verbindingen, figuren 3 en 4); en de validatie van enkele samples op LC-MS 19 of geïsoleerde glucosinolaten op NMR 23, kan men gemakkelijk deze beperking te overwinnen. De meeste protocollen voor glucosinolaat analyses gebruiken interne referentie curves(Dat wil zeggen, een bepaalde concentratie voor de winning van sinigrine of sinalbin aan het extractieoplosmiddel 16, 17, 19). In principe, interne referentie curves zijn meer geschikt voor het corrigeren van individuele monster verwerking fouten en dus theoretisch leveren een hogere precisie. Ondanks dit voordeel, we liever vijfpuntenvoorstel externe referentiecurve gebruiken, zoals we vaak analyseren verschillende wilde soorten, waarvan sommige bevatten veel sinigrine (bijvoorbeeld Brassica nigra 24) of sinalbin (bijvoorbeeld Sinapis alba 25), de twee glucosinolaat referenties waarvoor responsfactoren beschikbaar zijn. Bovendien, het toevoegen van interne standaarden aan elk monster verhoogt de kosten van de analyses, zoals hoogwaardige glucosinolaat referentienormen zijn meestal vrij duur.
Concluderend, ondanks de tijdrovende stappen, dit protocolbiedt een eenvoudige en toegankelijke methode te extraheren en kwantificeren van glucosinolaten in planten monsters. Het is echter belangrijk om te overwegen dat de glucosinolaat niveaus zelf louter de mogelijke biologische activiteit, gezien de noodzaak om te reageren met myrosinase en variatie in de reactieproducten kunnen voortvloeien uit een glucosinolaat 11. Validatie assays worden uitgevoerd om de biologische relevantie bevestigen.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |