Glucosinolate निष्कर्षण और विश्लेषण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी साथ के लिए एक सरल विधि (एचपीएलसी)
Summary
Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Abstract
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Introduction
यह अनुमान है कि पौधों रासायनिक यौगिकों 1 की 200,000 से अधिक विभिन्न प्रकार का उत्पादन। केवल इन परिसर के अल्पसंख्यक 'पौधों प्राथमिक चयापचय, जो ईंधन के विकास और प्रजनन में एक भूमिका निभा रहा है; बहुमत माध्यमिक चयापचयों तथाकथित रहे हैं। उनके नाम के बावजूद, माध्यमिक चयापचयों अक्सर, संयंत्र अस्तित्व और प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे परागण को आकर्षित करने के लिए या रोगज़नक़ों और शाकाहारी 1 खिलाफ संयंत्र की रक्षा के लिए काम करते हैं।
ग्लूकोसाइनोलेट्स माध्यमिक चयापचयों है कि 150 से अधिक वर्षों के 2 के लिए अध्ययन किया गया है की एक बहुत ही विविध वर्ग के हैं। तिथि करने के लिए, 130 से अधिक संरचनात्मक रूप से अलग ग्लूकोसाइनोलेट्स 3 पहचान की गई है। मोटे तौर पर, ग्लूकोसाइनोलेट्स अमीनो एसिड, जहां से वे संश्लेषित कर रहे हैं के आधार पर अलग-अलग वर्गों में विभाजित किया जा सकता है। इण्डोल ग्लूकोसाइनोलेट्स, उदाहरण के लिए, अमीनो एसिड से संश्लेषित कर रहे हैंनियासिन, जबकि फेनिलएलनिन खुशबूदार ग्लूकोसाइनोलेट्स 4 के संश्लेषण के लिए आधार कंकाल प्रदान करता है। कक्षाओं के भीतर, वहाँ संरचनात्मक विविधता है, जो इस तरह के स्निग्ध ग्लूकोसाइनोलेट्स के वर्ग में के रूप में biosynthetic रास्ते में अनुक्रमिक श्रृंखला बढ़ाव कदम है, के बारे में लाया जाता है, या पक्ष श्रृंखला संशोधनों (जैसे, hydroxylation) 4, 5 से की एक उच्च स्तरीय है। एक glucosinolate पौधों की प्रजातियों अप करने के लिए 37 अलग अलग वर्गों संरचनात्मक 6 से संबंधित ग्लूकोसाइनोलेट्स हो सकती है। हालांकि पौधों की प्रजातियों ठेठ glucosinolate प्रोफाइल है, ग्लूकोसाइनोलेट्स के प्रकार के लिए intraspecific भिन्नता अक्सर व्यक्तियों और आबादी 6, 7 के बीच पाया जाता है। बरकरार ग्लूकोसाइनोलेट्स संयंत्र कोशिकाओं की रिक्तिकाएं में जमा हो जाती है और किसी भी aboveground या belowground अंग 7 में पाया जा सकता है, <समर्थन वर्ग = "xref"> 8, 9। सेल टूटना (जैसे, herbivory द्वारा) पर, ग्लूकोसाइनोलेट्स जारी कर रहे हैं और एंजाइम मिरोसिनेज के साथ मिश्रित कर रहे हैं, एक सरसों के तेल बम 10 की स्थापना। मिरोसिनेज की गतिविधि के कारण, और glucosinolate, प्रतिक्रिया की स्थिति, और संशोधित एंजाइमों की उपस्थिति की संरचना पर निर्भर करता है, अलग, तीखा विषाक्त, या हानिकारक यौगिकों ऐसे nitriles और (आईएसओ) Thiocyanates 11 के रूप में गठन कर रहे हैं। प्रतिक्रिया उत्पादों उच्च जैविक गतिविधियों है; उदाहरण के लिए, वे generalist कीट शाकाहारी 12 की भगाने के रूप में सेवा करते हैं। ग्लूकोसाइनोलेट्स की आनुवांशिकता और biosynthetic रास्ते में अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, मुख्य रूप से शाकाहारी और रोगज़नक़ प्रतिरोध, सरसों और पत्तागोभी में स्वाद घटकों के रूप में उनके मूल्य, और उनके नकारात्मक (progoitrin) और सकारात्मक (glucoraphanin) मानव स्वास्थ्य के 5 पर प्रभाव के लिए उनके महत्व की वजह से, </sup> 13, 14।
उलट चरण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) पराबैंगनी (यूवी) या photodiode सरणी के साथ सुसज्जित के आधार पर जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों, निकासी और तरीकों का पता लगाने के रूप में ग्लूकोसाइनोलेट्स में बहुत रुचि के कारण (पीडीए) डिटेक्टरों आमतौर पर 1980 के दशक के बाद से 15 इस्तेमाल किया गया है । इस पद्धति के आधार पर, यूरोपीय समुदाय के लिए एक मानक प्रोटोकॉल है कि तिलहन में ग्लूकोसाइनोलेट्स का विश्लेषण (ब्रेसिका napus, कोल्ज़, कैनोला 16) के लिए परीक्षण किया और कई प्रयोगशालाओं में मान्य किया गया था जारी किए हैं। अन्य (, जैसे ग्लूकोसाइनोलेट्स कि तिलहन बलात्कार में मौजूद नहीं हैं के लिए अतिरिक्त प्रतिक्रिया कारकों का निर्धारण) के द्वारा इस विधि के लिए जोड़े गए 17। Glucosinolate विश्लेषण 18 के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) प्लेटफार्मों और उच्च throughput प्रोटोकॉल की बढ़ती उपलब्धता के बावजूद <sup>, 19, मूल एचपीएलसी यूवी / पीडीए पद्धति अभी भी व्यापक रूप से वैज्ञानिकों द्वारा प्रयोग किया जाता है। मुख्य कारण हैं कि इस विधि सरल, लागत प्रभावी है, और अपेक्षाकृत एक व्यापक रासायनिक विश्लेषणात्मक ज्ञान के बुनियादी ढांचे के बिना प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है। इस समुदाय की सेवा करने के लिए, हम यहाँ विस्तार संयंत्र सामग्री से ग्लूकोसाइनोलेट्स की निकासी और एचपीएलसी-पीडीए के साथ उनकी desulfo-रूपों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस स्थापना की है और व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि का सबसे बड़ा लाभ है कि यह मजबूत, बल्कि सीधी, और नमूना प्रति अपेक्षाकृत कम लागत है। निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए आवश्यक उपकरणों के अधिकांश एक मानक प्रयोगशाला में उपलब्ध होना चाहिए या आत्म बनाया जा सकता है, एचपीएलसी-पीडीए के अपवाद के साथ। एक और लाभ यह है कि पानी में भंग desulfoglucosinolates रासायनिक काफी स्थिर जब शांत और हवा तंग (एचपीएलसी) शीशियों में रखा जाता है, इसलिए अर्क आसानी से अन्यत्र एचपीएलसी विश्लेषण के लिए भेज दिया जा सकता है। नियंत्रण रेखा एमएस प्लेटफार्मों, जो विशेष प्रशिक्षण और व्यापक हाथों पर सॉफ्टवेयर के प्रबंध और डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनुभव की आवश्यकता के विपरीत, एचपीएलसी यूवी / पीडीए आसानी से एक छोटी अवधि के प्रशिक्षण के बाद चलाया जा सकता है। यह न केवल प्रक्रिया की लागत कम कर देता है, लेकिन यह भी वैज्ञानिकों का एक व्यापक रेंज, छात्रों सहित के लिए इस विधि और अधिक सुलभ बना देता है।
आम तौर पर, जब प्रक्रियाओं ऊपर वर्णित carefu पालन कर रहे हैंlly, कुछ समस्याएं हो जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, glucosinolate चोटियों बहुत अच्छी तरह से वर्णलेख में अलग हो रहे हैं। यदि यह मामला नहीं है, ढाल कार्यक्रम eluent में acetonitrile की वृद्धि की दर को कम करके अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक नया पूर्व स्तंभ (200-500 इंजेक्शन) या स्तंभ (1500 -2000 इंजेक्शन) के निर्माण में इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। कभी कभी, एक बैच में एकल नमूनों की chromatograms बहुत छोटे या कोई चोटियों दिखा सकते हैं। जब sulfatase जोड़ना इस pipetting त्रुटियों के कारण आमतौर पर है (उदाहरण के लिए, एक कॉलम को छोड़ दिया गया है या ठीक से sulfatase स्तंभ में नीचे धोया नहीं था)। वैकल्पिक रूप से, प्रयोगात्मक सामग्री में glucosinolate एकाग्रता कम किया गया हो सकता से अधिक की उम्मीद है और बहुत कम सामग्री निकासी के लिए इस्तेमाल किया गया था। उत्तरार्द्ध मामला है, इंजेक्शन की मात्रा 100 μL के लिए बढ़ाया जा सकता है, या निकालने का एक सटीक विभाज्य (जैसे, 800 μL) ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध फ्रीज सूखे के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैनिकालने हैैं, पानी की एक छोटी मात्रा (जैसे, 100 μL) में छाछ भंग, और उसी संदर्भ वक्र का उपयोग reinjecting। निकालने के मूल एकाग्रता के लिए गणना में, संख्या कमजोर पड़ने कारक से गुणा किया जाना चाहिए। यदि यह समस्या का समाधान नहीं है, सामग्री को फिर से शुरू करने और अधिक सामग्री का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए। यदि यह 100 से अधिक मिलीग्राम है, निष्कर्षण सॉल्वैंट्स की मात्रा और ट्यूबों के आकार आनुपातिक समायोजित किया जाना चाहिए निकासी दक्षता बनाए रखने के लिए।
एक अतिरिक्त लाभ यह है कि इस विधि को अच्छी तरह से मान्य किया गया है। इसका कारण यह है कि यह रेपसीड में ग्लूकोसाइनोलेट्स की मात्रा का ठहराव, जिसके लिए प्रक्रियाओं और सटीकता के कई प्रयोगशालाओं 16 में पुष्टि की गई के लिए एक मानक पद्धति के रूप में वर्णित किया गया है। इसके अलावा, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, जैव संश्लेषण, और ग्लूकोसाइनोलेट्स की जैविक कार्यों आधुनिक में, गहन अनुसंधान के प्रयासों के अधीन हैंदूसरों 4, 6, 12 के बीच में अल पौधों की प्रजातियों Arabidopsis thaliana। इसलिए, sinigrin के संबंध में desulfoglucosinolates की सही मात्रा का ठहराव के लिए कई कारकों प्रतिक्रिया अच्छी तरह से परिभाषित किया है और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध 15,17 रहे हैं। हालांकि लोकसभा एमएस आधारित प्रोटोकॉल अधिक उच्च throughput, और अधिक संवेदनशील होते हैं, और करने में सक्षम हैं (अंतरिम) की पहचान ग्लूकोसाइनोलेट्स जिसके लिए कोई मानक उपलब्ध 18, 19, 20, नियंत्रण रेखा एमएस के लिए सार्वभौमिक प्रतिक्रिया कारकों की कमी सीमा रहे हैं glucosinolate सांद्रता 18 की सही मात्रा का ठहराव। इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर एक फ्रीज सुखाने कदम है, और ताजा सामग्री संयंत्र में पानी की मात्रा को शामिल नहीं हैं सटीक मात्रा का ठहराव मुश्किल बना गणना में बेहिसाब है। अन्त में, क्योंकि हमारे निकासी विधि शामिल एक स्तंभ आधारितशोधन और एकाग्रता कदम है, यह भी इस तरह के मिट्टी के रूप में 21 ग्लूकोसाइनोलेट्स की कम मात्रा के साथ "गंदा" नमूने के लिए लागू किया जा सकता है।
नियंत्रण रेखा एमएस आधारित विधियों है कि आमतौर पर हौसले से जमे हुए माल निकालने, निकासी के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें उपयोग करते हैं, और एक sulfatase कदम 18, 19 में शामिल नहीं है की तुलना में हमारे विधि अपेक्षाकृत समय लेने वाली और श्रम तीव्र है। इस पत्र में वर्णित स्तंभ रैक के साथ, एक ही व्यक्ति एक दिन में 100-150 के बारे में नमूने निकाल सकते हैं। क्षालन (अगले दिन), सुखाने फ्रीज (रात में), और फिर से भंग निम्नलिखित दो दिनों के भीतर जगह ले सकते हैं। एक स्वचालित एचपीएलसी इंजेक्टर, इंजेक्शन प्रति 40-45 मिनट की एक रन और संतुलन समय है, और कोई अप्रत्याशित घटनाओं के साथ, यह 3-4 दिन लग इस नमूने सेट के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए होगा। एचपीएलसी सॉफ्टवेयर sinigrin वक्र, chromatograms और पीई की एक पुस्तिका की जांच के आधार पर स्वत: मात्रा का ठहराव अनुमति देता है जब100 नमूनों के लिए एके कार्य केवल एक और 1 या 2 घंटे लेने के लिए डेटा सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से पहले हो सकती है।
glucosinolate मानकों की बढ़ती उपलब्धता के बावजूद केवल 130 से अधिक उम्मीदवारों का एक छोटा सा अंश वर्तमान में व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है। हालांकि, biosynthetic वर्गों में से प्रत्येक के लिए कुछ संदर्भों के साथ; यौगिकों को निर्दिष्ट साहित्य डेटाबेस तक पहुँच पहले से पौधों की प्रजातियों में पाया (जैसे, फाहे एट अल 22।); ऐसे eluotropic श्रृंखला के तर्क के रूप में chromatographic सिद्धांतों के बुनियादी ज्ञान (जैसे, स्निग्ध यौगिकों में पक्ष श्रृंखला पर सीएस की बढ़ती संख्या के लिए, 3 आंकड़े और 4); और नियंत्रण रेखा पर एमएस 19 या पृथक ग्लूकोसाइनोलेट्स एनएमआर 23 पर ही नमूनों की मान्यता, एक बड़ी आसानी से इस सीमा को पार कर सकता है। glucosinolate के लिए सबसे प्रोटोकॉल आंतरिक संदर्भ का उपयोग घटता का विश्लेषण करती है(यानी, निष्कर्षण विलायक 16, 17, 19 के लिए sinigrin की निकासी के लिए या sinalbin एक निश्चित एकाग्रता)। मुख्यतः, आंतरिक संदर्भ घटता अधिक व्यक्ति नमूना प्रसंस्करण त्रुटियों के लिए सही है और इस तरह सैद्धांतिक रूप से एक उच्च परिशुद्धता उपज के लिए उपयुक्त हैं। इस लाभ के बावजूद, हम, एक पांच सूत्री बाहरी संदर्भ वक्र का उपयोग करने के रूप में हम अक्सर (जैसे, ब्रेसिका Nigra 24) या sinalbin (जैसे, Sinapis अल्बा 25), विभिन्न जंगली प्रजातियों, जिनमें से कुछ sinigrin के उच्च स्तर को रोकने का विश्लेषण पसंद करते हैं दो glucosinolate संदर्भों जिसके लिए प्रतिक्रिया कारकों उपलब्ध हैं। इसके अलावा, प्रत्येक नमूने के आंतरिक मानकों उनका कहना है, विश्लेषण की लागत बढ़ जाती है के रूप में उच्च ग्रेड glucosinolate संदर्भ मानकों आम तौर पर काफी महंगे हैं।
अंत में, समय लेने वाली कदम के बावजूद, इस प्रोटोकॉलनिकालने के लिए और संयंत्र के नमूने में ग्लूकोसाइनोलेट्स यों तो एक सीधा और सुलभ तरीका प्रदान करता है। हालांकि, यह विचार करना है कि glucosinolate स्तर खुद प्रतिक्रिया उत्पादों में संभावित जैविक गतिविधि का केवल एक संकेत है, आवश्यकता मिरोसिनेज के साथ प्रतिक्रिया के रूप में देखा है, और बदलाव के लिए एक एकल glucosinolate 11 से उत्पन्न हो सकती हैं महत्वपूर्ण है। मान्यकरण assays जैविक प्रासंगिकता पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Materials
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
| Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
| HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
| Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
| (−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
| Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
| Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
| Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
| Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
| Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
| 2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
| Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
| Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
| Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
| Water bath | VWR | 462-5112 | |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
| PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
| Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
| Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
| HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
| Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
| Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
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