Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
植物は、化学化合物1の20万人を超える異なる種類を生成することが推定されています。これらの化合物の唯一の少数派は、植物の一次代謝、燃料の成長と再生に役割を果たしているようです。大半は、いわゆる二次代謝産物です。彼らは花粉媒介者を引き付けるために、または病原体や草食動物1に対する植物を守るために役立つように、その名前にもかかわらず、二次代謝産物は、多くの場合、植物の生存と再生のために重要です。
グルコシノレートは、150年以上の2のために研究されてきた二次代謝産物の非常に多様なクラスです。現在までに、130以上の構造的に異なるグルコシノレートは、3同定されています。概して、グルコシノレートは、それらが合成されるアミノ酸に基づいて異なるクラスに分けることができます。インドールグルコシノレートは、例えば、アミノ酸から合成されますトリプトファン、フェニルアラニンは芳香族グルコシノレート4の合成のための基本骨格を提供する一方。クラスの中に、高い脂肪族グルコシノレート類のような生合成経路において、または側鎖修飾( 例えば、ヒドロキシル)により逐次鎖伸長工程によってもたらされる構造的多様性のレベル、4、5があります。一つのグルコシノレートの植物種が異なる構造クラス6に属する最大37の異なるグルコシノレートを含有することができます。植物種は、典型的なグルコシノレートのプロファイルを持っているにもかかわらず、グルコシノレートの種類のための種内変異は頻繁に個人や集団6、7の間で発見されました。無傷のグルコシノレートは、植物細胞の液胞に保存され、任意の地上または地下部器官7に記載されています<SUPクラス= "外部参照"> 8、9。細胞破壊( 例えば、草食性によって)されると、グルコシノレートが解放され、マスタードオイル爆弾10をオフに設定し、酵素ミロシナーゼと混合されます。ミロシナーゼの活性、およびグルコシノレートの構造、反応条件、および修飾酵素、異なる刺激、毒性、又は有害な化合物の存在に依存してこのようなニトリル及び(イソ)として、形成された11のチオシアネート。反応生成物は、高い生物学的活性を有します。例えば、彼らはゼネラリスト昆虫草食動物12の忌避剤としての役割を果たす。グルコシノレートの遺伝と生合成経路がよく、主に草食動物と病原体抵抗性、マスタードとキャベツで香味成分としての価値、およびそれらの負(progoitrin)と人間の健康5にプラス(グルコラファニン)効果のためにそれらの重要性、研究されています</suP> 13、14。
なぜなら、紫外線(UV)またはフォトダイオードアレイを備えた逆相高圧液体クロマトグラフィーに基づいて、生物学的に活性な化合物、抽出及び検出方法としてグルコシノレートに大きな関心(HPLC)の(PDA)検出器は、一般的に1980 15が使用されています。この方法に基づき、欧州共同体は、油糧種子中のグルコシノレートの分析( セイヨウアブラナ 、セイヨウアブラナ、キャノーラ16)のために、いくつかのラボでテストおよび検証された標準プロトコルを発行しました。その他は17(ナタネには存在しないグルコシノレートのための追加の応答係数を決定することにより、例えば )このメソッドに追加しました。グルコシノレートの分析18のための液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォーム及びハイスループットプロトコルの増加にもかかわらず、利用可能<suP> 19は 、元のHPLC-UV / PDA方法は、まだ広く科学者によって使用されています。主な理由は、この方法が簡単で、費用対効果、および広範な化学分析の知識インフラのないラボに比較的アクセス可能であることです。この地域社会に奉仕するためには、植物材料からグルコシノレートの抽出とHPLC-PDAとのdesulfo-フォームの分析のために、私たちここでは詳細プロトコル。
この確立され、広く使用されている方法の最大の利点は、それが堅牢であることかなり単純であり、サンプルあたりの比較的低コスト。抽出および分析のために必要な機器の大半は、標準的な実験室で利用可能であるべきか、HPLC-PDAを除いて、自己構築することができます。もう一つの利点は、抽出物は、容易に他の場所でHPLC分析のために出荷することができたので、涼しく、気密(HPLC)バイアルに保管時に水に溶解しdesulfoglucosinolatesは、化学的に非常に安定していることです。ソフトウェアを管理し、データを分析するための専門的なトレーニングと豊富な実務経験を必要とし、LC-MSプラットフォームとは対照的に、HPLC-UV / PDAが簡単に、短いトレーニング期間後に実行することができます。これは、手順のコストを削減するだけでなく、学生を含む科学者の幅広い、この方法よりアクセスできるようになりませんのみ。
一般的に、上記の手順はcarefuを追っているときLLY、いくつかの問題が発生する必要があります。一般的には、グルコシノレートのピークが非常によくクロマトグラムで分離されます。そうでない場合、勾配プログラムは、溶出液中のアセトニトリルの増加率を減少させることによって適合させることができます。代わりに、新しいプレカラム(200-500注射)または列(1500 -2000注射)で構築することは、問題を解決することがあります。時折、バッチ内の単一のサンプルのクロマトグラムは、非常に小さい、または全くピークを示してもよいです。これは、スルファターゼを追加するときに起因するピペッティングエラーのために通常である( 例えば、列がスキップされたか、スルファターゼが正しく列にダウンして洗浄しませんでした)。また、実験材料中のグルコシノレート濃度が予想よりも低くされている可能性があり、あまりにも少しの材料を抽出するために使用しました。後者の場合は、注入容量は100μLまで増加させることができる、または抽出物の正確なアリコート( 例えば、800μL)を濃縮することができます。後者は、凍結乾燥することによって達成することができます水の少量( 例えば、100μL)で残留物を溶解し、抽出液をる、と同じ基準曲線を使用して再注入。抽出物の元の濃度の計算では、数字は、希釈率を掛けなければなりません。これで問題が解決しない場合、材料は、出発物質を使用して再度抽出する必要があります。これ以上の100mgの場合には、抽出溶媒の容積、チューブのサイズは、抽出効率を維持するために比例的に調整されるべきです。
さらなる利点は、この方法は、十分に検証されたことです。それは、手順および精度は、いくつかの研究室16で確認されたため菜種におけるグルコシノレートの定量のための標準的な方法として記載されているからです。また、遺伝的背景、生合成、及びグルコシノレートの生物学的機能はモッズに、熱心な研究努力の対象となっています他の4、6、12のうち、エル植物種のシロイヌナズナ 。したがって、シニグリンとの関係でdesulfoglucosinolatesの正確な定量化のための多くの応答因子は十分に定義されており、15,17公的に利用可能。 LS-MSベースのプロトコルは、より感度の高い、より高スループットであり、LC-MSは、制限のために(仮に)、ユニバーサル応答因子の欠如を全く基準が18、19、20用意されていないいるグルコシノレートを識別することができるにもかかわらずグルコシノレート濃度18の正確な定量化。また、これらの方法は、通常、凍結乾燥工程を含まない、新鮮な植物材料中の水の量は、正確な定量化が困難、計算で行方不明です。我々の抽出方法が含まれるため最後に、列ベース精製および濃縮工程、それはまた、土壌21等のグルコシノレートの低い濃度で「汚れた」サンプルに適用することができます。
通常、新鮮に凍結された物質を抽出する抽出のために96ウェルプレートを使用し、スルファターゼステップ18、19を含まないLC-MSベースの方法に比べて、私たちの方法は、比較的時間がかかり、労働激しいです。このホワイトペーパーで説明する列ラックを使用すると、単一の人は1日に約100から150サンプルを抽出することができます。溶出(翌日)、(一晩)凍結乾燥し、再溶解は、次の2日以内に行うことができます。自動化されたHPLCインジェクター、注射当たり40〜45分のランと平衡時、ノー不測の事態で、それはこのサンプルセットのデータを取得するために3-4日かかるだろう。 HPLCソフトウェアはシニグリン曲線、クロマトグラムの手動チェックとPEに基づく自動定量化を可能にする場合データは、統計分析のために使用することができる前に、100サンプルについてのkの割り当ては、他の1または2時間を取ることができます。
グルコシノレートの基準の増加が利用可能であるにもかかわらず、130以上の候補者のわずかな部分だけは、現在、商業的に購入することができます。しかし、生合成の各クラスのためのいくつかの参照を持ちます。化合物を指定する文献データベースへのアクセスは、以前に植物種に見られる( 例えば、フェイヒーら22);このようなeluotropicシリーズのロジックのようなクロマトグラフィーの原則の基本的な知識( 例えば、脂肪族化合物中の側鎖にCsの数を増加させるため、3及び図 4)。およびNMR 23、1のLC-MS 19または単離されたグルコシノレート上の単一のサンプルの検証は簡単にこの制限を克服することができます。グルコシノレートのためのほとんどのプロトコルは内部基準曲線を使用して分析します( すなわち、溶媒抽出16、17、19シニグリンの抽出またはシナルビンある濃度)。主に、内部基準曲線は、個々のサンプルの処理エラーを補正することがより適切であり、従って、理論的に、より高い精度をもたらします。この利点にもかかわらず、我々は、多くの場合( 例えば、クロガラシ 24)またはシナルビン( 例えば、ホワイトマスタード 25)、シニグリンの高レベルが含まれているそのうちのいくつかの異なる野生種を、分析するように、5点外部参照曲線を使用することを好みます2グルコシノレートの参照が対象の応答因子が用意されています。ハイグレードグルコシノレートの参照標準は、通常、非常に高価であるためまた、各サンプルに内部標準を添加して、分析のコストを増大させます。
結論として、時間のかかる手順にも関わらず、このプロトコル植物試料にグルコシノレートを抽出し、定量化するための簡単でアクセス可能な方法を提供します。しかし、グルコシノレートレベル自体がミロシナーゼと反応する必要性と見電位の生物学的活性の唯一の指標である、との反応生成物の変化は、単一のグルコシノレート11から生じ得ることを考慮することが重要です。検証アッセイは、生物学的関連性を確認するために実行する必要があります。
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |