Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Det er anslått at plantene produserer mer enn 200 000 forskjellige typer av kjemiske forbindelser 1. Bare et mindretall av disse sammensatte synes å spille en rolle i plantenes primær stoffskiftet, noe som brensel Veksten og reproduksjon; de fleste er såkalte sekundære metabolitter. Til tross for navnet, sekundære metabolitter er ofte avgjørende for anlegget overlevelse og reproduksjon, som de tjener til å tiltrekke pollinatorer, eller å forsvare anlegget mot patogener og planteetere 1.
Glukosinolater er en svært uensartet klasse av sekundære metabolitter som har blitt studert i over 150 år 2. Hittil har mer enn 130 strukturelt forskjellige glukosinolater blitt identifisert tre. Grovt sett kan glukosinolater deles i forskjellige klasser basert på aminosyren som de er syntetisert. Indol glukosinolater, for eksempel syntetiseres fra aminosyrentryptofan, mens fenylalanin gir basen skjelettet for syntese av aromatiske glukosinolater 4. Innenfor klasser, er det en høy grad av strukturell diversitet, som er forårsaket av sekvensielle kjedeforlengelsestrinn i den biosyntetiske reaksjonsveier, for eksempel i klassen av alifatiske glukosinolater, eller ved sidekjedemodifiseringer (for eksempel, hydroksylering) 4, 5. En glucosinolate plantearter kan inneholde opp til 37 ulike glukosinolater som tilhører ulike strukturelle klasser 6. Selv om plantearter har typiske glucosinolate-profiler, er intraspesifikk variasjon for de typer glukosinolater ofte funnet blant individer og bestander 6, 7. Intakte glukosinolater er lagret i vakuoler av planteceller og kan bli funnet i noen aboveground eller belowground organ 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Ved cellen ruptur (for eksempel ved herbivory), er glukosinolater løslatt og er blandet med enzymet myrosinase, innstilling av en sennep olje bombe 10. På grunn av aktiviteten av myrosinase, og avhengig av strukturen av den glucosinolate, reaksjonsbetingelsene, og nærværet av modifiserende enzymer, ulike bitter, toksiske eller skadelige forbindelser dannes, så som nitriler og (iso) tiocyanater 11. Reaksjonsproduktene har høy biologisk aktivitet; for eksempel, tjener de som repellents av generainsekt planteetere 12. Arvbarheten og biosyntetiske veier av glukosinolater er godt undersøkt, hovedsakelig på grunn av deres betydning for herbivore og patogen motstand, deres verdi som smakskomponenter i mustards og kål, og deres negative (progoitrin) og positive (glucoraphanin) effekter på menneskers helse 5, </sup> 13, 14.
På grunn av den store interessen i glukosinolater som biologisk aktive forbindelser, utvinning og påvisningsmetoder basert på reversert fase høytrykks-væskekromatografi (HPLC) utstyrt med ultrafiolett (UV) eller fotodiode array (PDA) detektorer har blitt brukt siden 1980-tallet 15 . Basert på denne metoden, De europeiske fellesskap utstedt en standard protokoll som ble testet og validert i flere laboratorier for analyse av glukosinolater i oljefrø (Brassica napus, rybs, raps 16). Andre lagt til denne metoden (for eksempel ved å bestemme flere responsfaktorer for glukosinolater som ikke finnes i raps) 17. Til tross for den økende tilgjengeligheten av væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) plattformer og high-throughput protokoller for glucosinolate analyse 18 <sup>, 19, er den opprinnelige HPLC-UV / PDA-metoden fortsatt mye brukt av forskere. Hovedårsakene er at denne metoden er enkel, kostnadseffektiv og relativt tilgjengelig for laboratorier uten en omfattende kjemisk-analytisk kunnskap infrastruktur. For å tjene dette samfunnet, vi her detalj protokollen for utvinning av glukosinolater fra plantemateriale og analyse av deres desulfo former med HPLC-PDA.
De største fordelene med denne etablert og mye brukt metode er at det er robust, ganske enkelt, og forholdsvis lave kostnader per prøve. Det meste av utstyret som er nødvendig for ekstraksjon og analyse bør være tilgjengelig i en standard laboratorium eller kan være selv bygget, med unntak av HPLC-PDA. En annen fordel er at desulfoglucosinolates oppløst i vann er kjemisk ganske stabilt når det oppbevares kjølig og i lufttett (HPLC) ampuller, slik ekstraktene kan lett sendes til HPLC-analyse andre steder. I motsetning til LC-MS-plattformer, som krever spesialisert opplæring og omfattende praktisk erfaring for å håndtere programvaren og analysere data, HPLC-UV / PDAer kan lett løpe etter en kort treningsperiode. Dette reduserer ikke bare kostnadene ved inngrepet, men også gjør denne metoden mer tilgjengelig for et bredt spekter av forskere, blant annet studenter.
Vanligvis, når fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor blir fulgt carefully, bør noen problemer oppstår. Generelt er glucosinolate toppene meget godt adskilt i kromatogrammet. Hvis dette ikke er tilfelle, kan den gradientprogram tilpasses ved å redusere økningen av acetonitril i elueringsmiddel. Alternativt, bygge en ny pre-kolonne (200-500 injeksjoner) eller kolonnen (1500 -2000 injeksjoner) kan løse problemet. Av og til kan kromatogrammer av enkeltprøver i en batch viser svært liten eller ingen topper. Dette er vanligvis på grunn av pipettering feil når du legger den sulfatase (for eksempel en kolonne har blitt hoppet over eller sulfatase var ikke ordentlig vasket ned inn i kolonnen). Alternativt kan glucosinolate-konsentrasjonen i de eksperimentelle materialer har vært lavere enn forventet, og for lite materiale ble anvendt for ekstraksjonen. Hvis sistnevnte er tilfelle, kan injeksjonsvolumet økes til 100 ul, eller en nøyaktig alikvot (for eksempel 800 ul) av ekstrakten kan konsentreres. Det sistnevnte kan oppnås ved frysetørring ekstrakten, oppløsning av resten i et mindre volum (for eksempel 100 ul) av vann, og å reinjisere ved hjelp av samme referansekurven. I beregningene for det opprinnelige konsentrering av ekstraktet, bør tallene multipliseres med fortynningsfaktoren. Hvis dette ikke løser problemet, bør materialene hentes ut igjen med mer startmateriale. Dersom dette er mer enn 100 mg, bør volumet av ekstraksjons-løsningsmidler og størrelsen av rørene reguleres proporsjonalt for å opprettholde ekstraksjonseffektiviteten.
En ytterligere fordel er at denne metoden har blitt vel validert. Dette er fordi det er blitt beskrevet som en standard metode for kvantifisering av glukosinolater i raps, for hvilke prosedyrer og nøyaktighet ble bekreftet i flere laboratorier 16. I tillegg er genetisk bakgrunn, biosyntese og biologiske funksjoner av glukosinolater er gjenstand for intens forskning innsats, i model plantearter Arabidopsis thaliana blant annet 4, 6, 12. Derfor er mange responsfaktorer for nøyaktig kvantifisering av desulfoglucosinolates i forhold til sinigrin veldefinert og allment tilgjengelig 15,17. Selv om LS-MS-baserte protokoller er mer high-throughput, mer følsomt, og er i stand til (forsøksvis) identifisere glukosinolater for hvilke ingen standarder er tilgjengelige 18, 19, 20, mangel på universelle responsfaktorer for LC-MS begrenser presis kvantifisering av glucosinolate konsentrasjoner 18. Videre er disse fremgangsmåter vanligvis ikke inkluderer et frysetørketrinn, og mengden av vann i det friske plantematerialet er ikke gjort rede for i beregningene, noe som gjør nøyaktig kvantifisering vanskelig. Til slutt, fordi vår utvinning metoden innebærer en kolonne basertrensing og konsentrasjonstrinn, kan det også bli brukt for å "skitne" prøver med lave konsentrasjoner av glukosinolater, slik som jord 21.
Sammenlignet med LC-MS-baserte metoder som vanligvis trekke fersk frosne materialer, bruker 96-brønners plater for utvinning, og ikke inneholder et sulfatase trinn 18, 19, er vår metode relativt tidkrevende og arbeidskrevende intens. Med kolonne stativer som er beskrevet i denne artikkelen, kan en enkelt person trekke ca 100-150 prøver på en dag. Eluering (neste dag), frysetørking (over natten), og re-oppløsning kan skje i løpet av de neste to dagene. Med en automatisert HPLC injektor, en joggetur og likevekt tid på 40-45 min per injeksjon, og ingen uforutsette hendelser, vil det ta 3-4 dager å skaffe data for denne prøvesett. Når HPLC programvaren tillater automatisk kvantifisering basert på sinigrin kurve, en manuell sjekk av kromatogrammene og peak oppdrag for 100 prøver kan bare ta en annen en eller to timer før dataene kan brukes til statistiske analyser.
Til tross for den økende tilgjengeligheten av glucosinolate standarder, bare en liten brøkdel av de mer enn 130 kandidater kan i dag kommersielt kjøpt. Men med noen referanser for hver av de biosyntetiske klasser; adgang til litteraturdatabaser angivelse av forbindelser som tidligere er funnet i plantearter (f.eks Fahey et al. 22); grunnleggende kjennskap til kromatografiske prinsipper, som logikken eluotropic serien (dvs. for et økende antall Cs på sidekjeden i alifatiske forbindelser, figurene 3 og 4); og validering av enkeltprøver på LC-MS 19 eller isolerte glukosinolater på NMR 23, kan man lett overvinne denne begrensningen. De fleste protokoller for glucosinolate analyserer bruke interne referansekurver(Dvs. en viss konsentrasjon for utvinning av sinigrin eller sinalbin til ekstraksjonsløsningsmidlet 16, 17, 19). Prinsipielt interne referansekurver er mer hensiktsmessig å korrigere for de enkelte prøvebehandlingsfeil og således teoretisk gir høyere presisjon. Til tross for denne fordel foretrekkes det å bruke en fem-punkts ekstern referansekurve, som vi ofte analysere forskjellige ville arter, hvorav noen inneholder høye nivåer av sinigrin (f.eks, Brassica nigra 24) eller sinalbin (f.eks, Sinapis alba 25), den to glucosinolate referanser som responsfaktorer er tilgjengelige. Videre tilsetning av interne standarder for hver prøve øker kostnadene av analysene, som høy grad av glucosinolate referansestandarder er vanligvis ganske dyre.
Som konklusjon, til tross for de tidskrevende trinnene, denne protokollengir en enkel og tilgjengelig metode for å trekke ut og kvantifisere glukosinolater i planteprøver. Imidlertid er det viktig å vurdere at glucosinolate nivåene selv er bare en indikasjon på den potensielle biologiske aktivitet, betraktes som nødvendigheten av å reagere med myrosinase, og variasjonen i reaksjonsproduktene kan oppstå fra en enkelt glucosinolate 11. Validerings analyser må utføres for å bekrefte biologisk relevans.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |