Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Bitkiler kimyasal bileşiklerin 1 200.000 farklı türleri üretmek olduğu tahmin edilmektedir. Sadece bu bileşiğin azınlık bitkilerin primer metabolizma, yakıtlar büyüme ve üreme bir rol oynadığı görülmektedir; çoğunluğu ikincil metabolitler olarak adlandırılmaktadır. Onlar pollinatorsu çekmeyi veya patojenler ve otobur 1 karşı bitki savunmak için hizmet olarak kendi adına rağmen, sekonder metabolitler, genellikle bitki hayatta kalma ve üreme için kritik öneme sahiptir.
Glucosinolates 150 yıldır 2 çalışılmıştır ikincil metabolitlerin bir çok farklı sınıf bulunmaktadır. Bugüne kadar, en fazla 130 yapısal olarak farklı glukozinolatlar 3 tespit edilmiştir. Genel olarak, glukozinolatlar da sentezlenmiş olan bir amino asit göre farklı sınıflara bölünebilir. Indol glukozinolatların, örneğin amino asitten sentezlenirlertriptofan, oysa fenilalanin aromatik glukozinolatların 4 sentezi için baz iskeleti sağlar. Sınıfları içinde, alifatik glukozinolatların sınıf olarak biyosentetik yollardaki sıralı zincir uzatma adımlar getirdiği ya da yan zincir modifikasyon (örneğin, hidroksilasyon) 4, 5 ile yapısal çeşitlilik, yüksek düzeyde vardır. Bir glukosinolat bitki türleri farklı yapısal sınıflardan 6 mensup kadar 37 farklı glikozinolitleri içerebilir. Bitki türleri tipik glukozinolat profillerine sahip olsa da, glukozinolatların türleri için intraspecific varyasyon sık sık bireyler ve nüfus 6, 7 arasında bulunur. Bozulmamış glukozinolatlar, bitki hücrelerinin vakuolleri içinde saklanır ve bir yer altı veya toprak altında organı 7 bulunabilir <sup class = "xref"> 8, 9. Hücre parçalanması (örn herbivory olarak) üzerine, glukozinolatların serbest bırakılır ve hardal yağı bomba 10 yola, mirosinaz ile karıştırılır. Mirosinaz aktivitesi için ve glukozinolat, reaksiyon koşulları ve modifiye enzimlerin varlığı yapısına bağlı olarak, farklı, keskin, toksik veya zararlı bileşikler, nitriller ve (izo) 11 tiyosiyanatlar olarak oluşturulmaktadır. reaksiyon ürünleri yüksek biyolojik aktivitelere sahip; Örneğin, kültürlü haşere otçul 12 geri püskürtme ajanları olarak hizmet vermektedir. Glukozinolatların kalıtım ve biyosentez yolları iyi, esas olarak, çünkü otobur ve patojen direnci, mustards ve lahana lezzet bileşenleri olarak kendi değer ve negatif (progoitrin) ve insan sağlığına 5 pozitif (glukorafanine bağlıdır) etkileri önemleri, incelenmiştir </sup> 13, 14.
Çünkü ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ultraviyole (UV) ya da fotodiyot dizi ile donatılmış (HPLC) göre biyolojik olarak etkin olan bileşikleri, ekstraksiyon ve saptama yöntemleri glukozinolatlar açısından büyük bir ilgi (PDA) detektörleri mutat olarak 1980'lerden 15 beri kullanılmaktadır . Bu yönteme dayalı, Avrupa Toplulukları Yağlı tohumlardan glukozinolatların analizi (Brassica napus, kolza, kanola 16) için çeşitli laboratuarlarda test edilmiş ve onaylanmış bir standart protokol yayınladı. Diğer 17 (kolza mevcut değildir glukozinolatların ek müdahale katlarının belirlenmesi ile, örneğin), bu yöntem için ilave edildi. Glukosinolat analizi 18 için sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) platformları ve yüksek verimlilik protokolleri artan bulunmasına karşın <sup>, 19, orijinal HPLC-UV / PDA yöntemi hala yaygın olarak bilim adamları tarafından kullanılır. başlıca nedenleri bu yöntem basit, düşük maliyetli ve kapsamlı bir kimyasal analitik bilgi altyapısının olmayan laboratuvarlarda nispeten erişilebilir olmasıdır. Bu topluma hizmet etmek, bitkisel maddelerden glukozinolatların çıkarılması ve HPLC-PDA ile desulfo-formlarının analizi için biz burada detay protokolü.
Bu kurulan ve yaygın olarak kullanılan yöntemin en büyük avantajı, sağlam, oldukça basit ve örnek başına nispeten düşük maliyetli olmasıdır. ekstraksiyon ve analiz için gerekli ekipman çoğu standart laboratuar mevcut olmalıdır ya da HPLC-PDA hariç olmak üzere, kendinden-inşa edilebilirler. Diğer bir avantajı, su içinde çözüldü desulfoglucosinolates serin ve hava geçirmez (HPLC) şişelerde muhafaza zaman, kimyasal olarak çok kararlıdır, yani ekstreler başka bir yerde kolaylıkla HPLC analizi için sevk olmasıdır. eğitim ve veri yazılımı yönetmek ve analiz etmek için kapsamlı uygulamalı deneyim uzman gerektiren LC-MS platformları, aksine, HPLC-UV / PDA kolayca kısa bir eğitim döneminden sonra çalıştırılabilir. Bu prosedürün maliyetlerini azaltır, aynı zamanda öğrencilerin de dahil olmak üzere bilim adamları geniş bir yelpazede, bu yöntem daha erişilebilir hale değil sadece.
Genel olarak, yukarıda tarif edilen prosedürler dikkatli bir şekild uyulduğundaLly, bazı problemler meydana gelmelidir. Genel olarak, glukozinolat pikleri çok iyi kromatogramda ayrılır. Bu durum söz konusu değilse, bir dereceleme programı akıtıcı asetonitril artış hızını azaltarak uyarlanabilir. Alternatif olarak, yeni ön-kolon (200-500 enjeksiyon) veya sütun (1.500 -2.000 enjeksiyon) bina sorunu çözebilir. Bazen, bir toplu tek numunelerin kromatogramları çok küçük veya hiç doruklarına gösterebilir. Bu sülfatazı eklerken nedeniyle pipetleme hataları genellikle (örneğin, bir sütun atlanır edilmiş veya sülfataz düzgün sütuna aşağı yıkadı değildi). beklenen ve çok az malzeme çıkarılması için kullanılan daha Seçenek olarak ise, deney malzemeleri glukozinolat konsantrasyonunun daha düşük olabilir. İkinci durumda ise, enjeksiyon hacmi 100 uL kadar yükseltilebilir, veya ekstre tam kısım (örneğin, 800 uL) konsantre edildi olabilir. ikinci dondurarak kurutma ile elde edilebilirsu daha küçük bir hacimde (örneğin, 100 uL) içinde eritilmesi, özü ing ve aynı referans eğrisi kullanılarak reinjecting. ekstresi orijinal konsantrasyonu için hesaplamalarda, sayılar seyreltme faktörü ile çarpılmalıdır. Bu sorunu çözmek değilse, malzeme başlangıç malzemesi kullanılarak daha ekstre edilmelidir. Bu fazla 100 mg ise, ekstraksiyon çözücü hacmi ve borular boyutu ekstraksiyon verimini korumak için orantılı olarak ayarlanmalıdır.
Diğer bir avantaj, bu yöntem iyi-valide edilmiş olmasıdır. Bu usul ve doğruluğu birçok labaratuvar 16 doğrulanmıştır olan kolza glukozinolatların miktarının, standart bir yöntem olarak tarif edilmiş olmasına olmasıdır. Buna ek olarak, genetik arka plan, biyosentez ve glukozinolatların biyolojik fonksiyonları mod, yoğun araştırma çabaları tabidirdiğerleri 4, 6, 12 arasında el bitki türleri Arabidopsis thaliana. Bu nedenle, Sinigrin ilişkin desulfoglucosinolates tam ölçümü için birçok tepki faktörleri iyi tanımlanmış ve 15,17 kamuya açık. LS-MS-tabanlı protokoller daha yüksek verimli, daha duyarlı ve mümkün olsa da (geçici) bir standart 18, 19, 20, LC-MS için evrensel tepki faktörlerinin eksikliği sınırlar mevcut olduğu glukozinotlar belirlemek glukosinolat konsantrasyonlarının 18 tam ölçümü. Ayrıca, bu yöntemler genellikle taze bitki malzemesinin bir kurutma adımı, ve su miktarını içermez tam miktar zorlaştırır hesaplamalarda kayıt dışı olan. Bizim ekstraksiyon yöntemi içerir çünkü Son olarak, bir sütun tabanlıarındırma ve yoğunlaştırma aşamaları, aynı zamanda bu tür topraklarda 21 olarak glukozinolatların düşük konsantrasyonları ile "kirli" örnekleri uygulanabilir.
Genellikle, taze dondurulmuş malzeme elde çıkarılması için, 96 gözlü levhalar kullanmak ve sülfataz adım 18, 19 kapsamamaktadır LC-MS-tabanlı yöntemler ile karşılaştırıldığında, yöntem, nispeten zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu yazıda anlatılan sütun raflarla, tek bir kişi bir günde yaklaşık 100-150 örnekleri elde edebilirsiniz. Elüsyon (ertesi gün), (gece) dondurarak kurutulmuş ve yeniden çözülmesini takip eden iki gün içinde yer alabilir. otomatik HPLC enjektör, enjeksiyon başına 40-45 dakikalık bir çalışma ve dengeleme zamanında ve hiçbir beklenmedik olaylar, bu örnek seti için veri elde etmek 3-4 gün sürer. HPLC yazılımı otomatik ölçümü sinigrin eğri, kromatogramlar ve pe manuel kontrol dayalı sağlar zamanveri istatistiksel analizler için kullanılmadan önce 100 numune için ak atamalar yalnızca başka bir 1 veya 2 saat sürebilir.
glukosinolat standartlarının artması bulunmasına karşın, 130'dan fazla adayın sadece küçük bir kısmı şu anda ticari olarak satın alınabilir. Bununla birlikte, sentetik sınıfların her biri için bir kaç referanslarla; bileşikleri belirten literatür veri tabanlarına erişim, daha önce bitki türlerinde bulunan (örneğin, Fahey ve ark 22.); Böyle eluotropic dizi mantığı olarak kromatografik ilkeler, temel bilgi (örneğin, alifatik bileşikler yan zinciri üzerindeki Cs sayıları artan için, 3 Şekiller ve 4); ve NMR 23 LC-MS 19 ya da izole glukozinolatların tek numunelerin doğrulama, kolayca bu sınırlama üstesinden gelebilir. glukosinalatının En protokolleri iç referans eğrileri kullanmak analizleri(Örneğin, solvent çıkarımı 16, 17, 19 Sinigrin ekstre ya sinalbin belirli konsantrasyon). Prensip olarak, iç referans eğrileri daha yüksek bir hassasiyet elde böylece teorik olarak bireysel numune işleme hataları düzeltmek ve daha uygundur. Bu avantajına rağmen, biz sık sık (örneğin, Brassica nigra 24) ya da sinalbin (örn Sinapis alba 25), Sinigrin yüksek düzeyde içeren bazıları farklı yabani türler, analiz gibi bir beş noktalı harici referans eğrisi kullanmayı tercih iki glukosinolat referanslar hangi yanıt faktörleri mevcuttur. yüksek dereceli glukosinolat referans standartları genellikle oldukça pahalı Dahası, her bir örnek için iç standartlar ekleyerek, analizlerin maliyetini artırmaktadır.
Sonuç olarak, zaman alıcı adımlara rağmen, bu protokolayıklamak ve bitki örneklerinde glukozinotlar ölçmek için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, glukozinolat düzeyleri kendileri tek bir glukozinolat 11 kaynaklanabilecek reaksiyon ürünlerinde sadece mirosinaz ile tepkimeye gereklilik olarak görülen potansiyel biyolojik aktivitesinin göstergesi, ve varyasyonu olduğu dikkate alınması önemlidir. Doğrulama deneyleri biyolojik ilgisini onaylamak için gerçekleştirilmelidir.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |