Summary
組織特異的細胞外マトリックス（ECM）は、細胞機能の重要なメディエーターです。この記事では、in vitro細胞培養モデルにおけるまたはプロ再生bioscaffoldsなどの高度な3Dでのアプリケーションのための化学的架橋を必要とせずに培養液中で安定している純粋なECM由来フォーム及びマイクロキャリアを合成するための方法を説明します。
Abstract
細胞機能は、複雑な組織特異的組成及びアーキテクチャを有する細胞外マトリックス（ECM）との相互作用によって媒介されます。この記事の焦点は、 インビトロ細胞培養モデルにおけるまたはプロ再生の足場と組織工学と再生医療のための細胞送達システムなどの高度な3Dでの生物学的に関連の基板として使用するためにECM由来の多孔質発泡体およびマイクロキャリアを製造する方法です。出発原料として脱細胞化組織または精製された不溶性コラーゲンを使用して、技術は、カスタマイズ可能な形状を有する組織特異bioscaffoldsの幅広いアレイを合成するために適用することができます。アプローチは、制御された凍結および凍結乾燥手順を介して三次元フォームまたはマイクロキャリアを製造するために使用されるECM懸濁液を得るために機械加工および軽度の酵素消化を含みます。これらの純粋なECM由来の足場はchemicを必要とせずに、高多孔質、まだ安定していますらは、負の細胞機能に影響を与えることができる薬剤または他の添加剤を架橋します。足場の特性は、ECM懸濁液濃度、機械加工法、又は合成条件などの変化要因によりある程度調整することができます。一般に、足場は、堅牢で取り扱いが容易であり、天然ECM組成物を模倣汎用性とユーザーフレンドリーな3D細胞培養プラットフォームを提供し、ほとんどの標準的な生物学的アッセイのための組織として処理することができます。全体として、カスタマイズされたECM由来フォーム及びマイクロキャリアを製造するためのこれらの簡単な方法は、in vitroおよびin vivo用途にための組織特異的細胞有益プラットフォームとして生物と生物医学的技術の両方を対象とすることができます。
Introduction
細胞外マトリックス（ECM）はタンパク質、糖タンパク質、および多糖1の複雑な3Dネットワークで構成されています。一度主構造フレームワークとみなし、現在よくECMが重要な機能的役割2を有する生物活性分子の多様なアレイを組み込むことが認識されます。細胞-ECM相互作用は、細胞の生存、接着、移動、増殖、および分化3を向けることができます。 ECM高分子の主要なクラスが一般的によく組織および種間で保存されているが、各組織は、固有のマトリックス組成物およびアーキテクチャ4を有しています。全体として、組織特異的なECMは、細胞内からの組織/器官スケール5に機能を媒介する有益な微小環境を提供します。
細胞機能を媒介するECMの重要な役割に、デへの関心が高まっています組織工学と再生医療への応用のためのECM由来bioscaffoldsのvelopment。具体的には、脱細胞化の方法は、広範囲の組織再生および細胞送達5、6、7のための足場材料として使用するための組織の広い範囲からECMを取得する手段として検討されています。脱細胞化は、典型的には、理想的にはECM 8の3D構造と組成物に最小の変化をさせながら、細胞及び細胞成分を除去することを対象と機械的、化学的、および/または生物学的処理段階の系列を含みます。文献の調査を通して、種々の脱細胞化プロトコルは、本体7のほぼすべての組織について同定することができます。
脱細胞化組織は、移植可能な足場または3D細胞培養基質として直接使用することができるが、細胞浸潤月緻密なECM構造9を組織に限定されます。さらに、ECM中の天然の不均一性は、潜在的に細胞応答10に影響を与える可能性脱細胞化マトリックス内の細胞付着及び分布の変動を引き起こす可能性があります。全体として、それらの完全な形、形状、多孔性、および剛性、ならびにインビボ用途のための送達のモードを含む同調足場特性の点で限定された多様性を提供するに脱細胞化組織を印加する、いくつかの用途のための有望つつ。
これらの制限を回避するために、多数の研究グループは、基材として脱細胞化組織を使用して、カスタマイズ足場形式を生成するために、更なる処理方法を適用しています。最も単純な形態では、これは、注射組織特異ECM粒子11を生成するために、脱細胞化組織を低温ミリング含むことができます。これらのECM粒子は、細胞instruとして組み込まれてもよいですヒドロゲル12、13、14を架橋するようなその場でのような他の生体材料との複合足場でctiveコンポーネント。機械加工に加えて、脱細胞化組織は、17、16、ECM由来ヒドロゲル、フォーム、マイクロキャリア、およびコーティング15を製造するためにタンパク質分解および/または糖分解酵素による酵素消化にもを行うことができるだけでなく、3Dプリントのためbioinksを合成します18。
組織工学アプリケーションに加え、ECM由来bioscaffoldsは、生物学的研究のためのin vitroモデルで高い忠実度を生成するための大きな可能性を秘めています。優れたネイティブの細胞微小環境19を再現三次元細胞培養システムを開発する重要な必要があります。ほとんどのin vitroでのC現在までエル培養研究は、生体組織20内に見出される生物学的に複雑で動的な細胞環境とほとんど相関を有する組織培養ポリスチレン（TCPS）上で行われます。制御された環境内で細胞間相互作用を研究するための便利ながら、これらの簡略剛性2D基板上に細胞を培養する細胞接着および形態を変化させる、ならびに両方の細胞-細胞および細胞- ECM 21,22を相互作用が含まれます。 2D TCPS上で観察された細胞の適応は、 生体系 23 におけるモデリングにおける2D研究の妥当性の質問を上げ、生存、増殖、遊走、および分化を含む多様な細胞機能を調節する細胞内シグナル伝達経路に影響を与えることができます。そこ細胞挙動が3Dシステム24 対 2Dで大きく異なることを認識を高め、そして生化学と両性そのされていますECMとのomechanicalシグナル伝達は、細胞機能25の主要なメディエーターです。多くのグループは、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンなどのECM成分とTCPSをコーティングすることによって確立された2次元システムの限界を克服しようと試みてきました。これらの戦略は、細胞の付着を向上させることができ、細胞応答を変えるかもしれないが、これらのモデルは、ネイティブECM 26、27の複雑な空間組織や生化学を模倣していない彼らの2D構成によって制限されたまま。
私たちの生物工学の研究室では、3-D細胞培養および組織工学アプリケーションのための基質としてECM由来bioscaffoldsの開発に興味を持ってきました。特に、我々は、脂肪再生28用足場プラットフォームとして脱細胞化脂肪組織（DAT）の使用を開拓しました。また、我々はDを使用して3Dマイクロキャリアと多孔質発泡体を合成するための方法を確立していますATαアミラーゼ29、30、31のタンパク質分解酵素ペプシンまたは糖分解酵素で消化しました。注目すべきことに、我々は、脂肪由来ECMは培養中のヒト脂肪由来幹/間質細胞（のASC）の脂肪細胞への分化のために誘導微小環境を提供し、これらの足場形式のすべてにわたって実証されています。さらに最近では、我々は、左心室（DLV）（ウェインライトら 32から適応脱細胞化法）脱細胞化αアミラーゼ消化したブタから3D多孔質発泡体を生成するために、当社の製造方法を拡張し、彼らは早期に心筋を誘導するための支援プラットフォームを提供することを示しました。人間の心膜脂肪由来のASC 31におけるマーカー発現。
この記事では詳細に純粋に得られた非化学的に架橋された3D多孔質発泡体およびマイクロキャリアを合成するための方法を説明しインビトロ細胞培養基質に生物学的に複雑な3Dとして使用するための、および組織再生のための生体材料としてαアミラーゼ消化ECMから。理論的には、高分子量のコラーゲンを含む任意のECM源は、これらの技術のための出発材料として使用することができます。このアプローチの柔軟性を実証するために、方法は、代表的な例として、ヒトDAT、ブタ脱細胞化真皮組織（DDT）8、およびブタDLVを用いて組織特異bioscaffoldsを生成するために適用されています。 図1は、ECM由来フォーム及びマイクロキャリアの製造プロセスの視覚的な概観を提供します。
組織特異的ECM由来フォーム及びマイクロキャリアの製造方法の図1.概要。 1.脱細胞化組織は、設立減速以下の準備しましたlularizationプロトコルは、組織特異的なECM由来bioscaffoldの製造に使用することができます。巨視的画像は（2008年8。 ら Reing、JE、に記載のように調製）ブタDDT、（フリン2010 28に記載されたように調製）水和ヒトDATの図示、およびブタDLV（ウェインライトらに記載のように調製されている2010年32 ）、出発材料として使用することができるECM源の代表例として。スケールバーは、3センチメートルを表します。 2.脱細胞化組織は、凍結乾燥され、次いで3は、機械的に刻みました。スケールバーは1cmに表します。 4.ミンチECMは、次にフォーム製造のためのオプションである、cryomilledが、マイクロキャリア合成のために必要とすることができます。スケールバーは、3ミリメートルを表しています。 前記ミンチ又はcryomilled ECMは、次いで、αアミラーゼを用いて消化し、均質なECM懸濁液を作成するために、均質化されます。スケールバーは1cmに表しています。
Protocol
1.脱細胞化組織処理
- 脱細胞化および凍結乾燥
- 確立されたプロトコルに従って、関心の脱細胞化組織（複数可）。
注：現在の研究で足場が人間のDAT 28、ブタDDT 8、およびブタDLV 32の公表脱細胞化プロトコルに従って作成されています。 50 mg / mlと - 市販の、不溶性コラーゲンはまた、10の濃度範囲にわたって成功裏に使用されたウシの腱から供給さコラーゲン発泡体およびマイクロキャリアを製造するために使用することができます。他の不溶性コラーゲン源が利用されてもよいが、安定した足場をもたらす濃度範囲を特定するために最適化を必要とするかもしれません。 - 鉗子で50mLの遠心管に水和脱細胞化組織または精製されたコラーゲンを移し、組織を沈めるために十分な蒸留水（のddH 2 O）を追加し、T35ミリリットルのOA最大総体積。
- その後の凍結乾燥中の昇華のための表面積を最大にするために、凍結中水平に配置遠心管を、-80℃で一晩試料を凍結します。
- 遠心管のキャップを外し、凍結乾燥ジャーに凍結サンプルを移します。
- 72時間または完全に乾燥するまで - 48実験室用凍結乾燥機を使用してサンプルを凍結乾燥。
注記：乾燥時間が異なる凍結乾燥機および脱細胞化組織のために変化してもよいです。 - 鋭い外科用ハサミを使用して- （2 から3mm〜1）細かく小片に凍結乾燥されたECMをミンチ。
- さらなる処理のための準備ができるまでデシケーター中にみじん切りECMを保管してください。
注：それはみじん切りECMは、環境からの水分の吸収を防ぐために、すぐに使用することをお勧めします。
- 確立されたプロトコルに従って、関心の脱細胞化組織（複数可）。
- 低温ミリング（フォーム製造用のオプション）
- laborato 25 mLのステンレス鋼粉砕室を満たしますみじん切り凍結乾燥ECMとRYボールミルシステムと2個の10ミリメートルのステンレス鋼ミリングボールを追加します。
- 閉じると完全に3分間液体窒素にロードされた粉砕室を水没。
- ミル30ヘルツ（1,800 rpm）で3分間凍結サンプル。
- ECMは、微粉末に粉砕されるまで繰り返して、1.2.2と1.2.3を繰り返します。
注：これらの手順を繰り返す必要がある回数は、ECMソース間で異なる場合があります。例えば、DATは、典型的には、微粉末を生成するために、3つのミリングサイクルを必要とします。 - ガラスバイアルに薬さじを用いた粉末を転送、しっかり密封し、デシケーター内で保存。
- ECMの懸濁製剤
- ECM（泡またはマイクロキャリアのため）のいずれか（フォーム用）ミンチ又はcryomilled 250mgのを秤量し、15mLの遠心分離管に移します。それぞれ、ミンチECMとcryomilled ECMの調製のための1.1.6及びセクション1.2ステップ参照。
注：このプロトコルは、50 mg / mlとECM suspenを準備するように設計されています、シオン人間DAT、ブタDDT、およびブタDLVのために推奨されています。特定ECM源に応じて、均一な懸濁液は、より高いまたはより低い出発濃度で生成することができます。 - 遠心管に緩衝液管上の液体レベルをマーク0.22 MのNaH 2 PO 4（pHは5.4）の5 mLを加え。
- 1 mLの0.22 MのNaH 2 PO 4（pHは5.4）緩衝液にαアミラーゼの7.5ミリグラムを添加することによってαアミラーゼのストック溶液を調製します。試料に、αアミラーゼストック溶液の100μL（w / wの乾燥組織の0.3％のαアミラーゼの0.75 mg）を加えます。 10 mLの最終容積を得るために、0.22 MのNaH 2 PO 4を加えます。
- 室温で72時間、300rpmで連続的に懸濁液を攪拌。
- 10分間1,500×gで懸濁液を遠心。慎重に収集し、消化ECMペレットを乱すことなく、上清を捨てます。 ddH 2 Oで希釈し、5％NaClを10mLのペレット化材料を再懸濁
- ddH 2 O中の5％NaClで2回リンスの合計を繰り返しステップ1.3.5
- 上清を捨て、のddH 2 O 10mlにペレット化材料を再懸濁
- RTで10分間、300rpmで連続的に懸濁液を攪拌。
- 10分間1,500×gで懸濁液を遠心。慎重に収集し、消化ECMペレットを乱すことなく、上清を捨てます。
- ステップ1.3.2で行われた5 mLのマークに0.2M酢酸を加えます。
- 37℃で120 rpmでO / Nで連続懸濁液を攪拌します。
- 目に見える断片が残っていないまで、鋸歯幅10mmプローブを備えた手持ち式ホモジナイザーを用いて10秒間隔で、室温でECM懸濁液を均質化します。過熱を防ぐために、均質化間隔の冷水のビーカー中の懸濁液を置き。
注：ECMのソースに応じて、0.2 M酢酸でさらに希釈、均一な懸濁液を得るために必要とされ得ます。 EECM懸濁液xcessive冷却は、効率的な均質化を妨げる可能性が粘度の増加をもたらすことができます。粘度の増加が注目されている場合、サンプルは37℃まで再加温し、さらなる処理に供することができます。 - 最大1ヶ月前にフォームまたはマイクロキャリア製作に4°Cで保存。
- ECM（泡またはマイクロキャリアのため）のいずれか（フォーム用）ミンチ又はcryomilled 250mgのを秤量し、15mLの遠心分離管に移します。それぞれ、ミンチECMとcryomilled ECMの調製のための1.1.6及びセクション1.2ステップ参照。
2. ECM由来泡沫製作
- 懸濁液が暖かくなるまで120rpmで連続攪拌しながら37℃でステップ1.3.13（みじん切りまたはcryomilled）からECM懸濁液をインキュベートします。
- 所望の濃度に酸性0.2 M酢酸でECM懸濁液を希釈します。
注：DAT、DDT及びDLVの推奨範囲としては50mg / mLの - - 15で、100 mg / mlとECMのソースに依存して、安定した発泡体は、10の範囲に調製することができます。一般的に、より高い濃度で作製した発泡体は、わずかに多孔性の低いが、文化の中でより安定で取り扱いが容易になります。 - 3 mLシリンジWを使用してECM懸濁液中の気泡の形成を防止するために、18 G針i番目、ECM懸濁液と所望の金型を充填します。 DAT、DDT、及びDLV発泡体を製造するために、48ウェル細胞培養処理プレートに35 mg / mlとECM懸濁液400μLを分注します。
注：選択された金型の形状とECM懸濁液の量は、得られる発泡体の形状を決定します。 - カバーとCの冷凍庫°-20℃に置くか、-80で一晩金型を凍結すること。
注：凍結温度は、発泡体の気孔率に影響を与える可能性があります。 -80℃と比較して、サンプルが起因する大きな氷結晶33の形成に-20℃で凍結されたとき、より大きな孔が期待されています。均一な多孔質構造を有する発泡体を製造するために、金型は、指向冷却を防止するために、導電性表面に接触していないことを確認してください。 - 凍結乾燥フラスコに凍結サンプルを含む金型を置きます。 laboratに凍結乾燥フラスコを接続しますORY凍結乾燥機システム、24時間乾燥しました。
注：これは、サンプルは、凍結乾燥の前に凍結されたままであることが重要です。 - 必要になるまでデシケーター中で凍結乾燥した発泡体を保管してください。
エレクトロスプレーを介して、前記ECM由来のマイクロキャリアの作製
注：セットアップエレクトロスプレーの概要は、図2に示されています。
- 100 rpmでO / Nで連続的に攪拌しながら37℃でステップ1.3.13からcryomilled ECM懸濁液をインキュベートします。
注：Cryomilled ECMは、懸濁液中のより高い均一性を確保し、エレクトロスプレー中に目詰まりを防止するために、ECM由来のマイクロキャリアを製造するために使用されます。 - 負荷を3mLルアーロック注射器にECM懸濁液の3mLのシリンジの内径上翼輸液セットを取り付けます。
注：ニードルゲージの範囲は、選択は、得られたマイクロキャリアのサイズおよび形状に影響を及ぼし得ることを認識し、使用することができます。 fabricatへE DAT、DDT、及びDLVマイクロキャリア、25 G針を使用します。 - シリンジポンプ内に注射器を固定します。レトルトスタンドに針を固定し、4の距離で垂直に針の先端を位置決め - 低フォームデュワーフラスコの上部6センチ（250から500 mLのサイズ範囲を推奨します）。
- 針の先端にワニ口クリップ電極を取り付け、高圧電源の正端子に接続。
- 真空フラスコのエッジ上にアルミ箔（12×5センチ）のストリップを折り畳みます。
- ホイルの外側縁部に第二ワニ口クリップ電極を取り付け、電源の接地ソース端子に接続。
- 箔の3/4浸漬されるように、頂部から約1cmまで液体窒素でデュワーフラスコを埋めます。
注：これは、液体窒素で満たされたデュワーフラスコを維持することが重要です。液体窒素の表面は、エレクトロスプレープロセスへ中にフラスコの上部からのNO 2以上cmでなければなりません秒。液体窒素の連続的な補充は、エレクトロスプレー中に一定レベルを維持するために必要とされます。 - 30ミリリットル/ hの注入速度にシリンジポンプを設定します。
注：注入速度は、マイクロキャリアの形状および直径を変更することができる変えることが、推奨範囲は25 - 35ミリリットル/時間。それは、懸濁液の粘度に大きく依存するが、25ミリリットル/時間以下の流量は、より大きなマイクロキャリアの生成をもたらし得ます。非常に低い流量では、マイクロキャリアの大きさや形状はあまり均質になることがあります。 35ミリリットル/ hの上記注入速度で、エレクトロスプレーを介して生成された液滴の均一性は、広いサイズ分布34を有する非球形マイクロキャリアをもたらす、破壊されてもよいです。 - 20キロボルトの電圧を印加し、エレクトロスプレーを開始するために、シリンジポンプをオンにします。
注：電圧を調整するためにマイクロキャリアのサイズを変えるとinfusioより径に大きな影響を有する傾向があることができますn個の割合。 25 kVの - 推奨される電圧範囲は15です。マイクロキャリア直径の減少は、電圧35の増加と予想されます。 - 注入が完了したら、慎重に、彼らは凍結のまま確保するために、液体窒素の〜25ミリリットルに懸濁し、マイクロキャリアを残して、デュワーから過剰な液体窒素をオフに注ぎます。
- 直ちに1つの滑らかな動きに注ぐことにより50mlの遠心管に液体窒素でマイクロキャリアを転送します。薬さじでデュワー内に残っている凍結されたマイクロキャリアを収集し、遠心管に追加します。
注：デュワーのサイズに応じて、液体窒素中でマイクロキャリアは、最初中型容器に注ぎ、次いで、50mLの遠心管に直ちに移すことができます。 - 凍結乾燥のための準備に小さな孔を穿孔アルミニウム箔で液体窒素中でマイクロキャリアを含む遠心管を覆います。
- カバー遠心分離機を配置凍結乾燥フラスコにチューブ。直ちに凍結乾燥機にフラスコを接続し、サンプルO / Nを乾燥させます。
注：これは、解凍が崩壊および/または凝集をもたらすことができるよう、彼らは、このステップの前に解凍していないことを確認するために、液体窒素中に懸濁し、マイクロキャリアを維持することが非常に重要です。サイズが500ミクロン - 上記エレクトロスプレー条件を用いて35mgの/ mLの濃度で作製DAT、DDTとDLVマイクロキャリアは、典型的には、350の範囲の水和直径を有するであろう。サイズ分布は、ECMのソースに依存して変化し得ます。 - 必要になるまでデシケーター中で凍結乾燥されたマイクロキャリアを保管してください。
マイクロキャリアの製造に使用されるエレクトロスプレー装置の図2.概要。 ：シリンジポンプなどの主要エレクトロスプレー機器の配置を示す画像高電圧電源、並びに液体窒素のデュワーに対する針の位置。 B：電圧の推奨範囲を含む概略、注入速度、および距離をエレクトロスプレー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞培養のため4.準備フォームおよびマイクロキャリア
- 再水和
- （：フォームエタノールの1比〜5）過剰の無水エタノール（〜99.9％）を含有する50mLの遠心管に鉗子で凍結乾燥された発泡体を移します。同様に、収集のために使用した元の遠心チューブ内に過剰の無水エタノール中で凍結乾燥マイクロキャリアを再懸濁。血清学的ピペットを使用して、任意の凝集物を除去し、所望のサイズ範囲を選択するために新しい50mlの遠心管に定義されたメッシュサイズを有するステンレスふるいを通してマイクロキャリアをフィルタリングします。
注：フォームはTCPSプレート内に製造されている場合は、これらの容器内で直接再水和させることができます。 - 4時間またはフォームまたはマイクロキャリアまで4℃でインキュベート重力が遠心チューブの底に沈降しました。無菌試薬および適切な無菌技術を使用して、層流フード内のすべての後続のステップを実行します。
- 血清学的ピペットを使用して、無水エタノールを除去し、過剰の追加：足場に（5 1比）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し、95％エタノール。 4時間またはECM由来の足場は再水和容器の底に沈んするまで4℃でインキュベートします。
- 徐々に（滅菌PBSで希釈した90、85、80、75、70、50、25、0％）エタノールシリーズを通して足場を再水和します。足場は、溶液を変更する前に容器の底に沈んまで各ステップで、4℃でインキュベートします。足場内の気泡の形成がOBSある場合、光真空下で足場を脱気erved。
- 残留エタノールを除去するためにさらに2回のリンスのための滅菌PBSを交換してください。
- 細胞培養直前まで4°Cで100％の滅菌PBSで店舗。再水和、次の2週間 - 1以内に足場を使用してください。
- （：フォームエタノールの1比〜5）過剰の無水エタノール（〜99.9％）を含有する50mLの遠心管に鉗子で凍結乾燥された発泡体を移します。同様に、収集のために使用した元の遠心チューブ内に過剰の無水エタノール中で凍結乾燥マイクロキャリアを再懸濁。血清学的ピペットを使用して、任意の凝集物を除去し、所望のサイズ範囲を選択するために新しい50mlの遠心管に定義されたメッシュサイズを有するステンレスふるいを通してマイクロキャリアをフィルタリングします。
- 細胞播種の準備
- 播種の前の日に、細胞培養処理ウェルプレートまたはトランスウェルインサートに鉗子を使用してフォームを転送し、完全に足場（ 例えば、2.5ミリリットル/足場中に水没する（目的の細胞型に基づいて選択される）十分な細胞培養培地を追加12ウェルプレート）。マイクロキャリアへの媒体の1比：同様に、重力マイクロキャリアを慎重に、遠心分離管の中に沈降マイクロキャリアを乱すことなく血清学的ピペットを用いてPBSを除去し、及び5を達成するために、細胞培養培地を加えることを可能にします。
注：人間のASCを播種するために、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を利用：ハムF12栄養混合物を補っ10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン。 - 1回のすすぎの合計細胞培養培地を交換してください。
- 37℃で細胞培養培地中で一晩足場を平衡化。足場は翌日細胞播種のための準備が整います。
注：フォームは静的細胞培養インサートまたは組織培養ウェルプレート29中に播種し、または動的に実験室用振盪器36を用いて播種することができます。 ECM源、処理方法及びサスペンション濃度に応じて、動的播種初期細胞付着、増殖および浸潤を増強することができます。マイクロキャリアは、スピナー培養系11を使用して動的に播種することができます。
- 播種の前の日に、細胞培養処理ウェルプレートまたはトランスウェルインサートに鉗子を使用してフォームを転送し、完全に足場（ 例えば、2.5ミリリットル/足場中に水没する（目的の細胞型に基づいて選択される）十分な細胞培養培地を追加12ウェルプレート）。マイクロキャリアへの媒体の1比：同様に、重力マイクロキャリアを慎重に、遠心分離管の中に沈降マイクロキャリアを乱すことなく血清学的ピペットを用いてPBSを除去し、及び5を達成するために、細胞培養培地を加えることを可能にします。
Representative Results
現在の研究では、技術は、ECMのソース（のように脱細胞化組織のさまざまな方法を使って組織特異bioscaffoldsを生成するために適用することができることを実証している代表的な例として、ヒトDAT、ブタDDT、およびブタDLVを用いてECM由来フォーム及びマイクロキャリアを作製しました図1）。両方の発泡体およびマイクロ製造のために、αアミラーゼ37の解糖酵素とコラーゲンの可溶化の西原技術は、制御された凍結および凍結乾燥手順を経てbioscaffoldsを合成するために使用される脱細胞化組織の出発物質から粘性ECM懸濁液を生成するように適合させました。
発泡体を製造するために、脱細胞化組織は、機械ミンチや酵素消化する前に、表面積を大きくするために低温ミリングのいずれかを通じて処理することができます。以下45は、処理および均質化アミラーゼ、得られたECM懸濁液を、次いで凍結し、凍結乾燥され、ユーザ定義型、に分配します。足場は、長時間にわたって乾燥状態で安定に保存することができます。細胞培養研究に使用する前に、凍結乾燥された足場は、純粋なECM（ 図3A）に由来する多孔性の高い水和均質な発泡体が得られる制御された再水和工程に供されなければなりません。フォームは早すぎる再水和している場合は、迅速な膨潤が整合性と構造的な崩壊の損失が生じ、繊細な構造的特徴を損傷することがあります。一般に、発泡体は、原型次再水和によって定義された形状を保持し、化学的架橋を必要とせずに安定しています。 図3（b） 35 mg / mlとし、-80＆＃の凍結温度の濃度でcryomilled ECMで製造DAT、DDTの代表的な走査型電子顕微鏡（SEM）画像を示しており、DLVは発泡176; C。
図-80℃で35 mg / mlとし、冷凍の濃度でCryomilled ECM懸濁液とDAT、DDT、及びDLV発泡体作製し3.代表的な画像。 ：DAT、DDT、及びDLVの巨視的ビューは、再水和の48ウェル組織培養プレート型で合成発泡体を粉砕しました。スケールバーは1cmに表します。 B：均質な多孔質の超微細構造を示すDAT、DDT、およびDLVフォームのSEM像。スケールバーは100μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
cryomilled ECM懸濁液はまた、 図2（エレクトロスプレー技術によって純粋ECM由来のマイクロキャリアを生成するために使用することができます図4A）以下、直径500μmの-各ECM源、懸濁液濃度、針ゲージ、注入速度、および電圧350の範囲の離散球状マイクロキャリアを生成するように調整することができます。マイクロキャリアは、凍結乾燥状態で保存することができるが、それらをエタノールに再懸濁次分配又は所望のサイズ範囲に篩い分けされていることを取り扱いを容易にするために推奨されます。 SEM画像は、マイクロキャリア微細が脱細胞化組織源（ 図4B）に依存して変化し得ることを示唆しています。
図35 mg / mlと、0.5 mL /分の注入速度、及び20キロボルトの印加電圧の濃度でCryomilled ECM懸濁液とDAT、DDT、及びDLVマイクロキャリア作製し4.代表的な画像。 A：巨視的ビュー0水和DAT、DDT、およびDLVマイクロキャリアF。スケールバーを4mmを表します。 B：超微細構造およびサイズは、ECMのソースに依存して変化し得ることを示すDAT、DDT、及びDLVマイクロキャリアのSEM像。スケールバーは100μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ECMのソースに依存して、処理方法が適用足場の機械的特性（ すなわち、低温ミリングに対してミンチ）、ECM懸濁液濃度、及び凍結温度。一般に、足場は1の範囲のヤング率と、柔らかく準拠して- （ - 50 mg / mlと20）31、および<1 5 kPaでは、DAT（50を100mg / mL）を29とDLVフォームについて報告さマイクロキャリアのためkPaで。 cryomilledフォームは、通常、目の柔らかいです彼らの多くの混乱性質に起因ミンチフォーム。高感度ロードセルを備えた特殊な機械的試験システムは、圧縮特性の正確な特徴付けのために必要とされます。典型的には、フォーム、マイクロキャリアは、酵素消化および均質化、ならびに骨格の非共有結合的に架橋性質を含む製造に関与する追加の処理工程に起因する天然脱細胞化組織よりも低い弾性率を有するであろう。しかし、これは目的の組織によって異なる場合があります。例えば、以前の研究では、ミンチDATが高いECM濃度で作製発泡体（100ミリグラム/ mL）を、天然の脂肪組織29と同様の弾性率を有していたことを見出しました。
再水和ECM由来フォーム及びマイクロキャリアは、 インビトロ細胞培養研究および/ Oのためにセル支持プラットフォームを提供するために、静的または動的な培養条件下で細胞を播種することができますインビボ細胞送達の R。足場は、一般的に細胞接着を支持しながら、播種効率がECM源、足場の幾何学的形状及び多孔度、および目的の細胞型に依存するであろう。このように、播種方法および密度は、ユーザ定義の条件に応じて最適化を必要とするであろう。細胞浸潤を増強するためにオービタルシェーカー上で動的播種して、1×10 6個の細胞/足場-発泡体は、上述のために、我々は、0.25の範囲で出発細胞濃度をお勧めします。スピナー培養フラスコ11の動的条件下で行わ播種して、50,000細胞/マイクロキャリアのMG -マイクロキャリアのために、我々は、25,000の範囲内の初期播種密度を示唆しています。 図1の下部に示す画像は、共焦点マイクロによって可視化されるヒトのASCは、（右、アミン反応性色素で前標識し、13青色現れる）DATフォーム（左）またはDATマイクロキャリア上に播種表します（;スケールバーは100μmで表す生細胞=緑色、死細胞=赤色）蛍光細胞生存性染色を用いSCOPY。共焦点顕微鏡は、厚さ2mmまでの発泡体の表面上に播種された細胞を可視化するために使用することができるが、足場の中央領域に可視化は、その不透明な性質によって制限されます。しかし、フォーム、マイクロキャリアは、組織として扱うことができ、パラフィン包埋または凍結切片組織学的および免疫組織化学のためには、細胞分布およびマーカー発現を可視化するために分析します。
Discussion
2D TCPSに基づく合成足場または標準培養モデルと比較して、一般的に、脱細胞化組織由来bioscaffoldsはより密接に天然の細胞微小環境におけるECMの複雑な3D組成及び構造を近似することができます。前述したように、細胞-ECM相互作用は、培養中及び本体1の両方の細胞挙動の媒介において決定的に重要です。 ECMの、生化学的な生物物理学的、および生体力学的特性は、各組織に特有であることを認識し、だけでなく、より多くの開発に、組織工学のための生体材料の設計に組織特異的なアプローチを適用するための理論的根拠をサポートするための証拠が増加していますin vitro実験20のための生理学的に関連した培養モデル。出発物質として脱細胞化組織を利用して、我々の方法はよりCUST内組織特異ECMの複合組成物を組み込むことができますomizable足場形式。機械的および酵素的処理ステップは、ネイティブのECM微細構造の損失をもたらすであろうが、DATを用いた以前の研究は、bioscaffold組成物が重要なメディエーターであることを示唆し、脂肪由来ECMの有益な効果は、これらの足場形式で保存されていることを実証しました細胞機能11、29の。無傷の脱細胞化組織に比較して、細胞培養基質としてECM由来フォーム及びマイクロキャリアを使用することの重要な利点は、それらが細胞分布および細胞 - 細胞/細胞-ECM相互作用の均一性を向上させることができ、より均一であることです。
ここに記載される方法は、細胞培養および組織工学の用途に使用するための組織特異bioscaffoldsの幅広いアレイを生成するために利用することができます。例えば、DAT、DDT、およびDLVに加えて、私たちの研究室では成功した3D PORを生成するために、これらの技術を適用しています脱細胞化された骨、軟骨、髄核及び線維輪、ならびにウシの腱由来する市販の、不溶性コラーゲンを使用して組織単位フォーム。 インビトロの観点から、これらbioscaffoldsは、細胞生物学、生理学、または疾患病理38を調査するため、ハイスループット薬物スクリーニングプラットフォーム39中の生物活性基質として、または幹用有益マトリックスとして高忠実度の3次元培養モデルの基礎として使用することができます細胞分化40、41。 25の濃度で作製DAT、DDTとDLVフォーム- 50mgの/ mLを（28日まで試験） インビトロ培養で長期的に安定です。少なくとも2週間 - （15回転10）さらに、マイクロキャリアの全ての3つのタイプは、低剪断スピナー培養系における動的条件下で細胞の付着および増殖を支持することができます。 in vivoでのアプリケーションのために、生体適合性およびbiodegradaBLE ECM由来フォーム及びマイクロキャリアは、建設的な組織リモデリングおよび再生11、29を刺激するために、既製品としての約束を保持します。さらに、細胞接着足場は、細胞療法送達システム42、43として使用することができます。例として、DATフォームは、同種のASCを播種し、免疫応答性ラットモデル29に皮下移植したときに、血管新生および脂肪生成を促進することが示されました。無傷DATに対して、より高度に処理されたDATは、体積で50％減少して、はるかに急速に分解発泡彼らは12週間宿主組織、およびほぼ完全な吸収と一体になったように3週間で認め。しかし、発泡体はまた、酵素消化したECMは、ユニークなプロ再生効果を持っていたことを示唆し、より強力な血管新生応答を誘導しました。同様に、ECM由来のマイクロキャリアは、インビトロとして使用することができます</ em>の動的培養システム内で細胞培養基質とのような注射可能細胞送達媒体11、30、44。細胞生存率を支持し、注射30の部位における細胞の保持を増大させるのに役立つことができるマトリックスを提供しながら、より具体的には、小直径およびマイクロキャリアの大きな表面積は、小さな体積中の細胞の大量の供給を可能にすることができます。任意の生きているシステムで使用する前に、ソースECMが負のホスト応答7を引き起こす可能性抗原の細胞成分及び/又は潜在的に傷害性脱細胞化試薬を実質的に欠いていることを確実にするために重要です。
タンパク質分解酵素ペプシンは、一般にECM由来ヒドロゲル15の製造に使用されます。ペプシンはint型コラーゲンおよび他のECMタンパク質を消化する非特異的プロテアーゼでありますO小さな断片45。ペプシン消化ECMから製造さヒドロゲルが細胞有益な効果を有することが報告されているが、制限は、これらの材料は、46非常に機械的に脆弱である傾向があることです。 DATマイクロキャリアの当初の開発において、我々は、ペプシン消化DATがアルギン酸塩と混合し、球状のビーズ30を形成するためのCaCl 2中に滴下して添加した複合的なアプローチを利用しました。ビーズは、その後、光架橋したアルギン酸塩は、クエン酸ナトリウムを用いて抽出しました。 950μmの30 -化学的架橋の要件に加えて、キー制限は、このアプローチを用いて製造マイクロキャリア900のサイズの範囲より低い安定性を有していたことでした。ペプシンの代わりに、ここで提示される方法はtelopeから炭水化物基を開裂すると仮定されているαアミラーゼ糖分解酵素とECMのより軽度の消化を利用しますコラーゲンのptide領域は、それによって酢酸37中での溶解度を増加させます。このアプローチは、化学的架橋または他の添加剤を必要とせずに、純粋なECM由来フォーム及びマイクロキャリアを生成するために使用することができる高重合コラーゲンの単離を可能にします。これらのbioscaffoldsは、ネイティブのECMの微小環境におけるコラーゲンに似てよく保存コラーゲン線維の間の物理的相互作用および水素結合によって安定化されています。
発泡体は、選択された特定の型に応じて幾何学形状の広い範囲で製造することができる非常に柔軟なプラットフォームです。細胞培養研究のために、発泡体は、様々な厚さのコーティングまたは3D足場を形成するために、TCPSウェルプレート中で直接鋳造することができます。非常に均一な表面を有する3次元発泡体を作製するには、カスタム型は、プラスチックまたはガラススライドで両側にシールすることができるように設計することが推奨されます。どちらのみじん切りやcryomilled ECMを合成するために使用することができます発泡体。一般的に、我々はcryomilledフォームは肉眼で柔らかくなると、より低い濃度31、36でより多くの混乱超微細構造を持っている傾向があることを発見しました。組織供給源に応じて、追加の機械的処理ステップは、細胞の機能に影響を与える可能性がECM組成の変化を引き起こし得ます。たとえば、私たちの前の仕事では、ラミニンはみじん切りDLVフォームで検出されたが、DLVは31を発泡cryomilledいませんでした。対照的に、コラーゲンI、コラーゲンIV、ラミニン、およびフィブロネクチンは、両方のミンチとDAT 36を発泡cryomilledで検出されました。機械的処理ステップに加えて、発泡体の気孔率、気孔径がECM懸濁液濃度と凍結温度47を変化させることによってある程度調整することができます。一般に、低濃度のフォーム（〜10から15 mg / mlと）定性的に、より多孔性であるが、急速に収縮および乏しい有していてもよいです長期培養31、36で安定。同様に、典型的にはより高い凍結温度によって達成遅い凝固速度は、により製造29の間に形成される氷結晶のサイズとフォームに大きな孔をもたらすことができます。これらのパラメータの全ては、添付ファイル、浸潤、およびリモデリングを含む、材料と細胞の相互作用に影響を及ぼし得ます。例えば、より高いECM濃度で製造されたフォーム上の細胞増殖は、特にミンチECM源とし、静的培養条件36の下で、表面領域に限定することができます。
マイクロキャリアのために、調整することができる重要なパラメータは、ECM懸濁液濃度、針ゲージ、及びより高い濃度は、典型的には、長期動的培養下でより安定であるマイクロキャリアを生じると、電圧が印加されます。エレクトロスプレーの開始後、ECMのsuspensイオン滴は迅速にアルミニウム箔集電体の方向に向かって、フラスコの中心に落ちるべきです。凝集を防止するためには、ビーズは前箔に液体窒素を連絡することが重要です。針及び液体窒素の表面との間の距離は、これらの要件を満たすように調整することができます。その最適化は安定bioscaffoldsを生成する濃度範囲を選択する際に、特に、各特定ECM源の特性に応じて必要な場合があり注意することが重要です。別の重要な要因は、ECMを分解または残存試薬（ 例えば、界面活性剤）の存在は負得られた発泡体およびマイクロキャリアの安定性に影響を与える可能性脱細胞化の方法として、出発物質を生成するために使用される脱細胞化プロトコルです。課題はbioscaffold安定性に直面している場合は、調べることができるオプションは、ECMのSUSPを増やし、より緩やかな再水和プロセスを使用することを含んでension濃度、およびcryomilled ECM対みじん切り探ります。これらのオプションのすべての問題を解決するために失敗すると、脱細胞化プロトコルやECM源の代替を検討する必要があるかもしれません。
足場の製造時の再現性を確保するために、特別なケアは、プロトコルにおける特定のステップで取られなければなりません。脱細胞化組織を低温ミリング場合は、粉砕は、環境からの水分の吸収に起因する粒子の凝集の可能性を減らすために、すぐに乾燥した環境で、凍結乾燥後に実施することが推奨されます。マイクロ製造中、針の目詰まりをもたらすことができる、サンプル冷却の問題を回避するために、懸濁液を3mLの最大体積で、小バッチでエレクトロスプレーされることが示唆されます。さらに、マイクロキャリアは、エレクトロスプレー処理後に解凍することが許可されていないことが不可欠です。その球状の形状と機械的安定性、microcarriを維持するために、ERSは、液体窒素を充填した容器内に搬送され、液体窒素から回収し、直ちに凍結乾燥されるべきです。最後に、フォームおよびマイクロキャリアの両方のために、再水和ステップは、複数日の期間にわたってゆっくりと実行されていることが重要です。急速な再水和は、マクロ及び/又はミクロスケールでの構造的崩壊をもたらすことができます。さらに、再水和は、光を真空下で脱気にかなりの時間を必要とすることが足場内の小さな気泡の形成を防止するためにゆっくりと行われなければなりません。
結論として、本論文で提示される方法は、純粋な、非化学的に架橋ECMからなる組織特異フォーム及びマイクロキャリアの多様なアレイを製造するために使用することができます。生物学的研究のための利点はbioscaffoldsは取り扱いが容易であり、そのような組織学、免疫組織化学、または遺伝子およびタンパク質発現アッセイなどの技術を用いて分析を行う際の組織と同様に処理することができることです。また、ECM由来足場を播種細胞集団を抽出する酵素的に分解することができ、又は生分解性および生体適合性の細胞送達ビヒクルとして直接使用することができます。全体的に、この柔軟なプラットフォーム技術は、細胞増殖基質として、そしてプロ再生bioscaffoldsとして、細胞の機能を調査し、3D細胞培養研究のために含む多数のアプリケーションのために偉大なユーティリティを保持しています。
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
| Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| α-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
| Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 & 50 mL centrifuge tubes |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
| Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
| Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
| DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
| Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 - 500 mL |
| Double distilled water (ddH2O) | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
| D-PBS (Phosphate-buffered Saline) | Wisent | 311425125 | |
| ECM (Extracellular Matrix) | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
| Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
| Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
| Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
| Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
| Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8,000 - 30,000 rpm |
| Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 x 95 mm |
| Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
| Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
| Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
| Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
| 18 G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
| Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
| Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
| Retort stand | VWR | 470019-526 | |
| Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
| Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL Luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
| Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
| Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
| Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
| High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
| Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4" recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |
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