Summary
Det vev-spesifikk ekstracellulære matriks (ECM) er en viktig formidler av cellefunksjon. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for syntese av rent, ECM-avledede skum og mikrobærere som er stabile i kultur uten behov for kjemisk tverrbinding for anvendelser i avansert 3D in vitro cellekultur modeller eller som pro-regenerative bioscaffolds.
Abstract
Cellefunksjon medieres ved interaksjon med ekstracellulære matriks (ECM), som har komplekse vev-spesifikke sammensetning og arkitektur. Fokuset i denne artikkelen er på metoder for tilvirkning av ECM-avledet porøst skum og mikrobærerne for bruk som biologisk relevante substrater i avanserte 3D-in vitro-cellekulturmodeller eller som pro-regenerative stillasene og celleavleveringssystemer for vevsteknologi og regenerativ medisin. Ved hjelp av decellularized vev eller renset uløselig kollagen som et utgangsmateriale, kan de teknikker som anvendes for å syntetisere et bredt utvalg av vevs-spesifikke bioscaffolds med tilpassbare geometrier. Fremgangsmåten innbefatter mekanisk bearbeiding og mild enzymatisk spalting under dannelse av en ECM suspensjon som brukes for å fremstille de tredimensjonale skum eller mikrobærere gjennom kontrollert frysing og frysetørringsfremgangsmåter. Disse rene ECM-avledet stillasene er meget porøs, men likevel stabil uten behov for Chemical tverrbindingsmidler eller andre additiver som kan negativt påvirke cellefunksjonen. Stillaset egenskaper kan være innstilt i en viss grad ved å variere faktorer som for eksempel ECM suspensjon konsentrasjon, mekaniske bearbeidingsmetoder, eller syntesebetingelsene. Generelt er de stillasene er robuste og enkle å håndtere, og kan bli behandlet så vev for de fleste standard biologiske analyser, noe som gir en allsidig og brukervennlig 3D cellekultur plattform som etterligner det naturlige ECM sammensetningen. Samlet disse enkle fremgangsmåter for tilvirkning av tilpassede ECM-avledede skum og Mikrobærerne kan være av interesse for både biologer og biomedisinske ingeniører som vevs-spesifikke cellerikt plattformer for in vitro og in vivo anvendelser.
Introduction
Den ekstracellulære matriks (ECM) består av et kompleks 3D-nettverk av proteiner, glykoproteiner og polysakkarider 1. En gang ble betraktet som en overveiende konstruksjons-rammeverk, er det nå velkjent at ECM inkorporerer et variert utvalg av bioaktive molekyler med viktige funksjonelle roller 2. Celle-ECM-interaksjoner kan direkte celleoverlevelse, adhesjon, migrasjon, proliferasjon, differensiering og tre. Mens hovedklasser av ECM makromolekyler er generelt godt konservert over vev og arter, har hvert vev en entydig matrise sammensetning og arkitektur 4. Totalt er den vevsspesifikke ECM en instruktiv mikromiljø som medierer funksjon fra den subcellulære til vev / organ skala 5.
På grunn av den kritiske rollen til ECM i formidling cellular funksjon, har det vært økende interesse for degen av ECM-avledet bioscaffolds for bruk i tissue engineering og regenerativ medisin. Spesielt er fremgangsmåten ifølge decellularization blitt omfattende undersøkt som et middel for å oppnå ECM fra et bredt spekter av vev for anvendelse som en stillasmateriell for vevsregenerering og celle levering 5, 6, 7. Decellularization innebærer vanligvis en rekke av mekaniske, kjemiske og / eller biologiske behandlingstrinn som er rettet mot fjerning av celler og cellulære komponenter, mens en ideell forårsaker minimale endringer i 3D-strukturen og sammensetningen av ECM 8. Gjennom kartlegging litteraturen, kan ulike decellularization protokoller bli identifisert for nesten alle vev i kroppen 7.
Mens decellularized vev kan anvendes direkte som implanterbare stillas eller 3D-cellekultur-substrater, kan cellulær infiltrasjonvære begrenset i vev med et tett ECM struktur 9. Videre kan den naturlige heterogenitet i ECM forårsake variasjon i cellefesting og distribusjon innenfor decellularized matrisene, noe som potensielt kan påvirke den cellulære respons 10. Totalt sett, mens lovende for noen anvendelser å anvende decellularized vev i sin intakt form gir begrenset fleksibilitet når det gjelder avstemningsstilla egenskaper, inkludert form, porøsitet og stivhet, så vel som leveringsmåten for in vivo applikasjoner.
For å omgå disse begrensninger er en rekke forskningsgrupper påføre ytterligere prosesseringsmetoder for å generere tilpassede stillas formater ved hjelp av decellularized vev som et basismateriale. I den enkleste formen, kan det dreie seg cryomilling de decellularized vev til å danne injiserbare vevsspesifikke ECM-partikler 11. Disse ECM-partikler kan bli inkorporert som en celle-instrumentctive komponent i kompositt stillaser med andre biomaterialer, for eksempel in situ kryssbinding av hydrogeler 12, 13, 14. I tillegg til mekanisk bearbeiding, kan decellularized vev også bli utsatt for enzymatisk nedbrytning med proteolytisk og / eller glykolytiske enzymer å fremstille ECM-avledet hydrogeler, skum, mikrobærere, og beleggene 15, 16, 17, så vel som for å syntetisere bioinks for 3D-utskrift 18.
I tillegg til vev-tekniske anvendelser, ECM-avledet bioscaffolds stort potensial med henblikk på generering av høyere fidelity in vitro-modeller for biologisk forskning. Det er et betydelig behov for å utvikle 3D-cellekultursystemer som bedre rekapitulere de innfødte mobilmikro 19. De fleste in vitro-cell kulturstudier hittil er utført på vevskulturpolystyren (TCPS), som har liten sammenheng med den biologisk sammensatt og dynamisk cellulære miljø innenfor levende vev 20. Mens det er praktisk for å studere cellulære interaksjoner i et kontrollert miljø, å dyrke cellene på følgende forenklede stive 2D substrater endrer cellebinding og morfologi, så vel som både celle-celle og celle-interaksjoner ECM 21, 22. De cellulære tilpasninger observert på 2D TCPS kan påvirke intracellulære signalveier som regulerer forskjellige cellefunksjoner overlevelse, proliferasjon, migrering og differensiering, heve spørsmål om relevansen av 2D studier i modellsystemer in vivo 23. Det har vært en økende erkjennelse av at celle oppførsel kan variere sterkt i 2D-3D-systemer sammenlignet med 24, og det biokjemiske og biomechanical signalering med ECM-er viktige mediatorer for cellefunksjon 25. Mange grupper har forsøkt å overvinne begrensninger av etablerte 2D systemer ved å belegge TCPS med ECM-komponenter så som kollagen, laminin og fibronektin. Selv om disse strategiene kan forbedre cellebinding og kan endre cellulære responser, forblir disse modellene begrenset av deres 2D konfigurasjon som hermer ikke den komplekse romlige organisasjon eller biokjemi av det native ECM 26, 27.
Våre laboratorie bioteknologi har vært interessert i utvikling av ECM-avledet bioscaffolds som substrater for 3-D cellekultur og vev-tekniske anvendelser. Spesielt har vi banebrytende bruken av decellularized fettvev (DAT) som et stillas plattform for adipose regenerering 28. Videre har vi etablert metoder for å syntetisere 3D-mikrobærere og porøse skum under anvendelse av DAT spaltet med det proteolytiske enzym pepsin eller glykolytisk enzym α-amylase 29, 30, 31. Spesielt har vi demonstrert i alle disse stillas formater som adipose-avledet ECM gir en induktiv mikromiljø for adipogene differensiering av human adipose-avledet stammen / stromale celler (ASCs) i kultur. Mer nylig utvidet vi fremstillingsmetoder til å frembringe 3D-porøst skum fra α-amylase-spaltet fra svin decellularized venstre ventrikkel (DLV) (decellularization metoder tilpasset fra Wainwright et al. 32), og viste at de gir en støttende plattform for å indusere tidlig cardiomyogenic markør ekspresjon i humane pericardial fettavledet ASCer 31.
Denne artikkelen beskriver i detalj metoder for å syntetisere ikke-kjemisk tverrbundne 3D porøst skum og mikrobærere avledet utelukkendefra α-amylase-spaltet ECM for bruk som biologisk kompleks 3D-in vitro-cellekultur substrater og som biomaterialer for vevsregenerering. I teorien kan hvilken som helst kilde som inneholder ECM høy molekylvekt kollagen anvendes som utgangsmateriale for disse teknikkene. For å vise fleksibiliteten av denne tilnærmingen, har fremgangsmåter blitt anvendt for å generere vevsspesifikke bioscaffolds anvendelse av humant DAT, porcine decellularized hudvevet (DDT) 8, og porcine DLV som representative eksempler. Figur 1 gir en visuell oversikt over fabrikasjonsprosessen for ECM-avledede skum og mikrobærere.
Figur 1. Oversikt over Fremgangsmåte for fremstilling av vevs-spesifikke ECM-avledede skum og Mikrocarriers. 1. Decellularized vev, fremstilt ved å følge etablert retardasjonlularization protokoller kan anvendes for vev-spesifikk ECM-avledet bioscaffold fabrikasjon. Makroskopiske bilder vises av hydratisert human DAT (fremstilt som beskrevet i Flynn 2.010 28), svine-DDT (fremstilt som beskrevet i Reing, JE, et al., 2010 8), og porcint DLV (fremstilt som beskrevet i Wainwright et al. 2010 32 ), som representative eksempler på ECM kilder som kan brukes som utgangsmaterialer. Skala stolper representerer 3 cm. 2. decellularized vev lyofiliseres, og deretter 3. mekanisk hakket. Skala stolper representerer 1 cm. 4. Det finhakkede ECM kan deretter cryomilled, som er valgfri for skum fabrikasjon, men som er nødvendig for mikrobæreren syntese. Skalastolpe representerer 3 mm. 5. hakket eller cryomilled ECM blir deretter spaltet med α-amylase og homogenisert for å skape en homogen suspensjon ECM. Skalastolpe betegner 1 cm.
Protocol
1. Decellularized Tissue Processing
- Decellularization og Frysetørking
- Decellularize vev (ene) av interesse å følge en etablert protokoll.
MERK: Stillas i denne studien er utarbeidet følgende publiserte decellularization protokoller for human DAT 28, svin DDT 8, og svin DLV 32. Kommersielt tilgjengelige, uløselige kollagen kan også brukes til å fremstille skum og mikrobærere, så som kollagen hentet fra bovin sene, som har vært brukt med hell over et konsentrasjonsområde av 10 - 50 mg / ml. Andre uløselige kollagenkilder kan anvendes, men kan kreve optimalisering for å identifisere det konsentrasjonsområdet som vil gi stabile stillaser. - Overfør den hydratiserte decellularized vev eller renset kollagen inn i et 50 ml sentrifugerør med pinsett og tilsett tilstrekkelig dobbeltdestillert vann (DDH 2 O) for å senke vev, toa maksimale totale volum på 35 ml.
- Fryse prøven over natten ved -80 ° C, med sentrifugerøret horisontalt ved frysing for å maksimere overflatearealet til sublimasjon under etterfølgende frysetørking.
- Fjerne hetten fra sentrifugerøret og overfører den frosne prøve inn i en frysetørrings krukke.
- Lyofiliser prøven ved bruk av en laboratorie-frysetørker i 48 - 72 timer eller inntil fullstendig tørket.
MERK: Tørketiden kan variere for ulike lyophilizers og decellularized vev. - Fint hakke det frysetørkede ECM i små stykker (~ 1 - 2 mm 3) med skarpe kirurgiske sakser.
- Oppbevar hakket ECM i et tørke til den er klar for videre behandling.
NB: Det anbefales at det hakkede ECM bli brukt umiddelbart for å hindre opptak av fuktighet fra omgivelsene.
- Decellularize vev (ene) av interesse å følge en etablert protokoll.
- Cryomilling (valgfritt for skum fabrikasjon)
- Fylle en 25 ml rustfri stål malekammeret i et laboratoriumry ball mølle system med hakket lyofilisert ECM og tilsett to rustfrie fresekuler 10 mm.
- Nær og fullstendig neddykke den belastede malekammeret i flytende nitrogen i 3 min.
- Mølle den frosne prøven i 3 min ved 30 Hz (1800 rpm).
- Gjenta trinn 1.2.2 og 1.2.3 til ECM males til et fint pulver.
MERK: Antall ganger disse trinnene bør gjentas kan variere mellom ECM kilder. For eksempel, DAT krever vanligvis 3 frese sykluser for å frembringe et fint pulver. - Overfør pulveret ved hjelp av en scoopula inn i en glassflaske og slutter tett, og lagre i en eksikator.
- ECM suspensjonspreparat
- Vei ut 250 mg av enten hakket (for skum) eller cryomilled (for skum eller mikro) ECM og overføre den til et 15 ml sentrifugerør. Se trinn 1.1.6 og avsnitt 1.2 for fremstilling av finhakket ECM og cryomilled ECM, henholdsvis.
MERK: Denne protokollen er utformet for å fremstille en 50 mg / ml ECM suspension, som er anbefalt for human DAT, svin DDT, og porcine DLV. Avhengig av den spesifikke ECM kilden kan ensartede suspensjoner bli generert ved høyere eller lavere utgangskonsentrasjon. - Tilsett 5 ml av 0,22 M NaH 2PO 4 (pH 5,4) buffer til sentrifugerøret og markerer væskenivået i røret.
- Fremstill en α-amylase stamløsning ved tilsetning av 7,5 mg av α-amylase til 1 ml 0,22 M NaH 2PO 4 (pH 5,4) buffer. Tilsett 100 ul av den α-amylase stamløsning (0,75 mg α-amylase, 0,3% vekt / vekt av tørr vev) til prøven. Legg 0,22 M NaH 2PO 4 for å oppnå et sluttvolum på 10 ml.
- Suspensjonen ble omrørt kontinuerlig ved 300 rpm i 72 timer ved romtemperatur.
- Sentrifuger suspensjonen ved 1500 xg i 10 min. Samle forsiktig og kast supernatanten uten å forstyrre den spaltede ECM pellet. Resuspender pelleterte materialet i 10 ml av 5% NaCl fortynnet i DDH 2 O.
- Gjenta trinn 1.3.5 for en total av to skyllinger med 5% NaCl i DDH 2 O.
- Kast supernatanten og resuspender den pelleterte materialet i 10 ml DDH 2 O.
- Suspensjonen ble omrørt kontinuerlig ved 300 rpm i 10 min ved RT.
- Sentrifuger suspensjonen ved 1500 xg i 10 min. Samle forsiktig og kast supernatanten uten å forstyrre den spaltede ECM pellet.
- Tilsett 0,2 M eddiksyre til 5 ml merket i trinn 1.3.2.
- Suspensjonen ble omrørt kontinuerlig ved 120 opm O / N ved 37 ° C.
- Homogen ECM suspensjonen ved romtemperatur i ti-sekunders intervaller ved bruk av en hånd-holdt homogenisator utstyrt med en sagtann 10 mm bred sonde inntil ingen synlige fragmenter forbli. Plassere suspensjonen i en beholder med kaldt vann mellom homogenisering intervaller for å forhindre overoppheting.
MERK: Avhengig av ECM kilde, kan det kreves ytterligere fortynning i 0,2 M eddiksyre for å oppnå en homogen suspensjon. Excessive avkjøling av ECM-suspensjonen kan resultere i en økning i viskositeten som kan forstyrre effektiv homogenisering. Hvis en økning i viskositet er kjent, kan prøven bli gjenoppvarmet til 37 ° C og utsatt for ytterligere prosessering. - Oppbevar ved 4 ° C i opp til en måned før skum eller mikrobærer fabrikasjon.
- Vei ut 250 mg av enten hakket (for skum) eller cryomilled (for skum eller mikro) ECM og overføre den til et 15 ml sentrifugerør. Se trinn 1.1.6 og avsnitt 1.2 for fremstilling av finhakket ECM og cryomilled ECM, henholdsvis.
2. ECM-avledete skum Fabrication
- Inkuber ECM suspensjonen fra trinn 1.3.13 (hakket eller cryomilled) ved 37 ° C med kontinuerlig omrøring ved 120 rpm inntil suspensjonen er varm.
- Fortynn ECM suspensjon i 0,2 M eddiksyre sur til den ønskede konsentrasjon.
MERK: Avhengig av ECM kilde, stabile skum kan fremstilles i området av 10 - 100 mg / ml, med 15-50 mg / ml som den anbefalte området for DAT, DDT og DLV. Typisk vil skum fremstilt ved høyere konsentrasjoner være litt mindre porøs, men mer stabil i kultur og lettere å håndtere. - Ved hjelp av en 3 ml sprøyte wed en 18 G nål for å hindre bobledannelse i ECM-suspensjon, fylle den ønskede formen med ECM suspensjon. For å fremstille den DAT, DDT, og Dlv skum, dispensere 400 ul av 35 mg / ml ECM suspensjonen i en 48-brønn cellekultur-behandlet plate.
MERK: formen på det valgte formen og volumet av ECM suspensjon vil bestemme geometrien av det resulterende skummet. - Dekk og fryse formene over natten ved å plassere dem i en -20 ° C eller -80 ° C fryser.
MERK: Frysetemperaturen kan påvirke porøsiteten av skummene. Større porer er forventet når prøvene er dypfryst ved -20 ° C sammenlignet med -80 ° C på grunn av dannelsen av store iskrystaller 33. For å fremstille skum med en jevn porøs struktur, sikre at formen ikke er i kontakt med en ledende overflate for å hindre at retnings kjøling. - Plasser de former som inneholder de frosne prøver i en lyofilisator kolbe. Koble lyofiliseringsanordningen kolbe til Laboratory frysetørker system og tørke i 24 timer.
MERK: Det er viktig at prøven forblir frosset før frysetørking. - Oppbevar lyofiliserte skum i eksikator inntil nødvendig.
3. ECM-avledet Mikrobærere Fabrication via Electrospraying
MERK: En oversikt over electrospraying satt opp er vist i figur 2.
- Inkuber cryomilled ECM suspensjonen fra trinn 1.3.13 ved 37 ° C med kontinuerlig omrøring ved 100 opm O / N.
MERK: Cryomilled ECM brukes for å fremstille de ECM-avledet mikrobærerne for å sikre større ensartethet i suspensjon, og hindre tilstopping under electrospraying. - Belastning 3 ml av ECM suspensjon inn i en 3 ml sprøyte med Luer-lås og feste en bevinget infusjonssettet på boringen i sprøyten.
MERK: En rekke nål målere kan benyttes, erkjenner at valg kan påvirke størrelsen og formen av de resulterende mikrobærerne. til fabricate DAT, DDT, og Dlv mikrobærere ved å bruke en 25 G nål. - Feste sprøyten inne i sprøytepumpe. Feste nålen til en retorte stativ og plasser nålespissen vertikalt i en avstand på 4 - 6 cm fra toppen av en lav-skjema Dewar-kolbe (250 - 500 ml størrelsesområde anbefalt).
- Fest en krokodilleklemme elektrode til spissen av nålen og koble den til den positive terminalen på den høyspente kraftforsyning.
- Brett en strimmel av aluminiumfolie (12 x 5 cm) over kanten av den termosflaske.
- Feste en andre krokodilleklemme elektrode til den ytre kant av folien og koble den til berg klemme på strømforsyningen.
- Fyll Dewar kolbe med flytende nitrogen til omtrent 1 cm fra toppen, slik at? Av folien er under vann.
Merk: Det er viktig å holde Dewar-kolbe fylt med flytende nitrogen. Overflaten av det flytende nitrogenet må ikke være mindre enn 2 cm fra toppen av kolben i løpet av electrospraying process. Kontinuerlig påfylling av den flytende nitrogen som kreves for å opprettholde et konstant nivå i løpet av electrospraying. - Still sprøytepumpe til en infusjonshastighet på 30 ml / time.
MERK: Varierende infusjonshastigheten kan endre mikro form og diameter, men det anbefalte området er 25 - 35 ml / time. Selv om det er sterkt avhengig av viskositeten av suspensjonen, kan strømningshastigheter under 25 ml / t, resultere i dannelsen av større mikrobærere. Ved svært lave strømningshastigheter, kan størrelsen og formen på mikrobærerne blir mindre homogen. Ved infusjonshastigheter på over 35 ml / t, kan jevnheten av dråpene som genereres via electrospraying bli forstyrret, noe som resulterer i ikke-kuleformede mikrobærere med en bredere størrelsesfordeling 34. - Anvende en spenning på 20 kV og skru på sprøytepumpen for å initiere electrospraying.
MERK: Spenningen kan varieres for å justere størrelsen av mikrobærerne og har en tendens til å ha en større innvirkning på den diameter enn infusion hastighet. Den anbefalte spenningsområdet er 15 til 25 kV. En reduksjon i mikro diameter er forventet med en økning i spenning 35. - Når infusjonen er fullført, forsiktig helle av overskytende flytende nitrogen fra Dewar, forlater mikrobærerne suspendert i ~ 25 ml av flytende nitrogen for å sikre at de forblir frosset.
- Umiddelbart overføre mikrobærerne med flytende nitrogen inn i et 50 ml sentrifuge-rør ved å helle den i en jevn bevegelse. Samle eventuelle frosne mikrobærere som er igjen i Dewar med en scoopula og legge dem til sentrifugerøret.
MERK: Avhengig av størrelsen på Dewar, kan mikrobærerne i flytende nitrogen å begynne med være helt inn i en mellomstor fartøy, og deretter overført umiddelbart inn i 50 ml sentrifuge-rør. - Dekk til sentrifugerør som inneholdt mikrobærerne i flytende nitrogen med aluminiumsfolie perforert med små hull i forberedelse for lyofilisering.
- Plasser dekket sentrifugerør i en lyofilisator kolbe. koble umiddelbart kolben til frysetørkeapparatet og tørke prøvene O / N.
Merk: Det er meget viktig å holde mikrobærerne som er suspendert i flytende nitrogen for å sikre at de ikke tine før dette trinnet, da tining kan føre til sammenbrudd og / eller aggregering. DAT, DDT og Dlv mikrobærere fremstilt ved en konsentrasjon på 35 mg / ml ved anvendelse av electrospraying betingelsene beskrevet ovenfor, vil typisk ha en hydratisert diameter i området mellom 350 til 500 um i størrelse. Størrelsesfordelingen kan variere avhengig av ECM kilde. - Oppbevar frysetørrede mikro i eksikator inntil nødvendig.
Figur 2. Oversikt over Electrospraying apparat som brukes i Mikrobærere Fabrication. A: Bildet viser arrangementet av de viktigste electrospraying utstyr inkludert sprøytepumpenog høyspennings-kraftforsyning, så vel som posisjoneringen av nålen i forhold til Dewar av flytende nitrogen. B: Electrospraying skjematisk, inkludert de anbefalte grenser for den spenning, infusjonshastighet og avstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. fremstilling av skum og Mikrocarriers for Cell Culture
- rehydrering
- Overfør de lyofiliserte skum med tang inn i et 50 ml sentrifugerør inneholdende overskudd av absolutt etanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 forhold mellom etanol og skummer). På lignende måte, resuspender de lyofiliserte mikrobærerne i overskudd absolutt etanol i løpet av den opprinnelige sentrifugerøret anvendes til avhenting. Ved hjelp av en serologisk pipette, filtrere mikrobærerne gjennom en rustfri sikt med en maskestørrelse definert inn i en ny 50 ml sentrifugerør for å fjerne eventuelle aggregater og selektere for de ønskede størrelsesområder.
MERK: Hvis skummet er fabrikkert innen TCPS plater, kan de bli rehydrert direkte i disse fartøyene. - Inkuber ved 4 ° C i 4 timer eller inntil skumstoffene eller mikrobærerne må tyngdekraften sank ned til bunnen av sentrifugerøret. Utføre alle etterfølgende trinn i en laminær strømningshette ved hjelp av sterile reagenser og av egnet aseptisk teknikk.
- Fjern det absolutt etanol ved hjelp av en serologisk pipette og tilsett overskudd av (5: 1 forhold) 95% etanol ble fortynnet med steril fosfatbufret saltløsning (PBS) til stillasene. Inkuber ved 4 ° C i 4 timer eller inntil ECM-avledede stillasene har sunket til bunnen av rehydratisering fartøyet.
- Gradvis rehydrere stillasene gjennom en etanolserie (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 og 0%, fortynnet med steril PBS). Ved hvert trinn, inkuber ved 4 ° C inntil stillasene har sunket til bunnen av beholderen før å endre oppløsningen. Avgasse stillasene under lett vakuum, hvis bobledannelse i stillasene er observed.
- Sett på steril PBS i ytterligere to skyllinger for å fjerne gjenværende etanol.
- Lagres i 100% steril PBS ved 4 ° C inntil de er klare for celledyrking. Bruk stillasene innen 1 - 2 uker etter rehydrering.
- Overfør de lyofiliserte skum med tang inn i et 50 ml sentrifugerør inneholdende overskudd av absolutt etanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 forhold mellom etanol og skummer). På lignende måte, resuspender de lyofiliserte mikrobærerne i overskudd absolutt etanol i løpet av den opprinnelige sentrifugerøret anvendes til avhenting. Ved hjelp av en serologisk pipette, filtrere mikrobærerne gjennom en rustfri sikt med en maskestørrelse definert inn i en ny 50 ml sentrifugerør for å fjerne eventuelle aggregater og selektere for de ønskede størrelsesområder.
- Forberedelse til Celleutsåing
- På dagen før såing, overføre skum under anvendelse av pinsett inn i cellekultur behandlet brønn plater eller transwell innsatser og tilsett tilstrekkelig cellekulturmedium (valgt på grunnlag av den celletype av interesse) for fullstendig å nedsenke stillasene (for eksempel 2,5 ml / stillas i en 12-brønns plate). Likeledes tillater mikrobærerne til tyngdekraften slå seg ned inne i sentrifugerøret, fjern forsiktig PBS ved hjelp av en serologisk pipette uten å forstyrre de mikrobærerne, og legge til cellekulturmediet for å oppnå et 5: 1 forhold av middels til mikrobærerne.
NB: For såing humane ASCer, utnytte Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM): Hams F12 næringsblanding supplert med10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. - Sett på cellekulturmediet for en total av en skylling.
- Ekvilibrer stillasene over natten i celledyrkningsmedium ved 37 ° C. Stillasene vil være klar for celle seeding neste dag.
MERK: Skummene kan være statisk podet i celledyrkningsinnsatser eller vevskultur-brønners plater 29, eller dynamisk podet ved anvendelse av en laboratorierister 36. Avhengig av ECM kilde, bearbeidingsmetoder og suspensjon konsentrasjonen kan dynamisk seeding forbedre initielle cellefesting, proliferasjon og infiltrasjon. Mikrobærerne kan podes dynamisk ved hjelp av en spinnerkultur systemet 11.
- På dagen før såing, overføre skum under anvendelse av pinsett inn i cellekultur behandlet brønn plater eller transwell innsatser og tilsett tilstrekkelig cellekulturmedium (valgt på grunnlag av den celletype av interesse) for fullstendig å nedsenke stillasene (for eksempel 2,5 ml / stillas i en 12-brønns plate). Likeledes tillater mikrobærerne til tyngdekraften slå seg ned inne i sentrifugerøret, fjern forsiktig PBS ved hjelp av en serologisk pipette uten å forstyrre de mikrobærerne, og legge til cellekulturmediet for å oppnå et 5: 1 forhold av middels til mikrobærerne.
Representative Results
I denne studien, har vi fremstilt ECM-avledede skum og mikrobærere under anvendelse av human DAT, svin DDT, og porcine DLV som representative eksempler viser at de teknikker som kan anvendes for å generere vevsspesifikke bioscaffolds hjelp av en rekke decellularized vev som ECM kilder ( Figur 1). For både skum og mikrobærer fabrikasjon, ble Nishihara teknikk av kollagen oppløseliggjøring med den glykolytiske enzym α-amylase 37 tilpasset for å generere en viskøs ECM suspensjon fra decellularized vev-utgangsmaterialer, som brukes for å syntetisere de bioscaffolds ved kontrollert frysing og frysetørringsfremgangsmåter.
For å fremstille skummene, kan decellularized vev bli behandlet gjennom enten mekanisk hakking eller cryomilling for å øke overflatearealet før enzymatisk spalting. Følgende45; amylase behandling og homogenisering, blir den resulterende ECM suspensjonen fylles i en brukerdefinert støpeform, som er så frosset og lyofilisert. Stillasene kan lagres stabilt i tørr tilstand i en lengre tidsperiode. Før anvendelse i cellekulturstudier, må de lyofiliserte stillasene utsettes for en kontrollert rehydreringsprosessen som gir porøse og sterkt hydrerte-homogene skum avledet fra ren ECM (figur 3A). Hvis skummene rehydratiseres for fort, kan hurtig svelling skade skjøre strukturelle trekk, noe som resulterer i tap av integritet og strukturell kollaps. Generelt vil skummene beholde formen er definert av den opprinnelige formen etter rehydratisering og er stabile uten behov for kjemisk tverrbinding. Figur 3B viser representative elektronmikroskop (SEM) bilder av DAT, DDT, og DLV skum fremstilt med cryomilled ECM ved en konsentrasjon på 35 mg / ml og en frysetemperatur på -80 & #176; C.
Figur 3. Representative Bilder av DAT, DDT, og DLV Skum stille med Cryomilled ECM-suspensjoner ved en konsentrasjon på 35 mg / ml og frosset ved -80 ° C. A: Makroskopisk riss av DAT, DDT, og DLV males skum syntetisert i en 48-brønners vevkulturplate mugg etter rehydrering. Skala stolper representerer 1 cm. B: SEM bilder av DAT, DDT, og Dlv skum som viser en homogen porøs ultrastruktur. Skala stolper representerer 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De cryomilled ECM suspensjoner, kan også brukes til å generere rene ECM-avledet mikrobærere via electrospraying teknikker (figur 2 (figur 4A). Mens mikrobærerne kan lagres i en lyofilisert tilstand, er det anbefalt for å lette håndtering av at de blir dispensert eller siktes til en ønsket størrelsesområde etter resuspensjon i etanol. SEM avbildning antyder at mikrobæreren ultrastruktur kan variere avhengig av decellularized vevskilde (figur 4B).
Figur 4. Representative Bilder av DAT, DDT, og DLV Mikrocarriers stille med Cryomilled ECM-suspensjoner ved en konsentrasjon på 35 mg / ml, en infusjonshastighet på 0,5 ml / min, og en påtrykt spenning på 20 kV. A: Makroskopisk syn of de hydratiserte DAT, DDT, og Dlv mikrobærere. Skala stolper representerer 4 mm. B: SEM bilder av DAT, DDT, og Dlv mikrobærere som viser at ultrastruktur og størrelse kan variere avhengig av ECM kilde. Skala stolper representerer 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De mekaniske egenskaper av stillasene er avhengig av ECM kilde, metoden for behandling av tilført (dvs. hakking versus cryomilling), ECM suspensjon konsentrasjon, og frysetemperaturen. Generelt er de stillasene er myk og ettergivende, med Young-modul i området fra 1 - 5 kPa rapportert for DAT (50 og 100 mg / ml) 29 og Dlv skum (20 - 50 mg / ml) 31, og <1 kPa for mikrobærerne. De cryomilled skum er vanligvis mykere then de hakket skum på grunn av deres mer forstyrret naturen. Spesialiserte mekanisk testing av systemer som er utstyrt med meget følsomme lastceller er nødvendig for nøyaktig karakterisering av kompresjonsegenskaper. Typisk vil skummene og mikrobærerne har lavere moduli enn de native decellularized vev på grunn av de ytterligere prosesstrinn som er involvert i fremstillingen, inkludert enzymatisk fordøyelse og homogenisering, så vel som ikke-kovalent tverrbundne natur av stillasene. Men dette kan variere avhengig av vev av interesse. For eksempel, i tidligere arbeid, har vi funnet at hakket DAT skum fremstilt ved høye konsentrasjoner ECM (100 mg / ml) hadde lignende modulene til nativt fettvev 29.
De rehydratiserte ECM-avledede skum og mikrobærere kan kimtilsatt med celler under statiske eller dynamiske betingelser kultur for å tilveiebringe en celle støttende plattform for in vitro cellekulturstudier og / or in vivo celle levering. Mens stillasene generelt støtte cellekobling, vil seeding effektivitet avhenger av ECM kilde, stillaset geometri og porøsitet, og den celletype av interesse. Som sådan, vil seeding metoder og tettheter kreve optimalisering avhengig av de brukerdefinerte betingelser. For skummene som er beskrevet ovenfor, anbefales en utgangscellekonsentrasjon i området 0,25 - 1 x 10 6 celler / stillas, med dynamisk poding på en orbital rystemaskin for å forbedre celleinfiltrasjon. For mikrobærerne, foreslår vi en første seeding tetthet i området fra 25.000 - 50.000 celler / mg mikrobærere, med poding utført under dynamiske forhold i en spinnerkultur kolbe 11. Bildene som er vist ved bunnen av figur 1 representerer humane ASCer utsådd på en DAT skum (venstre) eller DAT mikrobæreren (høyre, forhåndsmerkede med et amin-reaktivt fargestoff og vises blå 13), som visualisert ved hjelp av konfokal mikroscopy ved hjelp av en fluorescerende cellenes levedyktighet flekk (levende celler = grønn, døde celler = rød; Skala søylene representerer 100 um). Konfokal mikroskopi kan anvendes for å visualisere celler sådd på overflaten av skum opp til 2 mm i tykkelse, men visualisering inn i de sentrale områder av stillasene er begrenset av deres ugjennomsiktig art. Imidlertid kan skummene og mikrobærerne bli behandlet som vev og paraffin-innstøpt eller kryo-kåret for histologisk og immunhistokjemisk analyse for å visualisere cellefordeling og markør uttrykk.
Discussion
Generelt kan bioscaffolds avledet fra decellularized vev mer nært tilnærmet den komplekse 3D-sammensetning og struktur av ECM i den native cellulære mikromiljø, sammenlignet med syntetiske stillas eller standard-kulturmodeller basert på 2D TCPS. Som tidligere omtalt, celle-ECM-interaksjoner er kritisk viktige for å mediere celle oppførsel både i kultur og i legemet 1. Erkjennelsen av at de biokjemiske, biofysiske og biomekaniske egenskapene til ECM er unike for hver vev, er det økende bevis for å støtte begrunnelsen for å bruke vevsspesifikke tilnærminger i utformingen av biomaterialer for tissue engineering, samt i utviklingen av mer fysiologisk relevante kultur modeller for in vitro eksperimenter 20. Utnytte decellularized vev som utgangsmateriale, kan våre fremgangsmåter innlemme den komplekse sammensetning av den vevsspesifikke ECM innenfor mer Customizable stillas formater. Mens de mekaniske og enzymatiske behandlingstrinn vil resultere i et tap av det native ECM ultrastruktur har tidligere undersøkelser med DAT viste at instruktive effektene av adipose-avledede ECM er konservert i disse stillas formater, noe som tyder på at bioscaffold sammensetningen er en nøkkel-mediator av cellefunksjon 11, 29. En betydelig fordel ved å bruke ECM-avledede skum og mikrobærere som cellekultur substrater sammenlignet med de intakte decellularized vev er at de er mer homogene, noe som kan forbedre jevnheten i fordelingen celle og celle-celle / celle-ECM-interaksjoner.
Metodene som beskrives her kan benyttes til å generere et bredt utvalg av vevs-spesifikke bioscaffolds for bruk i cellekultur og vev-tekniske anvendelser. For eksempel, i tillegg til DAT, DDT, og DLV, vår lab har med hell brukt disse teknikkene for å generere 3D porlige skum under anvendelse av decellularized ben, brusk, nucleus pulposus, og ringrommet fibrose, så vel som kommersielt tilgjengelige, uløselige kollagen avledet fra bovin sene. Fra en in vitro perspektiv, kan disse bioscaffolds brukes som et grunnlag for høyere fidelity 3D kulturmodeller for å undersøke cellulær biologi, fysiologi eller sykdomspatologien 38, som bioaktive substanser in high-throughput medikament screenings plattformer 39, eller som instruktive matrikser for stammen celledifferensiering 40, 41. DAT, DDT og Dlv skum fremstilt i konsentrasjoner på 25 - 50 mg / ml er stabile i lang sikt in vitro kultur (testet opp til 28 dager). Videre kan alle tre typer av mikrobærere støtter celleadhesjon og celleformering under dynamiske forhold i en lav-skjær-spinnerkultur system (10 - 15 rpm) i minst 2 uker. For in vivo anvendelser er biokompatible og biodegradabare ECM-avledede skum og mikrobærerne være lovende som off-the-sokkel produkter for å stimulere konstruktiv vev remodellering og regenerering 11, 29. Videre kan celleadhesive stillasene benyttes som celleterapi leveringssystemer 42, 43. Som et eksempel ble DAT skum vist seg å fremme angiogenese og adipogenese når de inokuleres med allogene ASCer og implantert subkutant i en immunkompetent rottemodell 29. I forhold til den intakte DAT Skum den mer sterkt bearbeidet DAT degradert mye hurtigere, med en 50% reduksjon i volum er angitt ved 3 uker etter hvert som de ble integrert med vertsvev, og nesten fullstendig resorpsjon av 12 uker. Men skummene induserte også en mer potent angiogen reaksjon, noe som tyder på at enzymet-spaltet ECM hadde unike pro-regenerative virkninger. På samme måte kan de ECM-avledede mikrobærere bli anvendt som in vitro </ em> celledyrkingsunderlag innenfor dynamiske kultursystemer og som injiserbare celle leveringskjøretøy 11, 30, 44. Mer spesifikt, kan de med liten diameter og stort overflateareal av mikrobærerne muliggjøre levering av en stor mengde av celler i et lite volum, samtidig som det gir en matrise som kan bidra til å opprettholde cellenes levedyktighet og øke celle retensjon ved injeksjonsstedet 30. Før anvendelse i et hvilket som helst levende system, er det viktig å sørge for at kilden ECM er i det vesentlige fritt for antigene cellulære komponenter og / eller potensielt cytotoksiske decellularization reagenser som kan utløse en negativ vertsrespons 7.
Det proteolytiske enzym pepsin er vanlig brukt ved fremstilling av ECM-avledet hydrogeler 15. Pepsin er en ikke-spesifikk protease som vil fordøye kollagen og andre ECM-proteiner into 45 små fragmenter. Mens hydrogeler fremstilt fra pepsin-spaltet ECM er blitt rapportert å ha celle-rikt effekter, er en begrensning at disse materialene har en tendens til å være ekstremt mekanisk svak 46. I vår innledende utvikling av DAT mikrobærerne, benyttet vi et sammensatt tilnærming der pepsin-spaltet DAT ble kombinert med alginat og tilsettes dråpevis i CaCl2 for å danne sfæriske kuler 30. Perlene ble deretter foto-kryssbundet og alginat ble ekstrahert ved anvendelse av natriumcitrat. I tillegg til kravet for kjemisk tverrbinding, en nøkkel begrensning var at mikrobærerne fabrikkert med denne løsningen fått dårlig stabilitet under en størrelse i området 900-950 um 30. I stedet for pepsin, fremgangsmåtene som presenteres her benytte et mer mild oppslutning av ECM med den glykolytiske enzym α-amylase, som er postulert å spalte karbohydratgrupper fra telopeptide regioner av kollagen, og dermed øke løselighet i eddiksyre 37. Denne tilnærmingen muliggjør isoleringen av sterkt polymerisert kollagen som kan brukes til å generere rene ECM-avledede skum og mikrobærere uten behov for kjemisk tverrbinding eller andre tilsetningsstoffer. Disse bioscaffolds er stabilisert gjennom fysiske interaksjoner og hydrogenbindinger mellom godt bevarte kollagenfibriller, lik den kollagen i nativ ECM mikromiljøet.
Skummene er en svært fleksibel plattform som kan fremstilles i et bredt spekter av geometrier avhengig av den spesifikke formen valgt. For cellekulturstudier, kan skummet støpes direkte i TCPS brønners plater, for å fremstille belegg eller 3D stillaser med varierende tykkelse. For å fremstille 3D-skum med meget ensartede flater, er det anbefalt at en tilpasset formen er utformet som kan tettes på begge sider med plast eller glass-slides. Enten hakket eller cryomilled ECM kan brukes til å syntetisereskummet. Generelt har vi funnet at de cryomilled skum har en tendens til å være makroskopisk mykere og har en mer forstyrret ultrastruktur ved lavere konsentrasjoner 31, 36. Avhengig av vevskilde kan de ytterligere mekaniske prosesstrinn føre til forandringer i ECM sammensetning som kan påvirke cellefunksjonen. For eksempel, i vårt tidligere arbeid, ble laminin oppdaget i hakket DLV skum, men ikke cryomilled DLV skummer 31. I motsetning til dette ble collagen I, collagen IV, laminin og fibronektin påvist i både hakket og cryomilled DAT skummer 36. I tillegg til de mekaniske prosesstrinn, kan porøsiteten og porestørrelsen av skummene være innstilt til en viss grad ved å variere ECM suspensjonskonsentrasjon og frysetemperaturen 47. Generelt vil lavere konsentrasjon skum (~ 10 - 15 mg / ml) er kvalitativt mer porøs, men kan trekke seg sammen raskere og ha dårligstabilitet i langtidskultur 31, 36. Tilsvarende er en langsommere frysehastighet, typisk oppnådd ved et høyere frysetemperatur, kan resultere i større porer i skummet på grunn av størrelsen på iskrystallene som dannes under fabrikasjon 29. Alle disse parameterne kan påvirke celle-interaksjoner med de materialer, blant annet feste, infiltrasjon og ombygging. For eksempel kan cellevekst på skum som er fremstilt med høyere konsentrasjoner ECM være begrenset til overflateområdene, spesielt med hakket ECM-kilder og under statiske dyrkingsbetingelser 36.
For mikrobærerne, de viktigste parametrene som kan være innstilt er ECM suspensjon konsentrasjon, kanyletykkelse, og påtrykt spenning med høyere konsentrasjoner typisk man oppnådde mikrobærere som er mer stabile under langvarig dynamisk kultur. Etter start av electrospraying, ECM suspension dråpene bør raskt falle inn i sentrum av kolben, mot retningen av aluminiumsfolie kollektoren. For å hindre aggregering, er det viktig at kulene kontakt med flytende nitrogen før folien. Avstanden mellom nålen og overflaten av det flytende nitrogenet kan justeres for å møte disse kravene. Det er viktig å merke seg at optimaliseringen kan være nødvendig, avhengig av egenskapene til hver enkelt ECM kilde, særlig ved valg av konsentrasjonsområdet som vil generere stabile bioscaffolds. En annen viktig faktor er den decellularization protokollen som brukes for å generere utgangsmaterialer, idet decellularization metoder som forringer ECM eller tilstedeværelse av resterende reagenser (for eksempel overflateaktive midler) kan innvirke negativt på stabiliteten av de resulterende skum og mikrobærere. Hvis utfordringer er oppstått med bioscaffold stabilitet, alternativer som kan undersøkes inkluderer bruk en mer gradvis utvanning prosessen, øke ECM suspsjonen konsentrasjon, og utforskning hakket versus cryomilled ECM. Skulle alle disse alternativene ikke klarer å løse problemet, kan det være nødvendig å utforske alternative decellularization protokoller eller ECM kilder.
For å sikre reproduserbarhet ved stillas produksjon, må det utvises spesiell forsiktighet ved visse trinn i protokollen. Når cryomilling de decellularized vev, er det anbefalt at fresing utføres umiddelbart etter frysetørking i et tørt miljø for å redusere sannsynligheten for partikkelaggregatet på grunn av absorpsjon av fuktighet fra omgivelsene. Under mikrobærer fabrikasjon, er det foreslått at suspensjonen electrosprayed i små grupper, med et maksimalt volum på 3 ml, for å unngå problemer med prøven kjøling som kan resultere i tilstopping av nålen. Videre er det viktig at mikrobærerne er ikke tillatt å tine etter electrospraying prosessen. For å opprettholde deres sfærisk geometri og mekanisk stabilitet, microcarriers skal samles inn fra det flytende nitrogenet, transporteres i en flytende nitrogenfylt beholder, og lyofiliseres umiddelbart. Til slutt, for både skum og mikrobærerne, er det avgjørende at rehydrering trinnene utføres sakte over en periode på flere dager. Rask rehydratisering kan føre til strukturell kollaps på den makro- og / eller mikroskala. Videre rehydrering må skje langsomt for å unngå at det dannes små luftbobler i stillaset, noe som kan kreve en betydelig mengde av tid for å avgasse under lett vakuum.
Som konklusjon kan fremgangsmåtene som presenteres i denne artikkelen benyttes til å fremstille et variert utvalg av vevs-spesifikke skum og mikrobærere som består av rent, ikke-kjemisk tverrbundet ECM. En fordel for biologiske forskere er at bioscaffolds er lette å håndtere og kan behandles på samme måte som vev når det utføres analyser med teknikker som histologiske, immunhistokjemi, eller gen og proteinekspresjon analyser.I tillegg kan de ECM-avledede stillasene være enzymatisk nedbrutt for å ekstrahere tilsådde cellepopulasjoner eller kan brukes direkte som bionedbrytbare og biokompatible celle levering kjøretøy. Totalt, holder denne fleksible plattformteknologi stor nytte for mange anvendelser, inkludert for 3D-cellekultur-studier som undersøker cellefunksjon, som celleekspansjons substrater, og som pro-regenerative bioscaffolds.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
| Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| α-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
| Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 & 50 mL centrifuge tubes |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
| Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
| Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
| DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
| Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 - 500 mL |
| Double distilled water (ddH2O) | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
| D-PBS (Phosphate-buffered Saline) | Wisent | 311425125 | |
| ECM (Extracellular Matrix) | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
| Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
| Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
| Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
| Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
| Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8,000 - 30,000 rpm |
| Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 x 95 mm |
| Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
| Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
| Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
| Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
| 18 G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
| Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
| Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
| Retort stand | VWR | 470019-526 | |
| Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
| Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL Luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
| Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
| Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
| Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
| Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
| High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
| Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4" recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |
References
- Eweida, A. M., Marei, M. K. Naturally Occurring Extracellular Matrix Scaffolds for Dermal Regeneration: Do They Really Need Cells? Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From Cell-ECM Interactions to Tissue Engineering. J. Cell. Phys. 199 (2), 174-180 (2004).
- Du, J., et al. Extracellular Matrix Stiffness Dictates Wnt Expression Through Integrin Pathway. Sci. Rep. 6, 4195-4200 (2016).
- Badylak, S. F. The Extracellular Matrix as a Scaffold for Tissue Reconstruction. Cell & Dev. Biol. 13 (2), 377-383 (2002).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of Tissues and Organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An Overview of Tissue and Whole Organ Decellularization Processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Reing, J. E., et al. The Effects of Processing Methods Upon Mechanical and Biologic Properties of Porcine Dermal Extracellular Matrix Scaffolds. Biomaterials. 31 (33), 8626-8633 (2010).
- Yang, Q., et al. Morphological Appearance, Content of Extracellular Matrix and Vascular Density of Lung Metastases Predicts Permissiveness to Infiltration by Adoptively Transferred Natural Killer and T Cells. Cancer Immun. Immunother. 55 (6), 699-707 (2006).
- Calle, E., Ghaedi, M., Sundaram, S., Sivarapatna, A., Tseng, M. K., Niklason, L. E. Strategies for Whole Lung Tissue Engineering. IEEE Trans. Biomed. Eng. 61 (5), 1482-1496 (2014).
- Turner, A. E. B., Yu, C., Bianco, J., Watkins, J. F., Flynn, L. E. The Performance of Decellularized Adipose Tissue Microcarriers as an Inductive Substrate for Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 33 (18), 4490-4499 (2012).
- Brown, C. F. C., Yan, J., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Effect of Decellularized Adipose Tissue Particle Size and Cell Density on Adipose-Derived Stem Cell Proliferation and Adipogenic Differentiation in Composite Methacrylated Chondroitin Sulphate. Biomed. Mater. 10 (4), 1-12 (2015).
- Cheung, H. K., Han, T. T. Y., Marecak, D. M., Watkins, J. F., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Composite Hydrogel Scaffolds Incorporating Decellularized Adipose Tissue for Soft Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 35 (6), 1914-1923 (2014).
- Almeida, H. V., Eswaramoorthy, R., Cunniffe, G. M., Buckley, C. T., O'Brien, F. J., Kelly, D. J. Fibrin Hydrogels Functionalized with Cartilage Extracellular Matrix and Incorporating Freshly Isolated Stromal Cells as an Injectable for Cartilage Regeneration. Acta Biomat. 36, 55-62 (2016).
- Wassenaar, J. W., Braden, R. L., Osborn, K. G., Christman, K. L. Modulating in vivo Degradation Rate of Injectable Extracellular Matrix Hydrogels. J. Mater. Chem. B. 4 (16), 2794-2802 (2016).
- Ugerleider, J. L., et al. Extracellular Matrix Hydrogel Promotes Tissue Remodeling, Arteriogenesis, and Perfusion in a Rat Hindlimb Ischemia Model. JACC Basic Transl. Sci. 1 (1-2), 32-44 (2015).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Eng. Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Pati, F., et al. Printing Three-Dimensional Tissue Analogues with Decellularized Extracellular. Matrix Bioink. Nat. Commun. 5, 3935 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D Cell Culture Systems - Advantages and Applications. J. Cell. Phys. 230 (1), 16-26 (2015).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. Three-dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. Tissue Eng Part B, Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The Third Dimension Bridges the Gap Between Cell Culture and Live Tissue. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Bouet, G., Marchat, D., Cruel, M., Malaval, L., Vico, L. In Vitro Three-Dimensional Bone Tissue Models: From Cells to Controlled and Dynamic Environment. Tissue Eng. Part B Rev. 21 (1), 133-156 (2015).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene Expression Perturbation in vitro - A Growing Case for Three-Dimensional (3D) Culture Systems. Sem. Cancer Biol. 15 (5), 405-412 (2005).
- Bonnier, F., et al. Cell Viability Assessment Using the Alamar Blue Assay: A Comparison of 2D and 3D Cell Culture Models. Toxicology in vitro. 29 (1), 124-131 (2015).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The Extracellular Matrix at a Glance. J. Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).
- Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential Effects of Tissue Culture Coating Substrates on Prostate Cancer Cell Adherence, Morphology and Behavior. PLoS ONE. 9 (11), e112122 (2014).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified Three-Dimensional Culture System for Long-Term Expansion of Embryonic Stem Cells. World J. Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Flynn, L. E. The Use of Decellularized Adipose Tissue to Provide an Inductive Microenvironment for the Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Yu, C., et al. Porous Decellularized Adipose Tissue Foams for Soft Tissue Regeneration. Biomaterials. 34 (13), 3290-3302 (2013).
- Turner, A. E. B., Flynn, L. E. Design and Characterization of Tissue-Specific Extracellular Matrix-Derived Microcarriers. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (3), 186-197 (2012).
- Russo, V., Omidi, E., Samani, A., Hamilton, A., Flynn, L. E. Porous, Ventricular Extracellular Matrix-Derived Foams as a Platform for Cardiac Cell Culture. Biores Open Access. 4 (1), 374-388 (2015).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Eng. Part C, Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Owen, S. C., Fisher, S. A., Tam, R. Y., Nimmo, C. M., Shoichet, M. S. Hyaluronic Acid Click Hydrogels Emulate the Extracellular Matrix. Langmuir. 29 (24), 7393-7400 (2013).
- Zargham, S., Bazgir, S., Tavakoli, A., Rashidi, A. S., Damerchely, R. The Effect of Flow Rate on Morphology and Deposition Area of Electrospun Nylon 6 Nanofiber. J. Eng. Fibers Fabr. 7 (4), 42-49 (2012).
- Gryshkov, O., Pogozhykh, D., Zernetsch, H., Hofmann, N., Mueller, T., Glasmacher, B. Process Engineering of High Voltage Alginate Encapsulation of Mesenchymal Stem Cells. Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl. 36, 77-83 (2014).
- Turco, B. Characterization and Cell-Seeding of Decellularized Adipose Tissue Foams for Wound Healing. , Queen's University. Kingston, Ontario, Canada. (2014).
- Steven, F. S. The Nishihara Technique for the Solubilization of Collagen. Application To the Preparation of Soluble Collagens From Normal and Rheumatoid Connective Tissue. Ann. Rheum. Dis. 23, 300-301 (1964).
- Hansen, N. U. B., Genovese, F., Leeming, D. J., Karsdal, M. A. The Importance of Extracellular Matrix for Cell Function and in vivo Likeness. Exp. Mol. Pathol. 98 (2), 286-294 (2015).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D Cell Culture Opens New Dimensions in Cell-Based Assays. Drug Discov. Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Liao, J., Guo, X., Grande-Allen, K. J., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Bioactive Polymer/Extracellular Matrix Scaffolds Fabricated with a Flow Perfusion Bioreactor for Cartilage Tissue Engineering. Biomaterials. 31 (34), 8911-8920 (2010).
- Choi, Y. C., Choi, J. S., Woo, C. H., Cho, Y. W. Stem Cell Delivery Systems Inspired by Tissue-Specific Niches. J. Control. Release. 193, 42-50 (2014).
- Han, T. T. Y., Toutounji, S., Amsden, B. G., Flynn, L. E. Adipose-Derived Stromal Cells Mediate in vivo Adipogenesis , Angiogenesis and Inflammation in Decellularized Adipose Tissue Bioscaffolds. Biomaterials. 72, 125-137 (2015).
- Yu, C., Kornmuller, A., Flynn, L. E. Porous Decellularized Extracellular Matrix Microcarriers for Tissue-Specific Cell Expansion and Delivery. Front. Bioeng. Biotechnol. , (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. J. Food Sci. 81 (1), C27-C34 (2016).
- Lin, H., Yang, G., Tan, J., Tuan, R. S. Influence of Decellularized Matrix Derived from Human Mesenchymal Stem Cells on their Proliferation, Migration and Multi-Lineage Differentiation Potential. Biomaterials. 33 (18), 4480-4489 (2012).
- Fonte, P., Reis, S., Sarmento, B. Facts and Evidences on the Lyophilization of Polymeric Nanoparticles for Drug Delivery. J. Control. Release. 225, 75-86 (2016).
