Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает, как точно измерить жизнеспособность нейронов с использованием двойного окрашивания флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидиум-йодида (PI) в культивируемых нейронах гранул мозжечка, первичной нейрональной культуре, используемой в качестве модели in vitro в исследованиях нейронауки и нейрофармакологии.

Abstract

Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGNs) широко используются в качестве модели in vitro в исследованиях нейрофизиологии и нейрофармакологии. Однако сосуществование глиальных клеток и нейронов в культуре CGN может привести к искажениям в точной оценке жизнеспособности нейронов. Двойное окрашивание флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидий-йодида (PI) используется для измерения жизнеспособности клеток путем одновременной оценки жизнеспособных и мертвых клеток. Мы использовали двойное окрашивание FDA-PI для улучшения чувствительности колориметрических анализов и оценки жизнеспособности нейронов в CGN. Кроме того, мы добавили синие флуоресцентные пятна ДНК ( например, Hoechst) для улучшения точности. Этот протокол описывает, как улучшить точность оценки жизнеспособности нейронов, используя эти методы в культуре CGN. Используя этот протокол, количество глиальных клеток может быть исключено с помощью флуоресцентной микроскопии. Аналогичная стратегия может быть применена, чтобы отличить нежелательные глиAl клетки из нейронов в различных культурах смешанных клеток, таких как первичная корковая культура и культура гиппокампа.

Introduction

Анализы колориметрической цитотоксичности, такие как анализ 3- (4, 5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-Н-тетразолийбромид (МТТ), обычно используют для определения жизнеспособности клеток in vitro . Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGN) у крыс чувствительны к различным нейротоксинам, включая ион 1-метил-4-фенилпиридиния, перекись водорода и глутамат 1 , 2 . Таким образом, культуры CGN могут использоваться как модель in vitro в области нейронауки. Культуры CGN могут содержать различные клетки, включая нейроны и глиальные клетки, которые могут составлять около 1% от общего количества клеток в культуре CGN. Однако глиальные клетки по-разному реагируют на нейротоксины по сравнению с нейронами, что приводит к смещению в жизнеспособности нейронов, измеренному колориметрическими анализами 3 .

В жизнеспособных клетках диацетат флуоресцеина (FDA) может быть превращен в флуоресцеин эстеразой.Пропидий-йодид (PI) может взаимодействовать с ДНК после проникновения в мертвые клетки и может использоваться для указания апоптоза в культуре. Таким образом, двойное окрашивание FDA-PI может одновременно оценивать жизнеспособные клетки и мертвые клетки, предполагая, что жизнеспособность клеток может быть измерена более точно, комбинируя оба колориметрических метода. Более того, путем добавления Hoechst, синего флуоресцентного красителя для ядер, точность жизнеспособности клеток может быть дополнительно улучшена. Представленный здесь протокол описывает двойное окрашивание FDA-PI и тройное окрашивание FDA-PI-Hoechst, которое может быть использовано для точного анализа жизнеспособности нейронов в первичных культивируемых CGN.

Этот протокол использует преимущества визуализации и различения CGN и глиальных клеток по их различным размерам и формам. После окрашивания число жизнеспособных нейронов и мертвых нейронов подсчитывают из репрезентативных изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. Крупные глиальные клетки исключаются путем сравнения типичных CGNs tAken под флуоресцентным режимом с режимами фазового контраста. Подобная стратегия может быть выполнена для измерения жизнеспособности нейронов в смешанных клеточных культурах, содержащих нейроны и глиальные клетки, такие как первичные корковые культуры и культуры гиппокампа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH № 80-23, пересмотренный в 1996 году) и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных (IACUC) в Университете Нинбо ( SYXK-2008-0110).

1. Подготовка растворов и культуральных сред

Примечание. Реагенты и запасы должны быть приготовлены в стерильных условиях. Стерилизовать фильтрованием с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм.

  1. Приготовьте основной раствор поли-L-лизина (PLL), добавив 5 мг PLL к 10 мл дважды дистиллированной воды (ddH 2 O). Стерилизовать фильтрованием. Алиготе и хранят основной раствор PLL при -20 ° C в течение нескольких месяцев.
  2. Готовят буфер Кребса, добавляя 7,25 г NaCl, 0,4 г KCl, 0,14 г NaH 2 PO 4 , 2,6 г D-глюкозы и 5,94 г 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты до 100 мл DdH2 </ Суб> О. Стерилизовать фильтрованием. Хранить буферный раствор Кребса при температуре 4 ° C на срок до одного месяца.
  3. Готовят 3,82% раствора Mg 2 SO 4 , добавляя 3,82 г Mg 2 SO 4 к 100 мл ddH 2 O. Стерилизовать фильтрованием. Хранить раствор Mg 2 SO 4 при температуре 4 ° C в течение нескольких месяцев.
  4. Приготовить 1,2% раствор CaCl 2 , добавив 1,2 г CaCl 2 к 100 мл ddH 2 O. Стерилизовать фильтрованием. Хранить раствор CaCl 2 при 4 ° C в течение нескольких месяцев.
  5. Приготовить раствор 2 М KCl, добавив 15 г KCl к 100 мл ddH 2 O. Стерилизовать фильтрованием. Хранить раствор KCl при 4 ° C в течение нескольких месяцев.
  6. Приготовить основной раствор D-глюкозы, добавив 1,8 г D-глюкозы к 100 мл ddH 2 O. Стерилизовать фильтрованием. Аликвоту и хранить раствор D-глюкозы при 4 ° C в течение одного месяца.
  7. Приготовить раствор сыворотки цитозина β-D-арабинофуранозида (Ara-C)Ион, добавляя 0,24 г Ara-C к 10 мл ddH 2 O. Стерилизовать фильтрованием. Алиготе и хранят маточный раствор Ara-C при 4 ° C в течение нескольких месяцев.
  8. Готовят 250 мл культуральной среды (для 25-30 щенков), используя 25 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2,5 мл 100x глутамина, 2,78 мл 2M раствора KCl и 2,5 мл 100x антибиотиков в базальной среде Eagle (BME) , Отрегулируйте объем до 250 мл и стерилизуйте путем фильтрации.
  9. Готовят среду 25К с использованием 2,5 мл 100х глутамина, 2,78 мл 2М раствора KCl и 2,5 мл 100х антибиотиков в BME. Отрегулируйте объем до 250 мл и стерилизуйте путем фильтрации.
  10. Подготовьте среду 5K, используя 2,5 мл 100x глутамина и 2,5 мл 100X антибиотиков в BME. Отрегулируйте объем до 250 мл и стерилизуйте путем фильтрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная среда, среда 25K и среда 5K должны быть свежеприготовленными
  11. Приготовьте основной раствор FDA, добавив 5 мг FDA к 1 мл ацетона. Хранить маточный раствор FDA при 4 ° C для длительного хранения. </ Li>
  12. Подготовьте основной раствор PI, добавив 1 мг PI к 1 мл ddH 2 O. Храните маточный раствор PI при 4 ° C в течение нескольких месяцев.
  13. Приготовить основной раствор Hoechst, добавив 5 мг Hoechst 33342 к 1 мл ddH 2 O. Хранить маточный раствор Hoechst при 4 ° C в течение нескольких месяцев.

2. Подготовка рассекающих растворов

ПРИМЕЧАНИЕ. Сделайте это за 1 день до вскрытия.

  1. Приготовьте раствор для вскрытия, добавив 15 мл буфера Кребса, 1,2 мл 3,82% раствора Mg 2 SO 4 и 0,45 г альбумина бычьей сыворотки (BSA) до 150 мл ddH 2 O. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH.
  2. Этикетка 5 х 50 мл пробирки следующим образом: 1, 2, 3, 4 и 5.
  3. Поместите 40 мл раствора для вскрытия в шприц объемом 50 мл с фильтром. Фильтруют 30 мл раствора для вскрытия в пробирку 1 и по 2 мл каждый на несколько чашек для 35 мм клеточной культуры, которые будут использоваться для обработки тканей.
  4. ЧтобыUbe 2, добавьте 12,5 мг трипсина в 50 мл раствора для вскрытия. Полностью перемешивают вортексом. Стерилизовать фильтрованием.
  5. В трубку 3 добавьте 1,2 мг ДНКазы I, 7,8 мг ингибитора трипсина сои и 150 мкл 3,82% раствора Mg 2 SO 4 в 15 мл раствора для вскрытия. Полностью перемешивают вортексом. Стерилизовать фильтрованием.
  6. К пробирке 4 добавьте 5 мл раствора из пробирки 3. Добавьте 10,5 мл раствора для вскрытия. Стерилизовать фильтрованием.
  7. К пробирке 5 добавьте 100 мкл 3,82% раствора Mg 2 SO 4 и 15 мкл 1,2% раствора CaCl 2 в 12,5 мл раствора для вскрытия. Полностью перемешивают вортексом. Стерилизовать фильтрованием.
  8. Храните все пробирки при температуре 4 ° C перед использованием.

3. Покрытие пластин клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ. Сделайте это за 1 день до вскрытия.

  1. Добавить 1 мл основного раствора PLL к 100 мл ddH 2 O (конечная концентрация: 5 мкг / мл). Пальто пластиковое6-луночные или 12-луночные планшеты для культивирования клеток (2 мл на лунку для 6-луночных планшетов для культивирования клеток или 1 мл на лунку для 12-луночных планшетов для культивирования клеток) добавлением 5 мкг / мл раствора поли-L-лизина.
  2. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 дня (или при 37 ° С в течение 2 ч). За 1-2 часа до вскрытия удаляют раствор с помощью пипетки. Промыть один раз ddH 2 O и высушить в вытяжном шкафу для клеток.

4. Обработка тканей для 8-дневных крыс Sprague-Dawley.

  1. Поставьте 100-миллиметровое блюдо на лед. Обезглавьте щенков крысы в ​​блюдо, используя пару стерилизованных ножниц.
  2. Вставьте ножницы в отверстие большого отверстия и вырежьте две стороны черепа, от ушей до глаз. Поднимите череп с помощью пинцета. Убедитесь, что весь мозг находится в черепе. Изолируйте мозжечок и положите его в вышеупомянутую 35 мм чашку с помощью пинцета.
  3. Работа под рассекающим микроскопом. Удалить мозговые оболочки и кровеносные сосуды двумя парами щипцов,
  4. Чоп ткани с лезвием. Поместите ткани в пробирку 1. Центрифуга в течение 5 мин при RT и 1500 g.
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость. Сохраните пеллету.
  6. Добавить раствор в пробирку 2 в гранулу. Ресуспендируют, слегка встряхивая.
  7. Поместите пробирку в водяную баню на 37 ° C в течение 15 минут. Мягко встряхивайте каждые 3 мин.
  8. Добавьте раствор в трубку 4 к этому раствору. Встряхивают и центрифугируют в течение 5 мин при КТ и 1500 х g.
  9. Аспирируйте надосадочную жидкость. Сохраните пеллету.
  10. Добавить раствор в пробирку 3, чтобы ресуспендировать осадок.
  11. Подготовьте два 15 мл пробирки. Поместите половину клеток в каждую пробирку. Пипеткой вверх и вниз 60-70x, используя пипетку Пастера с хлопком, чтобы гомогенизировать клетки.
  12. Добавьте 3 мл раствора в пробирку 5 в каждую 15-мл пробирку. Позвольте им сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки Пастера. Поместите супернатант в новые пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 мин при комнатной температуре и 1500 х g.
  13. Спирализовать надосадочную жидкость. Сохраните пеллету.
  14. Добавить культуральную среду в гранулу, чтобы получить плотность клеток около 1,5 × 10 6 клеток / мл (около 100 мл для 10 щенков).
  15. Помещают клетки в культуральные планшеты и культивируют их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 .

5. Добавление Ara-C и D-глюкозы во время культивирования

  1. Через 24 часа добавляют основной раствор Ara-C (10 мкл / лунку для 12-луночных планшетов для культивирования клеток или 20 мкл / лунку для 6-луночных планшетов для культивирования клеток, конечная концентрация: 1 мМ) для ингибирования роста глиальных клеток.
  2. На 7-й день добавляли 50 мкл исходного раствора D-глюкозы на лунку для 12-луночных планшетов для культивирования клеток или 100 мкл на лунку для 6-луночных планшетов для культивирования клеток, чтобы конечная концентрация составляла 1 мМ.

6. FDA-PI двойное окрашивание и тройное окрашивание FDA-PI-Hoechst в культуре CGN

  1. Подготовьте рабочий раствор FDA-PI, добавив 20 мкл исходного раствора FDA (Конечная концентрация: 10 мкг / мл) и 50 мкл исходного раствора PI (конечная концентрация: 50 мкг / мл) в 10 мл PBS. Перемешивают вортексом и размещают на льду.
    1. В рабочий раствор FDA-PI-Hoechst добавить 20 мкл исходного раствора FDA (конечная концентрация: 10 мкг / мл), 50 мкл исходного раствора PI (конечная концентрация: 50 мкг / мл) и 10 мкл исходного раствора Hoechst (Конечная концентрация: 5 мкг / мл) в 10 мл PBS. Перемешивают вортексом и размещают на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный рабочий раствор FDA-PI и рабочий раствор FDA-PI-Hoechst непосредственно перед использованием.
  2. Выньте планшет для клеточной культуры из инкубатора. Положите его на лед.
  3. Аспирируйте питательную среду и замените ее холодным PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Изменение решения должно выполняться медленно и тщательно. Не прикасайтесь к клеткам наконечниками пипеток.
  4. Аспирируйте холодный PBS и замените его холодным рабочим раствором FDA-PI или FDA-PI-Hoechst (500 мкл / л11 для 12-луночных планшетов для культивирования клеток или 1 мл / лунку для 6-луночных планшетов для культивирования клеток). Оставить на льду в течение 5 мин.
  5. Аспирируйте рабочий раствор FDA-PI или FDA-PI-Hoechst и добавьте холодный PBS (100 мкл / лунку для 12-луночных планшетов для культивирования клеток или 50 мкл / лунку для 6-луночных планшетов для культивирования клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ячейки не должны высыхать при съемке.
  6. Делайте снимки с помощью флуоресцентной микроскопии. Используйте фильтр возбуждения с полосой пропускания 450-490 нм. Определить флуоресцентные излучения для FDA, PI и Hoechst при 520, 620 и 460 нм соответственно. В тех же условиях снимайте изображение при нормальном освещении, используя режим фазового контраста флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Возьмите изображения в течение 15 мин после окрашивания FDA-PI или FDA-PI-Hoechst. Время экспозиции составляет 100-300 мс, а аналоговое усиление - 2,8x.

7. Оценка жизнеспособности нейронов

  1. Для двойного окрашивания FDA-PI накладывают изображения на ячейки, обнаруженные после фильтрацииС помощью различных флуоресцентных фильтров путем перетаскивания FDA-положительного слоя на PI-положительный слой в графическом редакторе.
    1. Отрегулируйте непрозрачность слоя FDA-positive, введя «50%» в поле «Непрозрачность» панели «Слои». Слейте два слоя, нажав кнопку «Объединить видимые» в меню «Слой». Установите контрастность наложенных изображений, введя «50» в поле «Контрастность» под «Изображение» | «Корректировки» | "Контраст яркости." Убедитесь, что в наложенных изображениях нет FDA и PI double-positive cell.
  2. Для тройного окрашивания FDA-PI-Hoechst наложите изображения на ячейки, обнаруженные после фильтрации различных флуоресцентных фильтров, перетащив FDA-положительный слой на PI-положительный слой в графическом редакторе. Отрегулируйте непрозрачность слоя FDA-positive, введя «50%» в поле «Непрозрачность» в «Слоях и #34; панель.
    1. Слейте два слоя, нажав кнопку «Объединить видимые» в меню «Слой». Перетащите Hoechst-положительный слой на объединенный слой. Отрегулируйте непрозрачность слоя Hoechst-positive, введя «50%» в поле «Непрозрачность» панели «Слои». Слейте два слоя, нажав кнопку «Объединить видимые» в меню «Слой».
  3. Визуально отличать крупные нерегулярные глиальные клетки от CGN путем сравнения изображений, полученных в режиме флуоресценции, с результатами, полученными в режиме фазового контраста, - клетки с диаметрами в три раза больше, чем CGN, считаются глиальными клетками и должны быть исключены.
  4. Подсчитайте количество жизнеспособных нейронов и мертвых нейронов, используя плагин клеточного счетчика в программе обработки изображений ( например, ImageJ) 4 .
    1. Для двойного окрашивания FDA-PI вручную отметьте маленькие FDA-положительные клетки какЖизнеспособных нейронов. Ручно пометить PI-позитивные клетки как мертвые нейроны. Для тройного окрашивания FDA-PI-Hoechst вручную отметьте маленькие положительные клетки FDA и Hoechst как положительные нейроны. Ручно отметьте PI- и Hoechst-двойные-положительные клетки как мертвые нейроны.
  5. Вычислите процент жизнеспособности нейронов, используя следующее уравнение:% жизнеспособности нейронов = [количество жизнеспособных нейронов / (количество мертвых нейронов + количество жизнеспособных нейронов)] х 100%. Для каждой лунки выберите пять случайных полей и средний процент жизнеспособности нейронов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двойное иммуноокрашивание GAP43 (красный) и GFAP (зеленый) использовали для анализа формы нейронов и глиальных клеток, соответственно 2 , 5 . Оба нейрона и глиальных клеток присутствуют в культуре CGN. GFAP-положительные глиальные клетки большие и неправильной формы, как показано стрелками на изображениях ( Рисунок 1 ). Традиционные анализы жизнеспособности клеток не могут отличить глиальные клетки от нейронов, когда они используются для измерения жизнеспособности нейронов. Поэтому окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst, которые могут отличать глиальные клетки от нейронов, выгодно для точной оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN.

Низкокалиевую пробу использовали для индукции гибели нейронов в культуре CGN. Представленные изображения показывают культуру CGN, подвергнутую воздействию низкокалиевой среды (5K), нормальной среды (25K) или оригиКак анализировали двойным окрашиванием FDA-PI ( фиг. 2A ) или тройным окрашиванием FDA-PI-Hoechst ( фиг. 2B ). Жизнеспособность нейронов, измеренная различными методами, представлена ​​на рисунке 3 (среднее ± SEM). Продуцируемость клеток, измеренная двойным окрашиванием FDA-PI в группах контроля, 25K и 5K, составляла 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% и 43,9 ± 8,6% соответственно ( фиг. 3A ). Показатели жизнеспособности клеток, измеренные тройным окрашиванием FDA-PI-Hoechst в группах контроля, 25K и 5K, составили 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% и 48,3 ± 4,4% соответственно ( фиг. 3B ). Показатели жизнеспособности клеток, измеренные методом МТТ в группах контроля, 25K и 5K, составили 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% и 57,5 ​​± 5,7% соответственно ( фиг. 3C ). Доля высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в группах контроля, 25К и 5К составила 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% и 202,1 ± 15,3% соответственно ( 2 . МТТ-анализ оценивает активность NADPH-зависимой клеточной оксидоредуктазы, которая отражает количество жизнеспособных клеток 2 . Однако этот метод не мог отличить глиальные клетки от нейронов, когда они используются для измерения жизнеспособности нейронов в культуре CGN. Используя окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst, количество глиальных клеток можно было исключить, а жизнеспособность нейронов могла быть точно измерена. Более того, жизнеспособность нейронов в 5K обработанных средой CGNs, измеренная окрашиванием FDA-PI или FDA-PI-Hoechst, была несколько меньше, чем измеренная методом MTT. Это может быть связано с тем, что большинство глиальных клеток, которые не чувствительны к нейротоксичности, вызванной средой 5K, были исключены при окрашивании FDA-PI или FDA-PI-Hoechst, но не при анализе МТТ.

Рисунок 1
Рисунок 1: В культуре CGN присутствуют как малые нейроны, так и крупные, нерегулярные глиальные клетки. На 8-й день в vitr o CGNs были дважды иммунизированы с GAP43 (красный) и GFAP (зеленый) для нейронов и глиальных клеток, соответственно. Изображения с фазовым контрастом показывают морфологию клеток. Традиционные анализы жизнеспособности клеток не могут отличить глиальные клетки от нейронов, когда они используются для измерения жизнеспособности нейронов. Поэтому окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst, которые могут отличать глиальные клетки от нейронов, выгодно для точной оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN. Масштаб: 100 мкм. Синяя стрелка: типичные нейроны; Белая стрелка: типичные глиальные клетки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Двойное окрашивание FDA-PI и тройное окрашивание FDA-PI-Hoechst демонстрируют гибель нейронов, вызванных низким содержанием калия, в культуре CGN. На 8-й день в vitr o культуры CGN переключали на среду 5K или 25K. Среда в контрольных культурах не изменялась. После 24 ч заражения культуры CGN анализировали с помощью двойного окрашивания ( A ) FDA-PI или тройного окрашивания FDA-PI-Hoechst ( B ). Шкала шкалы = 100 мкм. Arrow: типичные глиальные клетки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Количественная оценка жизнеспособности нейронов в культуре CGN. На 8-й день в vitr o культуры CGN переключали на среду 5K или 25K. Среда в культуре контроляS не был изменен. Через 24 часа реакции жизнеспособность клеток анализировали с помощью двойного окрашивания ( A ) FDA-PI, ( B ) трехкратного окрашивания FDA-PI-Hoechst и ( C ) MTT. ( D ) Высвобождение LDH анализировали с помощью анализа LDH. Данные выражены в виде средних ± SEM. ** p <0,01 по сравнению с контролем (ANOVA, тест Тьюки). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол был изменен из процедур, которые были описаны ранее 6 , 7 . Исследователи потратили время, пытаясь уменьшить рост нейрональных клеток, улучшая условия культивирования первичных нейронов in vitro 8 . Однако даже при улучшенных условиях культивирования некоторые глиальные клетки остаются. Более того, не нейронные клетки необходимы в первичных культурах нейронов, потому что они помогают в росте и созревании нейронов 9 . В этом исследовании Ara-C использовался для минимизации роста глиальных клеток, хотя в культуре CGN еще присутствовало около 1-5% глиальных клеток. Эта проблема также представлена ​​в исследованиях других групп 10 . В культуре CGN размеры и формы глиальных клеток в значительной степени отличаются от нейронов. Диаметр CGN составляет около 10 мкм, а зрелые CGN имеют богатые процессы, которые связывают нейроны. ХауVer, диаметр глиальных клеток в культуре относительно большой, около 30-100 мкм, поэтому легко отличить глиальные клетки от нейронов в изображениях. Таким образом, одним из преимуществ окрашивания FDA-PI и FDA-PI-Hoechst является точная оценка жизнеспособности нейронов в первичных культурах нейронов, в которых рост культуры не нейрональных клеток не предотвращается методами культивирования.

Низкий калий-индуцированный апоптоз в культурах CGN, с 25K обработанными средой клетками в качестве контроля, представляет отличную модель для изучения нейронального апоптоза. Многие группы, включая нашу лабораторию, использовали это классическое модельное исследование основных апоптотических механизмов нейронов 2 , 11 . Поэтому эта модель была использована для индукции гибели нейронов. Оптимизирована концентрация красителей и продолжительность окрашивания, используемые в этом протоколе. Низкие концентрации красителей и кратковременная окраска могут вызвать недостаточное окрашивание, приводящее к неточностиДеление мертвых нейронов. Однако высокие концентрации красителей и длительная продолжительность окрашивания могут дополнительно вызывать гибель нейронов и вызывать смещение в оценке жизнеспособности клеток. Таким образом, изображения должны быть приняты как можно скорее после добавления красителей. В двойном окрашивании изображений FDA-PI маленькие FDA-позитивные клетки отмечены как жизнеспособные нейроны. Тем не менее, клетки клетки, как правило, группируются в культуре CGN. Поэтому может быть трудно отделить жизнеспособные клетки по FDA-окрашиванию. В этом исследовании Hoechst, ядерное пятно, использовался для повышения точности. Мелкие клетки с FDA-положительными клеточными телами и Hoechst-позитивными ядрами можно рассматривать как жизнеспособные нейроны в FDA-PI-Hoechst тройном окрашивании изображений.

По сравнению с колориметрическим анализом на цитотоксичность окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst требует больше времени для оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN. Таким образом, текущий протокол может быть непригодным для скрининга нейропротективных лекарств. Однако это ограничениеМогут быть решены с помощью системы визуализации с высоким содержанием. Другим ограничением этого метода является то, что CGNs и глиаль не могут быть различимы по PI. Однако, поскольку нейроны более восприимчивы к нейротоксинам, чем глиальные клетки, PI-положительные мертвые клетки в основном являются нейронами 12 .

Помимо FDA, PI и Hoechst другие красители, такие как MTT, SYTO13 и SYBR14, также используются для измерения жизнеспособности клеток 13 , 14 . Для анализа МТТ глиальные клетки, которые не чувствительны к нейротоксинам, могут преобразовывать МТТ в формазан, что приводит к переоценке жизнеспособности нейронов. SYTO13 является клетопроницаемым и имеет высокий зеленый выход флуоресценции при связывании с ДНК или РНК. Предыдущее исследование показало, что окрашивание SYTO13 в основном указывает на апоптические клетки в культуре CGN, но не отличает глиальные клетки от нейронов 13 . SYBR14 - это краситель с нуклеиновой кислотой, устойчивый к мембранам. Двойное окрашивание SYBR14-PIEd для измерения жизнеспособности клеток, поскольку оба эти красителя маркируют ДНК, что позволяет обойти эту неоднозначность 14 . Однако двойное окрашивание SYBR14-PI не может эффективно отличать глиальные клетки от нейронов в культуре CGN. Поэтому окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst, которые могут отличать глиальные клетки от нейронов, выгодно для точной оценки жизнеспособности нейронов в культуре CGN.

Наконец, окрашивание FDA-PI и FDA-PI-Hoechst не ограничивается анализом жизнеспособности нейронов в культурах CGN. Многие смешанные клеточные культуры ( например, первичные корковые культуры и первичные культуры гиппокампа) также содержат нейроны и глиальные клетки. Таким образом, подобная стратегия может быть применена к смешанным клеточным культурам для точного анализа жизнеспособности нейронов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (LY15H310007), Проекта прикладных исследований некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C37110), Национального фонда естественных наук Китая (U1503223, 81673407), Нинбо Международной науки и Проект по технологическому сотрудничеству (2014D10019), Муниципальная инновационная группа по науке и здоровью Нинбо (2015C110026), Провинциальный проект по науке и технике провинции Гуандун (№ 2013B051000038), Программа научных исследований Шэньчжэня (JCYJ20160331141459373), Гуандун-Хонг (GHP / 012 / 16GD), Совет исследовательских грантов Гонконга (15101014), Гонконгский политехнический университет (G-YBGQ) и Фонд К.С.Вонга Магна в Университете Нинбо.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
  2. Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
  3. Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
  4. Labno, C. Two way to count cells with ImageJ. , https://digital.bsd.uchicago.edu/docs/cell_counting_automated_and_manual.pdf (2008).
  5. Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
  6. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
  7. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  8. Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
  9. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  10. Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
  11. Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
  12. Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
  13. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  14. Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).

Tags

Neuroscience Церебеллярные гранулярные нейроны диацетат флуоресцеина иодид пропидия жизнеспособность клеток глиальные клетки флуоресцентная микроскопия
Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, … More

Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter