本方案描述了如何利用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法，在培养的小脑颗粒神经元（一种常用的原代神经元培养模型）中准确测定神经元存活率。 体外 神经科学和神经药理学研究中的模型
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方法文章
采用荧光素二乙酸酯-碘化丙啶双染法评估小脑颗粒神经元培养物中的神经元存活率
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
原代培养的小脑颗粒神经元（CGNs）已被广泛用作一种 体外 在神经科学和神经药理学研究中，CGN 培养模型具有重要意义。然而，CGN 培养物中胶质细胞与神经元的共存可能导致神经元活力评估结果出现偏差。荧光素二乙酸酯（FDA）与碘化丙啶（PI）双染法可通过同时检测活细胞与死细胞来测定细胞活力。我们采用 FDA-PI 双染法以提高比色法检测的灵敏度，并用于评估 CGN 中的神经元活力。此外，我们还加入了蓝色荧光 DNA 染料（例如， Hoechst）以提高准确性。本方案描述了在小脑颗粒神经元（CGN）培养中利用这些方法提高神经元存活率评估准确性的操作步骤。通过本方案，可借助荧光显微镜排除胶质细胞的数量干扰。类似的策略也可应用于区分多种混合细胞培养体系中的非目标胶质细胞与神经元，例如原代皮层神经元培养和海马神经元培养。
引言
比色法细胞毒性检测（如3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴盐（MTT）检测）常用于体外测定细胞活力。in vitro培养的大鼠小脑颗粒神经元（CGNs）对多种神经毒素敏感，包括1-甲基-4-苯基吡啶离子、过氧化氢和谷氨酸1,2。因此，CGN培养物可作为神经科学领域的体外模型。in vitro培养的CGN可能包含多种细胞类型，包括神经元和胶质细胞，其中胶质细胞约占CGN培养物总细胞数的1%。然而，胶质细胞对神经毒素的反应与神经元不同，这会导致比色法检测所测得的神经元活力出现偏差3。
在活细胞中，荧光素二乙酸酯（FDA）可被酯酶转化为荧光素。碘化丙啶（PI）能够穿透死细胞并与DNA结合，可用于指示培养物中的细胞凋亡。因此，FDA-PI双染色可同时评估活细胞与死细胞，表明结合两种比色方法可更准确地测量细胞活力。此外，通过加入用于细胞核染色的蓝色荧光染料Hoechst，可进一步提高细胞活力检测的准确性。本文所述方案介绍了FDA-PI双染色及FDA-PI-Hoechst三重染色方法，可用于准确分析原代培养颗粒神经元（CGNs）的细胞活力。
本实验方案利用颗粒神经元（CGNs）和胶质细胞在大小和形态上的....
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方案
所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版），并经宁波大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（SYXK-2008-0110）。
1. 溶液与培养基的制备
注意：试剂和储备液需在无菌条件下配制。使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤除菌。
- 通过加入 5 mg 的聚-L-赖氨酸（PLL）制备 PLL 储存液 至10 mL的双蒸水（ddH₂O）2O). 过滤除菌。分装后于 -20 ℃ 保存 PLL 储存液 °可保存数月。
- 通过加入 7.25 g NaCl、0.4 g KCl、0.14 g NaH₂PO₄、0.37 g MgSO₄·7H₂O、0.294 g CaCl₂、2.1 g NaHCO₃ 和 1.7 g 葡萄糖，用去离子水定容至 1 L，配制 Krebs 缓冲液。2PO4，2.6 g D-葡萄糖和5.94 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸加入100 mL ddH2O. 过滤除菌。将 Krebs 缓冲液于 4 ℃ 保存 °C，最长可达一个月。
- 制备 3.82% Mg2SO4 通过加入 3.82 g Mg 溶液
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结果
通过GAP43（红色）和GFAP（绿色）的双重免疫染色，分别分析神经元和胶质细胞的形态2,5。小脑颗粒神经元（CGN）培养物中同时存在神经元和胶质细胞。GFAP阳性的胶质细胞体积较大，形态不规则，如图中箭头所示（图1）。传统的细胞活力检测方法在测定神经元存活率时，无法区分胶质细胞与神经元。因此，FDA-PI以及FDA-PI-Hoechst染色法能够区分胶质细胞与神经元，有助于在CGN培养中对神经元存活率进行准确评估。
采用低钾刺激诱导小脑颗粒神经元（CGN）培养物中的神经元死亡。代表性图像显示了经低钾培养基（5K）、正常培养基（25K）或原始培养基处理的CGN培养物，通过FDA-PI双染色法（图2A）或FDA-PI-Hoechst三染色法（图2B
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讨论
本方案经修改自先前已描述过的方法6,7研究人员花费了大量时间，通过优化原代神经元培养条件来减少非神经元细胞的生长。 体外8然而，即使在培养条件得到改善的情况下，仍会残留一些胶质细胞。此外，在原代神经元培养中，非神经元细胞是必需的，因为它们有助于神经元的生长和成熟。9在本研究中，使用阿糖胞苷（Ara-C）以抑制胶质细胞的生长，尽管在小脑颗粒神经元（CGN）培养中仍存在约1–5%的胶质细胞。该问题同样存在于其他研究团队的研究中。10在CGN培养中，胶质细胞的大小和形态与神经元存在显著差异。CGN的直径约为10 µm，成熟的CGN具有丰富的突起，用于连接其他神经元。然而，培养中的胶质细胞直径相对较大，约为30–100 µm，因此在图像中易于将胶质细胞与神经元区分开来。因此，FDA-PI和FDA-PI-Hoechst染色的一个优势在于，能够在未通过培养技术抑制非神经元细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了浙江省自然科学基金（LY15H310007）、浙江省公益性技术应用研究项目（2016C37110）、国家自然科学基金（U1503223，81673407）、宁波市国际科技合作项目（2014D10019）、宁波市生命科学与健康创新团队项目（2015C110026）、广东省科技计划国际合作项目（No. 2013B051000038）、深圳市基础研究计划（JCYJ20160331141459373）、粤港科技合作资助计划（GHP/012/16GD）、香港研究资助局（15101014）、香港理工大学（G-YBGQ）以及宁波大学“王宽诚”基金的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma | P2636 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷 | Sigma | C1768 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10099141 | 高质量FBS对培养至关重要 |
| 100倍谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 100倍抗生素 | Gibco | 15240062 | |
| 基础伊格尔培养基（BME） | Gibco | 21010046 | |
| 荧光素二乙酸酯（FDA） | Sigma | F7378 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| 兔抗GAP43抗体 | Abcam | ab75810 | |
| 小鼠抗GFAP抗体 | 细胞信号传导 | 3670 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sangon Biotech | A602440 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4665 | |
| DNA酶 | Sigma | D5025 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T9003 | |
| 巴斯德吸管 | Volac | Z310727 | 使用前将尖端烧圆 |
| 12孔细胞培养板 | TPP | Z707783 | |
| 6孔细胞培养板 | TPP | Z707759 | 高质量的细胞培养板对于培养至关重要 |
| 过滤 | Millipore | SLGP033RB | |
| 移液5 mL | Excell Bio | CS017-0003 | |
| 移液10 mL | Excell Bio | CS017-0004 | |
| 解剖显微镜 | 上海凯康 | XTL2400 | |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 311 | |
| 荧光显微镜 | 尼康 | TI-S | |
| 荧光滤光片和发射立方体 | 尼康 | B-2A，G-2A，UV-2A | |
| 图像处理软件 | 尼康 | NIS-Elements | |
| 图形编辑软件 | Adobe | Photoshop CS | |
| 图像处理软件 | 美国国立卫生研究院 | ImageJ |
参考文献
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al.
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重印与许可
