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Neuroscience

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Published: May 10, 2017 doi: 10.3791/55442
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 2,4, 1,2
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Department of Applied Biology and Chemistry Technology, Institute of Modern Chinese Medicine, The Hong Kong Polytechnic University, 3Institute of New Drug Research, Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmacodynamic, Constituents of Traditional Chinese Medicine & New Drug Research, College of Pharmacy, Jinan University, 4International Joint Laboratory (SYSU-PolyU HK) of Novel Anti-Dementia Drugs of Guangdong
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Abstract

Primärkultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) wurden weithin als In-vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet. Allerdings könnte die Koexistenz von Gliazellen und Neuronen in der CGN-Kultur zu Vorspannungen bei der genauen Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit führen. Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) -Phasenfärbung wurde verwendet, um die Zelllebensfähigkeit durch gleichzeitiges Auswerten der lebensfähigen und toten Zellen zu messen. Wir verwendeten FDA-PI-Doppelfärbung, um die Empfindlichkeiten der kolorimetrischen Assays zu verbessern und die neuronale Lebensfähigkeit in CGNs zu bewerten. Darüber hinaus haben wir blau fluoreszierende DNA-Flecken ( zB Hoechst) hinzugefügt, um die Genauigkeit zu verbessern. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Genauigkeit der Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit durch die Verwendung dieser Methoden in CGN Kultur zu verbessern. Mit diesem Protokoll kann die Anzahl der Gliazellen durch die Fluoreszenzmikroskopie ausgeschlossen werden. Eine ähnliche Strategie kann angewendet werden, um das unerwünschte Gli zu unterscheidenAl-Zellen aus Neuronen in verschiedenen gemischten Zellkulturen, wie primäre kortikale Kultur und Hippocampalkultur.

Introduction

Farbmetrische zytotoxische Assays, wie der 3- (4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -Assay, werden üblicherweise zur Messung der Zelllebensfähigkeit in vitro verwendet. Primäre kultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) von Ratten sind empfindlich gegenüber verschiedenen Neurotoxinen, einschließlich 1-Methyl-4-phenylpyridiniumionen, Wasserstoffperoxid und Glutamat 1 , 2 . Daher können CGN-Kulturen als In-vitro- Modell im Bereich der Neurowissenschaften eingesetzt werden. CGN-Kulturen können eine Vielzahl von Zellen enthalten, einschließlich Neuronen und Gliazellen, die etwa 1% der gesamten Zellen in der CGN-Kultur ausmachen können. Allerdings reagieren Gliazellen anders als Neurotoxine im Vergleich zu Neuronen, was zu einer Vorspannung in der neuronalen Lebensfähigkeit führt, gemessen durch kolorimetrische Assays 3 .

In lebensfähigen Zellen kann Fluorescein-Diacetat (FDA) durch Esterase in Fluorescein umgewandelt werden.Propidium-Iodid (PI) kann mit der DNA nach dem Durchdringen von toten Zellen interagieren und kann verwendet werden, um Apoptose innerhalb der Kultur anzuzeigen. Daher kann die FDA-PI-Doppelfärbung gleichzeitig lebensfähige Zellen und tote Zellen auswerten, was darauf hindeutet, dass die Zelllebensfähigkeit durch Kombination von kolorimetrischen Methoden genauer gemessen werden kann. Darüber hinaus könnte durch die Zugabe von Hoechst, einem blauen Fluoreszenzfleck für Kerne, die Genauigkeit der Lebensfähigkeit der Zellen weiter verbessert werden. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die FDA-PI-Doppelfärbung und die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung, mit der die neuronale Lebensfähigkeit in primär kultivierten CGNs genau analysiert werden kann.

Dieses Protokoll nutzt die Visualisierung und Unterscheidung von CGNs und Gliazellen durch ihre unterschiedlichen Größen und Formen. Nach der Färbung werden die Anzahl der lebensfähigen Neuronen und toten Neuronen aus repräsentativen Bildern der Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Die großformatigen Gliazellen werden durch den Vergleich typischer CGNs t ausgeschlossenUnter dem Fluoreszenzmodus mit denen, die unter Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden. Eine ähnliche Strategie kann durchgeführt werden, um die neuronale Lebensfähigkeit in gemischten Zellkulturen zu messen, die Neuronen und Gliazellen enthalten, wie primäre kortikale Kulturen und Hippocampalkulturen.

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Protocol

Alle Verfahren folgten dem National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikationen Nr. 80-23, überarbeitet 1996) und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Ningbo University ( SYXK-2008-0110).

1. Vorbereitung von Lösungen und Kulturmedien

Hinweis: Reagenzien und Bestände müssen unter sterilen Bedingungen vorbereitet werden. Sterilisieren durch Filtrieren unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 μm.

  1. Vorbereitung der Poly-L-Lysin (PLL) Stammlösung durch Zugabe von 5 mg PLL zu 10 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Sterilisieren durch Filtern. Aliquot und lagert die PLL-Stammlösung bei -20 ° C für mehrere Monate.
  2. Man erhält Krebs-Puffer durch Zugabe von 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH 2 PO 4 , 2,6 g D-Glucose und 5,94 g 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazin-methansulfonsäure zu 100 mL DdH 2 </ Sub> O Sterilisieren durch Filtern. Lagern Sie die Krebs-Pufferlösung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
  3. 3,82% Mg 2 SO 4 -Lösung durch Zugabe von 3,82 g Mg 2 SO 4 zu 100 ml ddH 2 O zubereiten. Sterilisieren durch Filtrieren. Die Mg 2 SO 4 -Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
  4. Die 1,2% ige CaCl & sub2 ; -Lösung wird durch Zugabe von 1,2 g CaCl & sub2 ; auf 100 ml ddH & sub2 ; O hergestellt. Sterilisieren durch Filtrieren. Die CaCl 2 -Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
  5. 2M KCl-Lösung durch Zugabe von 15 g KCl zu 100 ml ddH 2 O zubereiten. Sterilisieren durch Filtrieren. Die KCl-Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
  6. Die D-Glucose-Stammlösung wird durch Zugabe von 1,8 g D-Glucose zu 100 ml ddH 2 O hergestellt. Sterilisieren durch Filtrieren. Aliquot und lagert die D-Glucose-Lösung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
  7. Bereiten Sie Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) Stammlöser vorIonen durch Zugabe von 0,24 g Ara-C zu 10 ml ddH 2 O. Sterilisieren durch Filtrieren. Aliquot und lagern die Ara-C-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.
  8. Bereiten Sie 250 ml Kulturmedium (für 25-30 Welpen) mit 25 ml Fetal-Rinder-Serum (FBS), 2,5 ml 100x Glutamin, 2,78 ml 2M KCl-Lösung und 2,5 ml 100x Antibiotika in Basal Medium Eagle (BME) . Stellen Sie die Lautstärke auf 250 ml ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
  9. Vorbereiten des 25K-Mediums unter Verwendung von 2,5 ml 100x Glutamin, 2,78 ml 2M KCl-Lösung und 2,5 ml 100x Antibiotika in BME. Stellen Sie die Lautstärke auf 250 mL ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
  10. Bereiten Sie 5K Medium mit 2,5 ml 100x Glutamin und 2,5 ml 100X Antibiotika in BME vor. Stellen Sie die Lautstärke auf 250 ml ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
    HINWEIS: Das Kulturmedium, 25K Medium und 5K Medium müssen frisch zubereitet werden
  11. Vorbereitung der FDA-Stammlösung durch Zugabe von 5 mg FDA zu 1 ml Aceton. Lagern Sie die FDA-Stammlösung bei 4 ° C für die Langzeitlagerung. </ Li>
  12. Vorbereitung der PI-Stammlösung durch Zugabe von 1 mg PI zu 1 ml ddH 2 O. Lagern Sie die PI-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.
  13. Vorbereitung der Hoechst-Stammlösung durch Zugabe von 5 mg Hoechst 33342 zu 1 ml ddH 2 O. Lagern Sie die Hoechst-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.

2. Vorbereitung von Dissektionslösungen

HINWEIS: Mache das 1 d vor der Sektion.

  1. Bereiten Sie die Dissektionslösung vor, indem Sie 15 ml Krebs-Puffer, 1,2 ml 3,82% Mg 2 SO 4 -Lösung und 0,45 g Rinderserumalbumin (BSA) auf 150 ml ddH 2 O zugeben. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen.
  2. Etikett 5 x 50 ml Röhrchen wie folgt: 1, 2, 3, 4 und 5.
  3. Legen Sie 40 ml Dissektionslösung in eine 50 ml Spritze mit einem Filter. Filtern Sie 30 ml Dissektionslösung in Röhrchen 1 und 2 ml jeweils auf mehrere 35 mm Zellkulturschalen, die zur Verarbeitung von Geweben verwendet werden.
  4. Zu tUbe 2, füge 12,5 mg Trypsin in 50 ml Dissektionslösung hinzu. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
  5. Zu Röhrchen 3 fügen Sie 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 150 μl 3,82% Mg 2 SO 4 -Lösung in 15 ml Dissektionslösung hinzu. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
  6. Zu Röhrchen 4 fügen Sie 5 ml der Lösung aus dem Rohr 3 hinzu. Fügen Sie 10,5 ml Dissektionslösung hinzu. Sterilisieren durch Filtern.
  7. Zu Röhrchen 5 werden 100 μl 3,82% Mg 2 SO 4 -Lösung und 15 μl 1,2% CaCl 2 -Lösung in 12,5 ml Dissektionslösung gegeben. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
  8. Alle Röhrchen vor Gebrauch bei 4 ° C aufbewahren.

3. Beschichtung der Zellkulturplatten

HINWEIS: Mache das 1 d vor der Sektion.

  1. Füge 1 ml PLL-Stammlösung zu 100 ml ddH 2 O hinzu (Endkonzentration: 5 μg / ml). Mantel aus Kunststoff6-Well- oder 12-Well-Zellkulturplatten (2 ml pro Well für 6-Well-Zellkulturplatten oder 1 ml pro Well für 12-Well-Zellkulturplatten) durch Zugabe von 5 & mgr; g / ml Poly-L-Lysinlösung.
  2. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Tag (oder bei 37 ° C für 2 h). 1-2 h vor der zerlegung, entfernen sie die lösung mit einer pipette. Einmal mit ddH 2 O waschen und in der Zellkulturhaube trocknen.

4. Verarbeitung von Geweben für 8 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten.

  1. Setzen Sie eine 100 mm Schale auf Eis. Entkuppeln Sie die Rattenwelpen in die Schale mit einem Paar sterilisierter Schere.
  2. Setzen Sie die Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie die beiden Seiten des Schädels, von den Ohren zu den Augen. Heben Sie den Schädel mit einer Pinzette an. Stellen Sie sicher, dass das ganze Gehirn im Schädel ist. Das Zerebellum isolieren und in die oben genannte 35 mm Schale mit einer Pinzette geben.
  3. Arbeiten unter einem Sektionsmikroskop. Entfernen Sie die Hirnhäute und Blutgefäße mit zwei Pinzettenpaaren.
  4. Hacken Sie die Gewebe mit einer Klinge. Das Gewebe in Röhrchen 1 geben. 5 min bei RT und 1500 x g zentrifugieren.
  5. Sauge den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
  6. Die Lösung in das Rohr 2 zum Pellet geben. Resuspend durch Schütteln sanft.
  7. Legen Sie den Schlauch in ein 37 ° C Wasserbad für 15 min. Schütteln Sie alle 3 Minuten vorsichtig.
  8. Füge die Lösung in Rohr 4 zu dieser Lösung hinzu. Schütteln und zentrifugieren für 5 min bei RT und 1.500 x g.
  9. Sauge den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
  10. Füge die Lösung in Röhrchen 3 hinzu, um das Pellet zu resuspendieren.
  11. Zwei 15-ml-Röhrchen vorbereiten. Lege die Hälfte der Zellen in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie nach unten und unten 60-70x mit einer Wattestäbchen Pasteurpipette, um die Zellen zu homogenisieren.
  12. Füge 3 ml der Lösung in Röhrchen 5 zu jedem 15-ml-Röhrchen hinzu. Lassen Sie sie für 10 Minuten bei RT sitzen und dann den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Baumwolle abziehen. Den Überstand in neue 15 ml Röhrchen geben und 5 min bei RT und 1500 x g zentrifugieren.
  13. EINSpirate den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
  14. Fügen Sie Kulturmedium in das Pellet hinzu, um eine Zelldichte von etwa 1,5 x 10 & sup6; Zellen / ml (etwa 100 ml für 10 Welpen) zu erhalten.
  15. Die Zellen in Kulturplatten geben und im Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 kultivieren.

5. Zugabe von Ara-C und D-Glukose während der Kultivierung

  1. Nach 24 h wird die Ara-C-Stammlösung (10 & mgr; l / Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 20 & mgr; l / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten, Endkonzentration: 1 mM) zugegeben, um das Wachstum der Gliazellen zu hemmen.
  2. Am Tag 7 werden 50 & mgr; l D-Glucose-Stammlösung pro Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 100 & mgr; l pro Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten zugegeben, so dass die Endkonzentration 1 mM beträgt.

6. FDA-PI Doppel-Färbung und FDA-PI-Hoechst Triple Färbung in CGN Kultur

  1. FDA-PI-Arbeitslösung durch Zugabe von 20 μl FDA-Stammlösung (Endkonzentration: 10 & mgr; g / ml) und 50 & mgr; l PI-Stammlösung (Endkonzentration: 50 & mgr; g / ml) in 10 ml PBS. Mischen durch Vortexen und legen Sie diese auf Eis.
    1. Für die FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung werden 20 μl FDA-Stammlösung (Endkonzentration: 10 μg / mL), 50 μl PI-Stammlösung (Endkonzentration: 50 μg / mL) und 10 μl Hoechst-Stammlösung zugegeben (Endkonzentration: 5 & mgr; g / ml) in 10 ml PBS. Mischen durch Vortexen und legen Sie diese auf Eis.
      HINWEIS: FDA-PI-Arbeitslösung und FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung vor der Anwendung frisch vorbereiten.
  2. Nimm die Zellkulturplatte aus dem Inkubator. Setzen Sie es auf Eis.
  3. Aspirieren Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es mit kaltem PBS.
    HINWEIS: Der Lösungswechsel muss langsam und sorgfältig durchgeführt werden. Vermeiden Sie es, die Zellen mit Pipettenspitzen zu berühren.
  4. Aspirieren Sie die kalte PBS und ersetzen Sie sie mit kalter FDA-PI oder FDA-PI-Hoechst Arbeitslösung (500 μl / weLl für 12-Well-Zellkulturplatten oder 1 ml / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten). 5 Minuten auf Eis gehen lassen.
  5. Ansaugen der FDA-PI- oder FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung und Zugabe von kaltem PBS (100 & mgr; l / Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 50 & mgr; l / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten).
    HINWEIS: Die Zellen dürfen beim Fotografieren nicht trocknen.
  6. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Verwenden Sie einen Anregungsfilter mit einem Durchlassband von 450 - 490 nm. Erfassen Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA, PI und Hoechst bei 520, 620 bzw. 460 nm. Unter den gleichen Bedingungen, nehmen Sie ein Bild unter normalem Licht mit dem Phasenkontrast Modus der Fluoreszenz-Mikroskopie.
    HINWEIS: Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach FDA-PI oder FDA-PI-Hoechst Färbung. Die Belichtungszeit beträgt 100-300 ms und die analoge Verstärkung beträgt 2,8x.

7. Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit

  1. Für FDA-PI Doppel-Färbung, überlagern die Bilder der Zellen nach dem Filtern erkanntDurch unterschiedliche Fluoreszenzfilter durch Ziehen der FDA-positiven Schicht auf der PI-positiven Schicht in einer Grafik-Editor-Software.
    1. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie im Feld "Deckkraft" im Feld "Ebenen" "50%" eingeben. Füge zwei Ebenen zusammen, indem du im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klickst. Setzen Sie den Kontrast der Overlay-Bilder durch Eingabe von "50" im Feld "Kontrast" unter "Bild" "Anpassungen" | "Helligkeit Kontrast." Stellen Sie sicher, dass es keine FDA- und PI-Doppel-Positiv-Zelle in den Overlay-Bildern gibt.
  2. Für die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung überlagern die Bilder der Zellen nach dem Filtern verschiedener Fluoreszenzfilter, indem sie die FDA-positive Schicht auf der PI-positiven Schicht in einer Grafik-Editor-Software ziehen. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie "50%" im Feld "Deckkraft" der "Ebenen & #34; Tafel
    1. Füge zwei Ebenen zusammen, indem du im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klickst. Ziehe die Hoechst-positive Schicht auf die verschmolzene Schicht. Passen Sie die Deckkraft der Hoechst-positiven Schicht an, indem Sie im Feld "Deckkraft" im Feld "Ebenen" "50%" eingeben. Fügen Sie die beiden Ebenen zusammen, indem Sie im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klicken.
  3. Visuelle Unterscheidung von großen, unregelmäßigen Gliazellen aus CGNs durch Vergleich der im Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bilder mit denen, die unter Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden - Zellen mit dreifach größeren Durchmessern als CGNs gelten als Gliazellen und sollten ausgeschlossen werden.
  4. Zähle die Anzahl der lebensfähigen Neuronen bzw. toten Neuronen unter Verwendung eines Zellenzähler-Plugins in einem Bildverarbeitungsprogramm ( zB ImageJ) 4 .
    1. Für FDA-PI Doppel-Färbung, manuell markieren kleine FDA-positiven Zellen alsLebensfähige neuronen Manuell markieren PI-positive Zellen als tote Neuronen. Für FDA-PI-Hoechst Triple Färbung, manuell markieren kleine FDA- und Hoechst-Doppel-positive Zellen als lebensfähige Neuronen. Manuell markieren PI- und Hoechst-Doppel-positive Zellen als tote Neuronen.
  5. Berechnen Sie den Prozentsatz der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% der neuronalen Lebensfähigkeit = [Anzahl der lebensfähigen Neuronen / (Anzahl der toten Neuronen + Anzahl der lebensfähigen Neuronen)] x 100%. Für jeden Brunnen, wählen Sie fünf zufällige Felder und durchschnittlich den Prozentsatz der neuronalen Lebensfähigkeit.

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Representative Results

Die doppelte Immunfärbung von GAP43 (rot) und GFAP (grün) wurde verwendet, um die Form von Neuronen und Gliazellen bzw. 2 , 5 zu analysieren. Sowohl Neuronen als auch Gliazellen sind in der CGN-Kultur vorhanden. Die GFAP-positiven Gliazellen sind groß und unregelmäßig in der Form, wie durch die Pfeile in den Bildern angedeutet (Abbildung 1 ). Traditionelle Assays für Zellvitalität können keine Gliazellen von Neuronen unterscheiden, wenn sie zur Messung der neuronalen Lebensfähigkeit verwendet werden. Daher sind FDA-PI- und FDA-PI-Hoechst-Färbungen, die Gliazellen von Neuronen unterscheiden können, für die genaue Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur vorteilhaft.

Die Niedrig-Kalium-Herausforderung wurde verwendet, um den neuronalen Tod in einer CGN-Kultur zu induzieren. Die repräsentativen Bilder zeigen die CGN-Kultur, die mit einem Niedrigkalium-Medium (5K), normalem Medium (25K) oder Origi herausgefordert wird( Abb. 2A ) oder FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung ( Abbildung 2B ), analysiert durch FDA-PI-Doppelfärbung ( Abbildung 2A ) Die nach verschiedenen Methoden gemessene neuronale Lebensfähigkeit ist in Abbildung 3 (Mittelwert ± SEM) dargestellt. Die Zell-Viabilitäten, gemessen durch FDA-PI-Doppelfärbung in den Kontroll-, 25K- und 5K-Gruppen, betrugen 99,8 ± 4,2%, 98,2 ± 2,9% bzw. 43,9 ± 8,6% ( 3A ). Die durch die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung in den Kontroll-, 25K- und 5K-Gruppen gemessenen Zelllebensfähigkeiten betrugen 99,8 ± 1,6%, 96,7 ± 4,4% bzw. 48,3 ± 4,4% (Abbildung 3B ). Die durch den MTT-Assay gemessenen Zelllebensstufen in den Kontroll-, 25K- und 5K-Gruppen betrugen 102,1 ± 3,9%, 96,5 ± 1,7% bzw. 57,5 ​​± 5,7% (Abbildung 3C ). Die Prozentsätze der milchfreien Dehydrogenase (LDH) Freisetzung in den Kontroll-, 25K- und 5K-Gruppen waren 100,0 ± 5,5%, 94,5 ± 11,2% bzw. 202,1 ± 15,3% ( 2 . Der MTT-Assay beurteilt die Aktivität der NADPH-abhängigen zellulären Oxidoreduktase, die die Anzahl der lebensfähigen Zellen widerspiegelt 2 . Diese Methode konnte jedoch keine Gliazellen von Neuronen unterscheiden, wenn sie zur Messung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur verwendet wurden. Durch die Verwendung von FDA-PI und FDA-PI-Hoechst-Färbung konnte die Anzahl der Gliazellen ausgeschlossen werden, und die neuronale Lebensfähigkeit konnte genau gemessen werden. Darüber hinaus war die neuronale Lebensfähigkeit in 5K mittelbehandelten CGNs, gemessen durch FDA-PI- oder FDA-PI-Hoechst-Färbung, etwas kleiner als die, die durch MTT-Assay gemessen wurde. Dies könnte daran liegen, dass die meisten Gliazellen, die nicht empfindlich auf 5K mittelinduzierte Neurotoxizität waren, durch FDA-PI oder FDA-PI-Hoechst-Färbung, aber nicht durch den MTT-Test ausgeschlossen wurden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Sowohl kleine Neuronen als auch große, unregelmäßige Gliazellen sind in der CGN-Kultur präsent. Am Tag 8 in vitr o wurden CGNs mit GAP43 (rot) und GFAP (grün) für Neuronen bzw. Gliazellen doppelt immunostainiert. Die Phasenkontrastbilder zeigen die Morphologie der Zellen. Traditionelle Assays für Zellvitalität können keine Gliazellen von Neuronen unterscheiden, wenn sie zur Messung der neuronalen Lebensfähigkeit verwendet werden. Daher sind FDA-PI- und FDA-PI-Hoechst-Färbungen, die Gliazellen von Neuronen unterscheiden können, für die genaue Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur vorteilhaft. Maßstab: 100 μm. Blauer Pfeil: typische Neuronen; Weißer Pfeil: typische Gliazellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: FDA-PI-Doppel-Färbung und FDA-PI-Hoechst-Dreifach-Färbung zeigen Niedrigkalium-induzierten neuronalen Tod in der CGN-Kultur. Am Tag 8 in vitr o wurden CGN-Kulturen auf 5K oder 25K Medium umgestellt . Das Medium in den Kontrollkulturen wurde nicht verändert. Nach 24 h Herausforderung wurden die CGN-Kulturen durch ( A ) FDA-PI-Doppelfärbung oder ( B ) FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung untersucht. Maßstab = 100 μm. Pfeil: typische Gliazellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Quantifizierung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur. Am Tag 8 in vitr o wurden CGN-Kulturen auf 5K oder 25K Medium umgestellt . Das Medium in der KontrollkulturS wurde nicht verändert. Nach 24 h Herausforderung wurde die Zelllebensfähigkeit durch ( A ) FDA-PI-Doppelfärbung, ( B ) FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung und ( C ) MTT-Assay analysiert. ( D ) Die LDH-Freisetzung wurde durch LDH-Assay analysiert. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. ** p <0,01 versus Kontrolle (ANOVA, Tukey-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll wurde von Prozeduren modifiziert, die zuvor beschrieben wurden 6 , 7 . Forscher haben Zeit damit verbracht, das nicht-neuronale Zellwachstum zu reduzieren, indem sie die Bedingungen bei der Kultivierung primärer Neuronen in vitro verbessern. Doch auch bei verbesserten Kulturbedingungen bleiben einige Gliazellen erhalten. Darüber hinaus sind nicht-neuronale Zellen in primären neuronalen Kulturen notwendig, weil sie mit neuronalem Wachstum und Reifung helfen 9 . In dieser Studie wurde Ara-C verwendet, um das Wachstum von Gliazellen zu minimieren, obwohl es noch etwa eine 1 - 5% Anwesenheit von Gliazellen in der CGN-Kultur gab. Dieses Problem wird auch in Studien der anderen Gruppen vorgestellt 10 . In der CGN-Kultur unterscheiden sich die Größen und Formen von Gliazellen weitgehend von Neuronen. Der Durchmesser der CGNs beträgt etwa 10 μm, und reife CGNs haben reiche Prozesse, die die Neuronen verbinden. HoweDer Durchmesser der Gliazellen in der Kultur ist relativ groß, etwa 30-100 μm, so dass es leicht ist, Gliazellen von Neuronen in Bildern zu unterscheiden. Daher ist ein Vorteil der FDA-PI- und FDA-PI-Hoechst-Färbung, die neuronale Lebensfähigkeit in primären neuronalen Kulturen genau zu messen, in denen das nicht-neuronale Zellwachstum nicht durch die Kulturtechniken verhindert wird.

Niedrig-Kalium-induzierte Apoptose in CGN-Kulturen, mit 25K mittelbehandelten Zellen als Kontrolle, stellt ein hervorragendes Modell zur Untersuchung der neuronalen Apoptose dar. Viele Gruppen, darunter unser Labor, haben diese klassische Modellstudie die zugrunde liegenden apoptotischen Mechanismen der Neuronen 2 , 11 verwendet. Daher wurde dieses Modell verwendet, um neuronalen Tod zu induzieren. Die Konzentration der Farbstoffe und die Dauer der in diesem Protokoll verwendeten Färbung wurden optimiert. Niedrige Konzentrationen von Farbstoffen und kurzen Daumen der Färbung können zu einer unzureichenden Färbung führen, was zu dem ungenauen Cou. FührtNt der toten Neuronen. Allerdings können hohe Konzentrationen von Farbstoffen und verlängerte Dauer der Färbung weiter neuronalen Tod induzieren und eine Vorspannung in der Schätzung der Zelllebensfähigkeit verursachen. Daher sollten die Bilder so schnell wie möglich nach dem Hinzufügen der Farbstoffe aufgenommen werden. In den FDA-PI-Doppelfärbungsbildern sind kleine FDA-positive Zellen als lebensfähige Neuronen markiert. Allerdings neigen Zellkörper dazu, in CGN-Kultur zu gruppieren. Daher kann es schwierig sein, lebensfähige Zellen durch FDA-Färbung zu trennen. In dieser Studie wurde Hoechst, ein Kernfleck, verwendet, um die Genauigkeit zu verbessern. Kleine Zellen mit FDA-positiven Zellkörpern und Hoechst-positiven Kernen können als lebensfähige Neuronen in FDA-PI-Hoechst Triple Färbebildern angesehen werden.

Im Vergleich zu kolorimetrischen Zytotoxizitäts-Assays benötigen FDA-PI- und FDA-PI-Hoechst-Färbung mehr Zeit für die Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur. Daher ist das aktuelle Protokoll möglicherweise nicht geeignet, um neuroprotektive Medikamente zu screenen. Diese EinschränkungKann durch die Verwendung eines hochauflösenden Bildgebungssystems gelöst werden. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist, dass CGNs und Glial nicht von PI diskriminiert werden können. Da jedoch Neuronen anfälliger für Neurotoxine als Gliazellen sind, sind PI-positive tote Zellen hauptsächlich Neuronen 12 .

Neben FDA, PI und Hoechst werden auch andere Farbstoffe wie MTT, SYTO13 und SYBR14 zur Messung der Zelllebensfähigkeit 13 , 14 verwendet. Für den MTT-Test können Gliazellen, die nicht für Neurotoxine empfindlich sind, MTT in Formazan umwandeln, was zu einer Überbewertung der neuronalen Lebensfähigkeit führt. SYTO13 ist zellpermeabel und hat eine hohe grüne Fluoreszenzausbeute, wenn es an DNA oder RNA gebunden ist. Eine vorherige Studie deutete darauf hin, dass die SYTO13-Färbung hauptsächlich apoptotische Zellen in der CGN-Kultur anzeigt, aber keine Gliazellen von Neuronen 13 unterscheidet. SYBR14 ist ein membran-permanenter Nukleinsäurefarbstoff. SYBR14-PI Doppelfärbung ist unsUm die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, da beide Farbstoffe die DNA markieren und dadurch die Mehrdeutigkeit 14 umgehen. Allerdings kann die SYBR14-PI-Doppelfärbung keine Gliazellen von Neuronen in der CGN-Kultur effektiv unterscheiden. Daher sind FDA-PI- und FDA-PI-Hoechst-Färbungen, die Gliazellen von Neuronen unterscheiden können, für die genaue Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit in der CGN-Kultur vorteilhaft.

Schließlich sind FDA-PI und FDA-PI-Hoechst-Färbung nicht auf die Analyse der neuronalen Lebensfähigkeit in CGN-Kulturen beschränkt. Viele gemischte Zellkulturen ( zB primäre kortikale Kulturen und primäre Hippocampalkulturen) enthalten auch Neuronen und Gliazellen. Daher kann eine ähnliche Strategie auf diese gemischten Zellkulturen angewendet werden, um die neuronale Lebensfähigkeit genau zu analysieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Zhejiang (LY15H310007), dem angewandten Forschungsprojekt zur gemeinnützigen Technologie der Provinz Zhejiang (2016C37110), der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (U1503223, 81673407), der Ningbo International Science und Technology Cooperation Project (2014D10019), die Ningbo Municipal Innovation Team of Life Science und Gesundheit (2015C110026), die Guangdong Provincial International Cooperation Projekt der Wissenschaft und Technologie (Nr. 2013B051000038), die Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20160331141459373), die Guangdong-Hong Kong Technology Cooperation Funding Scheme (GHP / 012 / 16GD), der Forschungsstipendienrat von Hongkong (15101014), die Polytechnische Universität Hongkong (G-YBGQ) und der KC Wong Magna Fund an der Ningbo University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma P2636
D-glucose Sigma G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside Sigma C1768
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099141 high quality FBS is essential for culture
100x glutamine Gibco 25030081
100x antibiotics Gibco 15240062
Basal Medium Eagle (BME) Gibco 21010046
Fluorescein diacetate (FDA) Sigma F7378
Propidium Iodide (PI) Sigma P4170
Hoechst 33342 Yesen 40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody Abcam ab75810
mouse Anti-GFAP antibody Cellsignaling 3670
Bovine Serum Albumin (BSA) Sangon Biotech A602440
Trypsin Sigma T4665
DNAse Sigma D5025
Soybean trypsin inhibitor Sigma T9003
Pasteur pipette Volac Z310727 burn the tip round before use
12-well cell culture plates TPP Z707783
6-well cell culture plates TPP Z707759 high quality cell culture plate is essential for culture
Filter Millipore SLGP033RB
Pipet 5 mL Excell Bio CS017-0003
Pipet 10 mL Excell Bio CS017-0004
Dissect microscope Shanghai Caikang XTL2400
CO2 Incubator Thermo Scientific 311
Fluorescence microscope Nikon TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes Nikon B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software Nikon NIS-Elements
Graphics editor softeware Adobe Photoshop CS
Image processing software NIH ImageJ

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Neurowissenschaften Ausgabe 123 Cerebelläre Granulatneurone Fluoresceindiacetat Propidiumjodid Zelllebensfähigkeit Gliazellen Fluoreszenzmikroskopie
Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur
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Jiajia, L., Shinghung, M., Jiacheng, Z., Jialing, W., Dilin, X., Shengquan, H., Zaijun, Z., Qinwen, W., Yifan, H., Wei, C. Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture. J. Vis. Exp. (123), e55442, doi:10.3791/55442 (2017).

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