Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

Summary

Qui, descriviamo modelli zebrafish xenotrapianto utilizzando due differenti siti di iniezione, vale a dire, lo spazio perivitellino e condotto di Cuvier, per studiare il comportamento invasivo e per valutare l'intravasation e stravaso potenziale delle cellule umane di cancro al seno, rispettivamente.

Abstract

In molti casi, i malati di cancro non muoiono di un tumore primario, ma piuttosto a causa di metastasi. Sebbene numerosi modelli di roditori sono disponibili per lo studio metastasi del cancro in vivo, sono necessari altri affidabili modelli a basso costo, efficienti, per accedere rapidamente i potenziali effetti di (epi) cambiamenti genetici o composti farmacologici. Come tale, illustriamo e spieghiamo la fattibilità di modelli di xenotrapianto usando cellule di cancro al seno umane iniettate in embrioni di zebrafish per sostenere questo obiettivo. Al microscopio, proteine fluorescenti o cellule di cancro al seno umano etichettati chimicamente vengono trapiantate in embrioni di zebrafish transgenici, Tg (fli: EGFP), presso lo spazio perivitellino o condotto di Cuvier (doc) 48 ore dopo la fecondazione. Poco dopo, il processo temporale-spaziale di invasione delle cellule del cancro, la diffusione, e le metastasi nel corpo di pesce vivente viene visualizzato sotto un microscopio a fluorescenza. I modelli utilizzano differenti siti di iniezione, cioè, perspazio ivitelline o Doc sono complementari l'uno all'altro, che riflette la fase iniziale (fase intravasation) e fase tardiva (fase stravaso) della cascata metastatica multistep di eventi. Inoltre, angiogenesi peritumorale e intratumorale può essere osservato con l'iniezione nello spazio perivitellino. L'intero periodo di sperimentazione non più di 8 giorni è. Questi due modelli combinano marcatura delle cellule, micro-trapianto, e tecniche di imaging di fluorescenza, consentendo la rapida valutazione delle metastasi del cancro in risposta a manipolazioni genetiche e farmacologiche.

Introduction

Overt metastasi del cancro in clinica comprende una serie di eventi complessi e multi-step conosciuti come "a cascata metastatica". La cascata è stato ampiamente rivisto e può essere sezionato in fasi successive: diffusione locale, intravasation, diffusione, arresto, stravaso e colonizzazione ^{1, 2.} Una migliore comprensione della patogenesi di metastasi del cancro e lo sviluppo di possibili strategie di trattamento in vivo richiede robusti modelli di accoglienza di diffusione delle cellule del cancro. Modelli di roditori sono ben consolidata e sono ampiamente utilizzati per valutare metastasi ^3, ma questi approcci hanno bassa efficienza e limitazioni etiche e sono costosi come modello prima linea per determinare se una particolare manipolazione potrebbe influenzare il fenotipo metastatico. Altri modelli di efficiente, affidabile, a basso costo sono necessari per accedere rapidamente i potenziali effetti di (epi) cambiamenti genetici o pharmacologComposti iCal. Grazie alla loro elevata omologia genetica per l'uomo e la trasparenza della loro embrioni zebrafish (Danio rerio) sono emersi come un importante modello di vertebrati e sono sempre più applicata allo studio dei processi di sviluppo, interazioni microbo-ospite, malattie umane, lo screening di stupefacenti, ecc . ^4. I modelli di metastasi del cancro stabiliti in zebrafish possono fornire una risposta alle carenze di modelli di roditori ^{5, 6.}

Anche se neoplasia spontanea è scarsamente visibile in zebrafish selvaggio ^7, ci sono diverse tecniche di lunga data per indurre il cancro desiderato in zebrafish. Mutazioni geniche cancerogeni indotti o attivazione della via di segnalazione possono istologicamente e modello di carcinogenesi molecolare, imitando malattia umana in zebrafish ^{7, 8, 9.} Con taking vantaggio di vario avanti e indietro manipolazioni genetiche di oncogeni o soppressori tumorali, (transgenico) zebrafish hanno inoltre permesso potenziali studi di formazione e manutenzione ^{6, 10} cancro. I modelli di cancro indotti in zebrafish coprono un ampio spettro, tra cui digestivo, riproduttivo, del sangue, del sistema nervoso, e epiteliale ^6.

L'utilizzo di zebrafish nella ricerca sul cancro ha ampliato di recente a causa della creazione di modelli di xenotrapianto di cellule tumorali umane in questo organismo. Questo è stato segnalato con le cellule metastatiche di melanoma umane che sono state innestate con successo in embrioni di zebrafish allo stadio di blastula nel 2005 ^11. Diversi laboratori indipendenti hanno convalidato la fattibilità di questo lavoro pionieristico con l'introduzione di una gamma diversificata di linee cellulari di mammifero tumorali in zebrafish in vari siti e le fasi di sviluppo ^{5 <}/ Sup>. Ad esempio, le iniezioni vicino blastodisco e blastocisti della fase blastula; iniezioni nel sacco vitellino, spazio perivitellino, condotto di Cuvier (Doc), e posteriore cardinale vena di 6-H per 5 giorni di età embrioni; e le iniezioni nella cavità peritoneale di 30 giorni di età larve immunodepressi sono state eseguite ^{5, 12.} Inoltre, trapianti allogenici tumorali sono stati segnalati anche in zebrafish ^{12, 13.} Uno dei grandi vantaggi di utilizzare xenotrapianti è che le cellule tumorali trapiantate possono essere facilmente fluorescente e distinto dalle cellule normali. Quindi, indagini sulle comportamenti dinamici della formazione microtumor ^14, invasione delle cellule e metastasi ^{15, 16, 17,} l'angiogenesi indotta da tumore ^{15, 1}8, e le interazioni tra cellule tumorali e di accoglienza fattori di ¹⁷ possono essere visualizzate in modo chiaro nel corpo pesci vivi, in particolare quando le linee di zebrafish transgenici sono applicati ^5.

Ispirato l'elevato potenziale di modelli xenotrapianto zebrafish valutare metastasi, abbiamo dimostrato le proprietà stravaso transvascular di differenti linee cellulari di cancro della mammella nella zona tailfin di Tg (fli: EGFP) zebrafish embrioni mediante iniezioni doc ^16. Il ruolo del fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) proteine ¹⁶ e ossa morfogenetica (BMP) ¹⁹ percorsi di segnalazione in pro- / anti-seno invasione delle cellule del cancro e le metastasi sono stati anche indagato in questo modello. Inoltre, abbiamo anche la capacità ricapitolammo intravasation di diverse linee di cellule di cancro al seno in circolazione utilizzando modelli zebrafish xenotrapianto con iniezioni di spazio perivitellino.

Protocol

Tutte le ricerche utilizzando il transgenico fluorescente zebrafish Tg (fli: EGFP) ceppo, che ha migliorato la proteina fluorescente verde (EGFP) -labeled vascolare ^20, compresi gli alloggi e gli esperimenti, è stata effettuata secondo le linee guida internazionali ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale locale for Animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) del Leiden University Medical Center.

NOTA: Come riassunto nella Figura 1, il protocollo è approssimativamente suddiviso in quattro fasi: raccolta di embrioni (Figura 1A), microiniezione (Figura 1B), screening (Figura 1C), e analisi (Figura 1D).

1. Preparare i aghi da iniezione

1. Preparare aghi da iniezione con microcapillari vetro borosilicato. Mettere un microcapillare in un dispositivo estrattore micropipetta con le seguenti impostazioni: pressione dell'aria, 500; calore, 650; tirare, 100; velocità, 200; tempo,40. Mantenere gli aghi di iniezione in un piatto porta-aghi finché non vengono utilizzati per l'iniezione.

2. Preparare le fluorescenti, geneticamente etichettati cellule tumorali del seno per iniezione

1. cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule di coltura a 37 ° C in terreno DMEM ad alto glucosio contenenti L-glutammina, siero bovino fetale al 10%, e 1: 100 penicillina-streptomicina (pen-strep).
2. Cultura le linee epiteliali seno cellulari, MCF10A (M1) e MCF10A-Ras (M2), a 37 ° C in DMEM media / F12 contenente L-glutammina con siero di cavallo 5%, 20 ng / mL fattore di crescita epidermico, 10 mg / ml insulina, 100 ng / mL colera enterotossina, 0,5 mg / ml di idrocortisone, e 1: 100 pen-strep.
3. Produrre mCherry lentivirus mediante co-trasfezione PLV-mCherry, pCMV-VSVG ^21, pMDLg-RRE (gag / pol) ^22, e pRSV-REV ²² plasmide in cellule HEK293T. supernatanti cellulari raccolto 48 ore dopo la trasfezione e conservare a -80 ° C.
4. ionfect cellule MDA-MB-231, M1, M2 e al 30% di confluenza per 24 ore con supernatanti lentivirali diluito 1: 1 con mezzo di coltura normale in presenza di 5 ng / mL polibrene.
5. Selezionare cloni monocellulari diluendo cellule in una piastra a 96 pozzetti, che permette la conseguenza di cloni cellulari isolate, fino ad ottenere le linee cellulari che esprimono mCherry stabili.
6. Cultura uno T75 pallone di cellule per iniezione. Raccogliere le cellule a 80% di confluenza con un trattamento tripsina-EDTA 0,5%. Lavare le cellule con tempi 1x PBS 2-3.
7. Risospendere le cellule in circa 200 ml di PBS. Conservare a loro 4 ° C per meno di 5 ore prima dell'iniezione.

3. Preparare embrioni di zebrafish per iniezione

1. Impostare coppie di allevamento zebrafish e raccogliere embrioni, come mostrato in un precedente articolo JOVE da Rosen et al. ^23.
2. Selezionare gli embrioni che sono a 0-4 HPF rimuovendo gli embrioni non fecondate e anormali. Mantenere gli embrioni in un dis Petrih pieno di acqua uovo (/ mL sali marini 60 ug; ~ 60 embrioni / piatto) e incubare a 28 ° C.
3. Dechorionate gli embrioni con una pinzetta sottile a 48 HPF.
4. Anestetizzare gli embrioni trasferendoli a 40 ug / mL tricaine (acido 3-aminobenzoico) contenente acqua uovo circa 2 minuti prima dell'iniezione, ma non più di 2 ore prima dell'iniezione.
   NOTA: soluzione madre Tricaine (4 mg / ml, 100x) viene preparato come 400 mg di polvere tricaine in 97,9 ml di acqua bidistillata e 2,1 ml di 1 M Tris-base (pH 9), con il pH regolato a 7,4. Conservare nel congelatore a -20 ° C.

4. Iniettare cellule umane del cancro della mammella nel perivitellino Spazio

1. Carico 15 microlitri della sospensione cellulare in un ago di iniezione. Montare l'ago sulla micromanipolatore e rompere la punta dell'ago con pinzette sottili per ottenere un diametro di 5-10 um tipo apertura.
2. Utilizzare un picopump pneumatico ed un manipolatore per eseguire la microiniezione. ADJUv il picopump iniettare 400 cellule per volta. Prima dell'iniezione, contare il numero di cellule manualmente iniettando le cellule sulla parte superiore di una piastra di Petri contenente 1% di agarosio.
3. Line up anestetizzato embrioni (2-3 giorni dopo la fecondazione (DPF)) su una, 1% agarosio piastra iniettando piatta, circa 10 embrioni ogni volta.
4. Orientare la piastra di iniezione a mano durante le iniezioni per posizionare gli embrioni in posizione preferita per l'inserimento dell'ago (cioè, in diagonale).
5. Puntare la punta dell'ago nel sito di iniezione e inserire delicatamente la punta dell'ago nello spazio perivitellino tra il sacco vitellino e la periderm dell'embrione zebrafish (Figura 2A).
6. Iniettare circa 400 cellule tumorali mCherry marcato. Assicurarsi che il sacco vitellino non è rotto per evitare di impianto nel sacco vitellino.

5. Iniettare cellule di carcinoma mammario umano nel doc

1. Preparare l'ago di iniezione ed embrioni di zebrafish come descritto i protocollo n passaggi 1, 2 e 3.
2. Utilizzare un angolo di ago 45 ° in modo che il Doc può essere avvicinato dal lato dorsale dell'embrione.
3. Inserire l'ago nel punto di partenza del Doc (Figura 3A), solo dorsale dove il condotto inizia ampliando il sacco vitellino e iniettare circa 400 cellule; l'iniezione è corretta se il volume all'interno del condotto espande direttamente dopo l'impulso e il sacco vitellino.
   NOTA: Diverse iniezioni consecutive può essere eseguita senza estrarre l'ago.
4. Trasferire gli embrioni di zebrafish iniettati all'acqua uovo.
   NOTA: Come considerevole variazione esiste tra singoli zebrafish embrioni, e come la morte di embrioni dopo l'iniezione può avvenire, un numero relativamente elevato di embrioni di zebrafish (circa 100) deve essere iniettato con cellule tumorali.
5. Mantenere gli embrioni zebrafish a 33 ° C per soddisfare i requisiti di temperatura ottimali per pesci e cellule di mammifero.

_title "> 6. Filtra l'embrioni iniettati

1. Schermo ogni pesce sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza a 2 ore dopo l'iniezione (HPI) per l'iniezione spazio perivitellino (figura 2) o 2-24 HPI per l'iniezione Doc (Figura 2) per garantire che tutti gli embrioni vengono iniettati con numero simile di cellule tumorali. Rimuovere gli embrioni con errori di iniezione, quali rotture (Figura 2B) o iniezioni (Figura 3b) del sacco vitellino e scegliere embrioni con cellule iniettate sotto (figure 2C e 3B) o superiore (figure 2D e 3B) soglia. Mantenere solo gli embrioni con circa 400 cellule in coltura.
2. Escludere la possibilità che le cellule vengono introdotti direttamente nella circolazione durante il processo di iniezione, eliminando gli embrioni con cellule già in circolazione. Inoltre, rimuovere eventuali embrione con una cella massa vicino al Doc (Figura 2D

7. immagine e analizzare il processo metastatico

1. Raccogliere diversi embrioni anestetizzati con una pipetta Pasteur livello punta e trasferirli al fondo di vetro di un piatto polistirene.
2. Rimuovere l'acqua in eccesso e mantenere una quantità limitata di acqua uovo. Manipolare l'embrione in posizione con uno strumento ciclo capelli e posizionare un coperchio sulla parte superiore del vetro.
3. Utilizzare un microscopio confocale rovesciato in combinazione con l'acqua-immersione o di lunga distanza obiettivi a secco. Posizionare l'embrione tale che la regione di interesse è il più vicino obiettivo possibile.
4. Eseguire l'imaging subito dopo l'anestesia per ridurre il rischio di morte a causa di evaporazione del liquido.
   1. segnali cattura di vascolarizzazione EGFP-marcato e le cellule tumorali mCherry marcate nella stessa posizione sulle embrioni di co-registro cellule con vasi sanguigni iniettato mediante la fusione dei due canali di imaging.
   2. Per ogni zebrafish, raccogliere due diversi insiemi di immaginidalla regione regione testa coda.
5. Quantificare il numero di cellule disseminate.
   1. Per le iniezioni spazio perivitellino, contare il numero di cellule in ogni pesce che sono diffuse dalla massa cellulare verso il corpo di pesce embrionale all'interno della testa e di coda regioni ^{4, 15;} le regioni sono al di là dei confini della cavità cuore frontalmente, in cima alla dorsale vescica natatoria, e oltre l'apertura urogenitale caudale.
   2. Per l'iniezione Doc, contare il numero di cellule individuali che hanno invaso le fibre collagene tailfin dalla circolazione (MDA-MB-231) o il numero di cluster formati da cellule collettivamente (M2) nel tessuto emopoietico caudale (CHT) di ogni zebrafish ^19.
6. Studio invasione e metastasi in modo più dettagliato, utilizzando la microscopia confocale (altamente consigliato).
   1. Utilizzare basso ingrandimento (obiettivo 4X) all'immagine tuttacorpo e per ottenere una panoramica del modello di diffusione delle cellule tumorali.
      NOTA: Maggiore ingrandimento (20X e 40X obiettivi) è adatto per studiare l'angiogenesi intra e peri-tumorale e la precisa localizzazione delle cellule disseminate nel corpo embrionale.
   2. Utilizzare un laser 488 nm per scansionare la vascolarizzazione zebrafish e un laser 543 nm a scansione cellule tumorali impiantate marcate con fluorescenza rossa. Ottenere un'immagine di alta qualità mediante la scansione di ogni embrione in otto a dieci passi. Scansione e la media ogni passo sei volte.
7. Posizionare con cura l'embrione di nuovo in acqua uovo se è necessario per ulteriori esperimenti.

8. effettuare analisi statistiche Utilizzando One-analisi della varianza (ANOVA) Seguito da un'analisi post hoc

Representative Results

Nel modello embrionale zebrafish xenotrapianto con un'iniezione spazio perivitellino, la diffusione ematogena delle cellule tumorali marcate nel corpo pesce è considerato migrazione attiva. Questo processo può essere rilevata e quantificata con un microscopio a fluorescenza, come descritto nei metodi sopra. Per illustrare questo modello di xenotrapianto, abbiamo seguito il processo di diffusione di differenti linee cellulari di cancro al seno con nota (o senza) invasione / potenziale metastasi secondo in vitro e in topo vivo incluso le cellule M1 benigna normale epiteliali della mammella, precancerosa HRAS trasformate cellule M2, e altamente metastatici MDA-MB-231 cellule, dopo l'iniezione 1 giorno (dpi) in poi. Un'immagine microscopia confocale ad alta risoluzione, ha dimostrato che MDA-MB-231 cellule (rosso) mostrano un fenotipo aggressivo, con bordi irregolari nello spazio perivitellino. sporgenze pseudopodi-simili e frontali invasive erano anche frequentemente presenti (Figura 4A, sinistra). Alcune cellule diffusi nella circolazione sanguigna fin dal 1 dpi (Figura 4A, destra). A 2 dpi, diffusione chiara è stata osservata nelle parti distali del pesce (Figura 4A, destra). Il numero di cellule disseminate ulteriormente aumentato a 3 dpi (Figura 4A e 4D). Al contrario, quando le cellule M2 erano stimolati in zebrafish, hanno esposto modesta diffusione nel corpo pesce dopo 2 dpi (Figura 4B). Hanno anche mostrato maggiore diffusione dopo il passare del tempo (Figura 4F). Come mostrato in figura 4C e 4G, cellule M1 raramente diffusi in circolazione zebrafish, e anche la migrazione locale attivo nello spazio perivitellino era infrequente durante il periodo di osservazione. La massa cellulare M1 è stata praticamente detenuto al sito di iniezione originale. Se la definizione di diffusione positiva o metastasi come> 5 cellule nel corpo di pescess = "xref"> 4, MDA-MB-231 e M2 metastasi delle cellule è stata osservata nel 92% e il 57% di pesce, rispettivamente, a 3 dpi (Figura 4G). Al contrario, nessuna diffusione positiva è stata osservata con cellule M1. Pertanto, questo modello zebrafish di progressione delle cellule di cancro umano riflette con precisione il livello relativo di potenziale metastatico delle diverse cellule nei topi. Neovascolarizzazione (verde) germogliato dal plesso subintestinal del zebrafish embrionale e penetrato la massa cellulare MDA-MB-231 o M2 era presente anche dopo l'iniezione spazio perivitellino di cellule tumorali seguita da 3 giorni di incubazione (Figura 4A e 4B, sinistra ). Coerentemente con la disabilità diffusione, solo lieve neovascolarizzazione è stata rilevata dopo l'impianto delle cellule M1 (Figura 4C).

Nel modello embrionale xenotrapianto zebrafish con mCherry-etichettati MDA-MB-231 cellule e l'iniezione Doc, il laboratoriole cellule tumorali ELED nel tailfin del pesce zebra sono considerati rappresentativi di stravaso attivo. I mCherry marcati MDA-MB-231 cellule sono state iniettate in 2 dpf. A 3 dpi, le cellule hanno iniziato a migrare dai vasi alla tailfin, che si arricchisce di collagene. Singole cellule MDA-MB-231 migrati uno per uno, indipendentemente dalle navi, alla tailfin distante (Figura 5A). A 6 dpi, l'invasione potrebbe essere quantificata contando il numero di cellule che migrati nel tessuto tailfin. Nel modello iniezione Doc cellule M2 mCherry marcato, l'iniezione è stata eseguita anche a 2 dpf. Tuttavia, è stato osservato un fenotipo cluster durante il processo di stravaso attivo. A 1 dpi, cellule M2 iniziato a migrare dai vasi nel CHT del zebrafish. A 2 dpi, le cellule migrate M2 iniziato a formare un cluster tra navi nel CHT (Figura 5B). Quantificazione del numero invasiva raggruppamento cellulare M2 nella regione CHT potrebbe essere condotta a6 dpi.

Figura 1: fasi principali per indagare il comportamento invasivo delle cellule del cancro al seno in zebrafish embrionale. (A) Dopo aver attraversato zebrafish parentale durante la notte, Tg (fli1: EGFP) zebrafish embrioni sono stati raccolti la mattina seguente e sono state mantenute a 28 ° C. (B) Gli embrioni sono stati dechorionated con pinzette sottili sotto uno stereomicroscopio 48 h dopo la fecondazione (HPF). Le cellule tumorali mammarie marcate sono state raccolte e risospese in una piccola quantità di PBS. Dopo ben preparato, cellule sospese stati caricati in un ago. Approssimativamente 400 cellule sono state iniettate nel condotto di Cuvier (Doc) dello spazio perivitellino sotto uno stereomicroscopio. Gli embrioni iniettati sono state mantenute a 33 ° C. (C) 2 h dopo l'iniezione (HPI), gli embrioni sono stati sottoposti a caproiezione cautela e precisione sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Gli embrioni sono stati mantenuti a 33 ° C per 3 o 6 giorni. Durante l'intervallo, gli embrioni sono stati sottoposti al trattamento destinato. È stato rilevato (D) diffusione delle cellule del cancro mediante iniezione spazio perivitellino o invasione mediante iniezione Doc, computata e ripreso mediante microscopia confocale 3 o 6 giorni post iniezione (dpi). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: perivitellino sito di iniezione spazio e errori comuni. (A) Circa 400 cellule mCherry marcati (MDA-MB-231) sono state iniettate nello spazio perivitellino. Il campo chiaro (superiore), vascolarizzazione verde massa cellulare (media superiore), e rosso (metà inferiore) di iniezioneED embrioni di zebrafish sono stati catturati al microscopio confocale. L'immagine risultante dalla fusione (più in basso) dei tre canali mostra la posizione stereo della massa cellulare nell'embrione. (B) Le cellule non bersaglio spazio perivitellino appropriato. Il sacco vitellino è stato rotto. (C) cellule iniettate sotto soglia (molto inferiore a 400). (D), le cellule iniettate sopra soglia (più di 400). La massa cellulare era troppo vicino al condotto di Cuvier, che ha un ampio flusso sanguigno. bar scala = 50 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quadro del condotto di Cuvier (doc) iniezione. (A) Schema di iniezione Doc a 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) con le cellule del cancro al seno in embrioni di zebrafish. La freccia indica il doc. (B) Esempi di iniezioni positivi, con circa 400 cellule del cancro al seno; iniezioni negativi, tra cui il misinjection tuorlo; e un numero corretto di cellule iniettato a 4 hpi. Frecce e cerchi indicano cellule iniettate. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto tra capacità di diffusione tra varie linee cellulari seno. Circa 400 cellule mCherry marcata MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), o MCF10A (M1) sono state iniettate nello spazio perivitellino di embrioni di zebrafish 48 HPF. Gli embrioni iniettati sono stati seguiti per 3 giorni. (A, B, e C) Alta resomicrografie Lution mostrano il processo di migrazione e diffusione rappresentante di MDA-MB-231 (A), M2 (B), e le cellule M1 (C) in singoli corpi embrionali 1, 2 e 3 giorni dopo l'iniezione (dpi). Sinistra, la migrazione delle cellule nello spazio perivitellino (rosso) e il sistema vascolare peritumorale e intratumorale (verde). segnali gialle indicano la sovrapposizione dei microvasi e cellule. Medio, l'intera immagine di un embrione. A destra, la visualizzazione di cellule disseminate nel posteriore dell'embrione. Giallo frecce indicano singole cellule disseminata. bar scala = 50 pm. (D, E, e F) Quantificazione del numero di cellule disseminate in ciascun corpo embrionale a 1, 2, e 3 dpi. I risultati sono espressi come media ± SEM. I risultati di analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita dall'analisi post-hoc sono mostrati. P <0.05 è stato accettato come statisticamente significativo (* 0.01 <P <0.05; ** 0.001 <P <0.01; *** p <.001. (G) Confronto delle incidenze di intravasation per le cellule MDA-MB-231, M2 e M1 nei corpi embrionali a 1, 2, e 3 dpi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5: differenti comportamenti di MDA-MB-231 e M2 metastasi delle cellule in zebrafish con condotto di iniezione Cuvier. (A) immagini confocali rappresentativi del zebrafish seguite, 3, 4, e 5 dpi per mostrare il comportamento migrazione cella singola delle cellule MDA-MB-231 in zebrafish. Le frecce indicano invasive MDA-MB-231 cellule che migrati fuori dei vasi nelle tailfins. bar scala = 200 pm nella colonna di sinistra, 50 pm sulla colonna di destra. (B) Rappresentanteimmagini confocali della zebrafish seguite, 1, 2, e 3 dpi per mostrare il comportamento migrazione del cluster cellulare delle cellule M2 in zebrafish. Le frecce indicano le cellule M2 invasive che migrati dai vasi al tessuto ematopoietico caudale (CHT) e formano un cluster tra i vasi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, abbiamo descritto due metodi per studiare il comportamento invasivo di cellule tumorali del seno a Tg (fli1: EGFP) zebrafish embrioni, con spazio perivitellino e Doc iniezioni. Iniettando cellule tumorali marcate con colorante chimico o proteina fluorescente negli embrioni zebrafish transgenici, le caratteristiche dinamiche e spaziali di invasione e metastasi possono essere chiaramente monitorati in tempo reale alla singola cella o livello di cluster sotto un microscopio a fluorescenza. Nella maggior parte dei casi, la rapida progressione di metastasi in zebrafish assicura che il saggio può essere eseguito entro 1 settimana dopo il trapianto. Inoltre, le statistiche potenti possono essere ottenuti con ampie coorti di pesce.

Precoci e tardivi gli eventi della cascata metastatica possono essere simulati e ricapitolati iniettando cellule tumorali nello spazio perivitellino o Doc, rispettivamente. Lo spazio perivitellino è lo spazio delimitato fra il periderm del pesce e il sacco vitellino, che permesso fumarews uno a monitorare la diffusione delle cellule tumorali singole da siti primari nel corpo vivente. Dopo l'impianto, le cellule tumorali subiscono migrazione locale e invasione nello spazio perivitellino (considerato il sito primario) e poi intravasate in vasi sanguigni e diffondere insieme con la circolazione. Alla testa e tailfin (considerati siti di destinazione lontani), le cellule tumorali accumulano nei letti capillari stretti e stravaso. Pertanto, il numero di cellule che si trovano nei siti distanti nel corpo del pesce è una misura della capacità metastatica. Inoltre, le cellule più stravasato possono essere osservati in momenti successivi, che è anche vero del dosaggio iniezione Doc.

Doc è allargata vena comune cardinale con un ampio flusso sanguigno ^24. Direttamente mira il doc come un sito di iniezione introduce le cellule tumorali nel sistema circolatorio. In pratica, le cellule del cancro al seno si diffondono in tutto il corpo embrionale attraverso laflusso sanguigno immediatamente dopo l'iniezione doc. Le cellule poi arrestano alla caudale vena e aorta dorsale. Stravaso, l'invasione, e la formazione di micrometastasi possono essere osservati in successione entro 6 giorni. Come riportato in precedenza ^16, metastatiche MDA-MB-231 e cellule mammarie M2 precancerose presentano diversi fenotipi invasive. MDA-MB-231 cellule subiscono invasione singola cellula del collagene tailfin ricco-matrice. Così, il potenziale invasione della MDA-MB-231 cellule può essere misurata contando il numero di cellule che hanno travasato e invaso il tessuto tailfin. Al contrario, le cellule M2 formano gruppi di dimensioni diverse e sottoposti invasione collettiva del CHT. Quantificare il potenziale invasione delle cellule M2 contando il numero di cluster in questo protocollo è difficile e viene preferibilmente eseguita facendo un'immagine 3D utilizzando la microscopia confocale e determinare il volume delle cellule tumorali cluster.

La sfida tecnica di micro cellula tumoraleiniezione si rivolge con successo lo spazio perivitellino o doc. La microiniezione di un gran numero di embrioni è un procedimento complicato che richiede un operatore altamente qualificato e paziente. Fattori che contribuiscono alle variazioni dei risultati in esemplari includono lo stadio di sviluppo dell'embrione quando si inietta, differenze nel numero di cellule iniettate, e la perdita di cellule nel sacco vitellino. Se raro, la manipolazione potrebbe involontariamente penetrare nella vascolarizzazione e introdurre cellule nel sistema circolatorio direttamente, specialmente nella iniezione spazio perivitellino. Per ridurre ulteriormente variazione e per garantire l'affidabilità delle analisi, esame microscopico è necessario escludere pesce qualificato in punti temporali in tutto il processo. Inoltre, accecato analisi da un professionista senza conoscere l'impostazione è fortemente consigliato di raggiungere la quantificazione imparziale.

In sintesi, i due modelli che abbiamo introdotto qui mettono in lucevisualizzare i processi di invasione e metastasi delle cellule in vivo senza procedure invasive. Anche se abbiamo studiato solo le cellule del cancro al seno in due modelli per quanto riguarda il potenziale metastatico, potrebbero essere estrapolati ad altri tipi di cancro. Inoltre, i modelli potrebbero avere applicazioni più ampie nel determinare i meccanismi e nuovi bersagli molecolari che controllano metastasi cellula tumorale mediante (epi) manipolazione genetica. A causa della maggiore penetrabilità di embrioni zebrafish da composti piccola molecola rispetto all'alimentazione o iniezione di roditori ^25, i due modelli presentati presentano anche dei vantaggi in termini di screening ad alto rendimento di potenziali nuovi farmaci anti-invasione / metastasi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	MP Biomedicals	AGAF0500
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus	300038
Cholera enterotoxin	Calbiochem	227035
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	21041025
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc	11252-20
Epidermal growth factor	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	16140071
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
HEK293T cell line	American Type Culture Collection	CRL-1573
Hydrocortisone	SigmaAldrich	227035
Horse serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Insulin	SigmaAldrich	I-6634
MCF10A (M1) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MCF10Aras (M2) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MDA-MB-231 cell line	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
pCMV-VSVG plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PLV-mCherry plasmid	Addgene	36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Polybrene	SigmaAldrich	107689
Prism 4 software	GraphPad Software
pRSV-REV plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base	SigmaAldrich	11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher Scientific	15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm)	SigmaAldrich	P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040