الموصوفة هنا هي طريقة لاستخراج وتنقية ومراقبة جودة الحمض النووي الجيني من العامل الممرض الفطري الغذائي الحيوي الإلزامي ، البياض الدقيقي ، لاستخدامه في تسلسل الجينوم طويل القراءة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفطريات البياض الدقيقي هي مجموعة من مسببات الأمراض الهامة اقتصاديا النبات الفطرية. لا يعرف إلا القليل نسبيا عن علم الأحياء وعلم الوراثة من هذه الجراثيم الجزيئي، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص الموارد الوراثية والجينوم متطورة. هذه الكائنات الحية لديها كبيرة، الجينوم المتكررة، التي جعلت تسلسل الجينوم والتجمع الصعب باهظة. هنا، نحن تصف أساليب لجمع واستخراج وتنقية ومراقبة الجودة تقييم عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA من أنواع البياض الدقيقي واحد، Golovinomyces cichoracearum. ويتضمن بروتوكول صفها اضطراب الميكانيكي للجراثيم تليها الأمثل الفينول / الكلوروفورم استخراج الحمض النووي الجيني. وكان العائد نموذجي 7 DNA ميكروغرام لكل 150 غبيرات ملغ. الحمض النووي الجيني أن يتم عزل باستخدام هذا الإجراء هو مناسبة لتسلسل قراءة طويلة (أي> 48.5 KBP). تدابير مراقبة الجودة لضمان حجم، والغلة، ونقاء من الحمض النووي الجيني أيضاووصف في هذا الأسلوب. وتسلسل الحمض النووي الجيني نوعية الموصوفة هنا تسمح لتجميع ومقارنة الجينوم متعددة البياض الدقيقي، والتي بدورها سوف تؤدي إلى فهم أفضل وتحسين السيطرة على هذا الممرض الزراعي.
المقدمة
بياض دقيقي هي مجموعة من إلزام مصنع الفطرية biotrophic مسببات الأمراض التي، عندما تؤخذ معا، هي أكبر سبب للأمراض النبات في جميع أنحاء العالم 1. وهناك أكثر من 900 نوع وصفها البياض الدقيقي، والتي تم تجميعها تصنيفيا إلى خمس قبائل داخل الأسرة Erisyphaceae 2. بسبب على حد سواء لأهميتها الاقتصادية والعلاقة الحميمة أن تتطور مع مضيفيهم، كانت أمراض البياض الدقيقي موضوع البحث ل> 100 سنة. على العدوى، بياض دقيقي تثير تغييرات جذرية في بنية الخلية، والتمثيل الغذائي والبيولوجيا الجزيئية من مضيفيهم، للاستفادة هذا الممرض. ومع ذلك، فإن دراسة بياض دقيقي هي تحديا من نوع خاص أسلوب حياتهم ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الفطرية المواد
- تزايد البياض الدقيقي
- تنمو النباتات في غرف النمو فقا للشروط التالية: 22 ° C اليوم درجة الحرارة 20 درجة مئوية درجة الحرارة ليلا، و 80٪ الرطوبة النسبية، 14 ساعة يوم طول وشدة الضوء من 125 μE / م 2 / ث (المقدمة من الإضاءة الفلورسنت ).
- تصيب نباتات الخيار (كوكوميس البركة متنوعة بوش بطل) مع Golovinomyces cichoracearum UCSC1 سلالة كما هو موضح
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
cichoracearum تشغيل مثال ممثل 60ng الحمض النووي الجيني النقي من G. على هلام الاغاروز باستخدام هلام الكهربائي واستخدام حقل نابض هلام الكهربائي وترد في أرقام 1 و 2 على التوالي. وتمثل الاستعدادات DNA الجينومية أن تمر، هامشي تمر وتفشل مراقبة الجودة. الاستعدادات DNA الجينومية التي تمر بالكامل مراقبة الجودة مثالية لتسلسل باستخدام نهج تسلسل الجينوم قراءة منذ فترة طويلة. الاستعدادات التي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
من أجل الحصول على النقي، وارتفاع الوزن الجزيئي الجيني DNA من تلزم biotrophic فطريات البياض الدقيقي، وقد تم تطوير نسخة معدلة من الأساليب المذكورة سابقا 30. ومتوسط العائد باستخدام هذا البروتوكول الأمثل هو 7 DNA ميكروغرام لكل 150 ملغ غبيرات، مضاعفة الغلة التي تم الحصول عليها مع بروتوكول مسبق. كما ارتفع متوسط حجم من حوالي 20 KBP إلى أكثر من 48.5 KBP. وكان محسن هذا البروتوكول في النظام cichoracearum G. cucumber-. من أجل الحصول على أفضل جودة وأعلى نق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تطوير هذا البروتوكول لدعم مشروع تسلسل مشترك بين معهد الجينوم والمجتمع (# 1657). تم دعم العمل جزئيا من قبل مؤسسة فيلوماتيا والمؤسسة الوطنية للعلوم (# 0929226) ومعهد العلوم الحيوية للطاقة إلى S. Somerville. ومن قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (# 310030_163260) إلى ب. كيلر. نود أن نشكر زملائنا ، M. Figureroa و M. Miller (جامعة مينيسوتا) ، R. Panstruga (جامعة RWTH Aachen) ، C. Pedersen (جامعة كوبنهاغن) ، P. Spanu (إمبريال كوليدج) ، J. Taneja (جامعة كاليفورنيا بيركلي) ، M. Wildermuth (جامعة كاليفورنيا بيركلي) ، R. Wise (جامعة ولاية أيوا) و S. Xiao (جامعة ماريلاند) على نصائحهم السخية والتطوع ببروتوكولاتهم أثناء قيامنا بتطوير البروتوكول الموضح هنا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| MM400 مطحنة الكرة | Retsch | 20.745.0001 | أو ما يعادلها من مطحنة الكرة |
| 2 مل أنابيب لطحن الكرة | Sarstedt & nbsp ؛ | 72.694.007 | |
| 5/32 "كرات طحن الفولاذ المقاوم للصدأ OPS | Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| المعالجات الدقيقة التي يتم التحكم فيها 280 سلسلة حمام مائي مسبقا إلى 65 درجة ؛ ج | Thermo Fisher Scientific | 2825 | أو ما يعادله حمام مائي |
| يتم التحكم فيه 280 سلسلة حمام مائي مضبوطة مسبقا إلى 37 درجة ؛ C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | أو ما يعادلها حمام مائي |
| Eppendorf 5417R جهاز طرد مركزي دقيق | مبرد Krakeler Scientific | 38-022621807 | أو ما يعادلها من أجهزة الطرد المركزي |
| الدقيقة Chlorform: IAA (24: 1 v / v) | Sigma-Aldrich ؛ | C0549 | خطير في حالة ملامسة الجلد أو استنشاقه. ارتد قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر واعمل في غطاء المحرك الكيميائي |
| الفينول: الكلوروفورم: IAA (25:24: 1 v / v) | 15593031 Thermo Fisher Scientific | خطير في حالة ملامسة الجلد أو استنشاقه. ارتداء قفازات النتريل والنظارات الواقية ومعطف المختبر والعمل في غطاء المحرك الكيميائي | |
| 100٪ الأيزوبروبانول | سيجما ألدريتش & nbsp ؛ | W292907 | |
| 100٪ إيثانول | سيجما ألدريتش ؛ | 34923 | البرد إلى -20 درجة ؛ C الاستخدام المسبق |
| أسيتات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S2889 | |
| رناز ، خالي من الدناس (10 مجم / مل) ثيرمو | فيشر العلمي | EN0531 | |
| ميتابيسلفيت البوتاسيوم | سيجما ألدريتش ؛ | P2522 | |
| الصوديوم لوريل ساكروينات | سيجما ألدريتش ؛ | L9150 | |
| قاعدة تريس | سيجما ألدريتش ؛ | 10708976001 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | سيجما ألدريتش ؛ | EDS | |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | سيجما-ألدريتش ؛ | S9888 | |
| سيتيل تريميثيل بروميد الأمونيوم (CTAB) | سيجما ألدريتش ؛ | H6269 | |
| Uvex من Honeywell Futura Goggles S345C ، Uvextreme | Staples | 423263 | أو ما يعادلها من |
| نظارات High Five COBALT Nitrile ، LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | أو ما يعادلها |
| حمض نووي أحمر صبغة 10،000x في الماء | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10 مجم / مل | Biotium | 40042 | خطير في حالة ملامسة الجلد. ارتد قفازات النتريل والنظارات الواقية |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8 - 48 kb معايير حجم الحمض النووي CHEF | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | أو ما يعادلها من هلام مجال النبض aparatus |
| ورق الترشيح النوعي Whatman ، الصف 1 | Sigma-Aldrich ؛ | WHA1001042 | أو ما يعادلها من غرفة النمو |
| Percival Growth | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis مقياس الطيف | الحراري فيشر العلمي | ND-8000-GL | أو ما يعادله مقياس الطيف |
| الضوئي Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x) | Thermo Fisher Scientific | B49 | تمييع 1/50 بالماء قبل الاستخدام (إلى 1x) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA ، محلول 10x (الرحلان الكهربائي) BP13334 | Thermo Fisher Scientific | يخفف 1/10 بالماء قبل الاستخدام (إلى 1x) | |
| نيتروجين | سائل نيتروجين سائل (-196 درجة ؛ ج) هو خطر التجمد. سوف يتوسع أيضا بسرعة عند الاحترار ويجب ألا يحفظ في حاوية مغلقة بإحكام |
المراجع
- Agrios, G. N. Plant Pathology. , 4th, Academic Press. (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
