Summary
Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.
Introduction
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die Auswirkungen über 35 Millionen Menschen weltweit. 1 stark bei der Entstehung und Entwicklung der Krankheit in Verbindung gebracht, ist die hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid Amyloid beta (Aß). 2 Aß im Bereich von 36 bis 43 Aminosäuren in der Länge, aber es wird angenommen , daß die 42-Aminosäurevariante Amyloid beta 42 (Aß42), ist die toxische Form des Proteins. 3 Dies ist zum größten Teil auf die Fähigkeit von Aß42 zu leicht diffusionsfähig, oligomere Spezies bilden , die vermutlich besonders neurotoxischen Einheiten sein. 4 Um unser Verständnis des Aß - Peptid zu fördern, ist es wichtig , regelmäßig zu hochreinem Material zu erhalten. Das Vorhandensein von Spurenverunreinigungen hat sich gezeigt, dramatisch die Aggregationsneigung Eigenschaften des Peptids zu verändern. 5
Trüher, wurde durch die Verwendung einer Kombination von C 4 oder C 8 Siliciumdioxid basierenden stationären Phasen und einer sauren mobilen Phase die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) -Trennung von hydrophoben Peptiden , wie beispielsweise Aß getan. 6 Jedoch können solche Bedingungen eine Herausforderung für die Reinigung des Peptids darstellen. Der niedrige isoelektrische Punkt des Aß - Peptid (pI ungefähr 5,5) , 7 bedeutet , daß unter sauren Bedingungen, Peptidaggregation erhöht wird und als Ergebnis breite, nicht aufgelöste HPLC - Peaks , die oft schwierig zu isolieren sind (2A) hergestellt. Ferner können solche breite Peaks enthalten oft Verunreinigungen, die die Aggregationsprofil des Peptids beeinflussen können, und erfordern häufig nachfolgenden Runden der Reinigung, die die Menge an Peptid dramatisch beeinflussen können hergestellt werden.
Die Poly (Styrol / Divinylbenzol) stationäre Phase, PLRP-S stellt ein alternatives Mittel zur purifying hydrophobe Peptide. Die stationäre Phase wurde bei der Reinigung von einer Reihe von verschiedenen Proteinen und messenger-Ribonukleinsäuren (mRNA) eingesetzt werden. 8, 9 Die PLRP-S stationäre Phase erfordert keine zusätzliche Alkylliganden für Umkehrphasentrennung, und was noch wichtiger ist , bei hohen pH chemisch stabil, die Desaggregation des Peptids führt. 7 Hier berichten wir über eine maßgeschneiderte HPLC - Reinigung - Protokoll , das hochreine Beta - Amyloid-42 (Aß42) und Beta - Amyloid-40 (Aβ40) Peptide ergibt.
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Protocol
1. Präparative HPLC-Reinigung des Aβ40 oder Aß42-Peptid
- Bereiten Sie die folgenden Puffer für die HPLC - Reinigung.
- Bereiten Puffer A (20 mM NH 4 OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH 4 OH (28% ige Lösung) auf 1000 ml Reinstwasser.
- Bereiten Puffer B (80% Acetonitril mit 20 mM NH 4 OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH 4 OH (28% ige Lösung) zu einer Lösung von 800 ml HPLC-reines Acetonitril und 200 ml Reinstwasser.
- Präparieren Probenlösungspuffer (0,1% NH 4 OH) durch Zugabe von 100 & mgr; l NH 4 OH (28% ige Lösung) zu 100 ml Reinstwasser.
- Setup das HPLC - Gerät wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Bringen Sie die Lösungsmittelflaschen, die A enthalten Puffer und Puffer B zu den Einlässen der HPLC-Pumpe mit Polymerschlauch. Bringen Sie den Polymerschlauch an die HPLC-Pumpe mit einem einteiligen Armatur. Stellen Sie sicher, dass der Polymerschlauch ausjeder Puffer an den richtigen Einlaßventil des Instruments angebracht. Den HPLC-Pumpe mit einem Entgaser.
- Koppeln der HPLC - Pumpe mit dem Einlass der 300 Å 8 um 25 mm х 300 mm präparativen Säule (1B, Spalte ganz links, siehe Materialliste) polymer Schlauch verwendet wird .
- Bringen Sie den Polymerschlauch zur präparativen Säule mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Sicherzustellen, dass die Polymersäule in der richtigen Weise ausgerichtet ist.
HINWEIS: Die stationäre Phase der präparativen Säule aus Poly (styrol-divinylbenzol) -Teilchen umfassen. Die korrekte Orientierung der Polymer Säule wird mit einem einzigen Richtungspfeil auf dem äußeren Gehäuse markiert.
- Bringen Sie den Polymerschlauch zur präparativen Säule mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Sicherzustellen, dass die Polymersäule in der richtigen Weise ausgerichtet ist.
- Verbinden Sie den Ausgang der Säule mit dem Dual-Wellenlängen-Detektor Polymerschlauch mit und stellen Sie den Wellenlängen-Detektor auf 214 nm und 280 nm.
- Ändern Sie die Wellenlänge, die durch die Detektionswellenlängenparameter im Setup-Instrument Methode Option der VeränderungEinbau-HPLC-Software.
- Bringen Sie den Polymerschlauch mit dem Einlass des Wellenlängendetektor mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Befestigen Polymerschlauch mit dem Ausgangsventil des Wellenlängendetektors. Bringen Sie den Polymerschlauch mit dem Auslassventil des HPLC-Detektor mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Dies wird die Probensammelschlauch sein.
HINWEIS: Das Fehlen eines starken Chromophor auf das Aß-Peptid diktiert, dass 214 nm für die Peaksammlung als primäre ultravioletter (UV) Wellenlängen verwendet werden.
Abbildung 1: Experimenteller Aufbau des HPLC Instrument zur Reinigung der amyloiden beta - Peptiden verwendet. (A) Die Pumpe quartären HPLC , ausgestattet mit einem Entgaser und Detektor mit variabler Wellenlänge auf 214 nm und 280 nm eingestellt; (B) HPLC - Säulen zur Reinigung der Amyloid - beta - Peptide verwendet, vonvon links nach rechts, 25 x 300 mm 2 präparativen Säule, 7,5 x 300 mm 2 semi präparativen Säule und 4,6 x 250 mm 2 analytische Säule; (C) Hand Injektor mit 20 & mgr; l Edelstahl - Injektionsschleife für analytische HPLC verwendet wird ; (D) Manueller Injektor mit 10 ml Edelstahl - Injektionsschleife für die präparative und semi präparative Reinigung verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Programmieren der HPLC - Software die Reinigungsverfahren , wie gezeigt in Tabelle 1. Geben Sie den Reinigungsverfahren durch Ändern des Lösungsmittelfahrplanparameter (im Setup - Instrument Verfahren Option eingebaut in die HPLC - Software) ausgeführt werden . Schalten Sie die HPLC - Pumpe durch die "on" Taste auf der HPLC - Software klicken.
HINWEIS: Die Pumpe Ausgangsverhältnis von Puffer A Versorgung beginnt und Puffer B durch die preparative Säule und die HPLC-Instrument.- Verlassen das System für 30 min vollständig äquilibrieren.
| Zeit / min | % Puffer A a | % Puffer B b | Durchflussrate d / mL min -1 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75.5 | 24.5 | 6 |
| 45,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 5 | 95 c | 6 |
<strong> Tabelle 1: Zeitplan für die Reinigung der Aß42 und Aβ40 Peptide, die die Säule 25 × 300 mm Polymer verwendet wird. einen Puffer A - H 2 O mit 20 mM NH 4 OH; b 80% MeCN / 20% H 2 O mit 20 mM NH 4 OH; c lief für 15 min , um die Säule vor der nächsten Injektion von Probe zu waschen; d Um eine Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml / min auf die HPLC - Instrumentierung zu laufen, muss die Druckgrenze auf 200 bar reduziert werden.
- Reinigung des Aß - Peptidprobe
Anmerkung: Das Rohpeptid durch automatisierte Festphasen-Peptidsynthese erhalten wurde. 10- Man löst 3 mg rohes Aß Peptid in 4 ml der Probenlösungspuffer. Beschallen die Probe für 30-60 s bei Raumtemperatur und bei einer Frequenz von 40 kHz Auflösung zu unterstützen.
- Injizieren Sie die gesamte Probe auf die HPLC-Säule eine 5 ml Plastikspritze mit einer 16-Gauge ausgestattet mitNadel aus rostfreiem Stahl. Führen Sie das Reinigungsverfahren wie in Teilschritt 1.3 skizziert.
HINWEIS: Das System ermöglicht eine Probeninjektion durch den Einsatz einer manuellen Injektor mit einer 10 ml Edelstahl - Injektionsschleife (1D) angebracht erfolgen. Die gewünschte Aß - Peptid eluieren zwischen 72 und 74 min als scharfe gelöst Peak (2C). - Sammeln der Probe in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Bestätigen Sie die Identität des Aß-Spitze durch direkte Injektion Massenspektrometrie des gesammelten Eluenten. 11 Bewahren Sie das Eluens für bis zu 12 Stunden bei -20 ° C.
HINWEIS: Die Lagerung der Lösung für einen Zeitraum länger als 12 h nicht aufgrund zur Oxidation des Peptids auf das Potential empfohlen. - Isolieren Sie das gereinigte Peptid durch Flash Einfrieren des gesammelten aliquoten / Aliquots des Aß-Peptid in flüssigem Stickstoff und lyophilisieren. Führen Lyophilisation durch Gefriertrocknung der Probe bei einer Temperatur von -60 ° C und einem pressicher von 20 mTorr für einen Zeitraum von 24 h.
- Führen Sie die analytische HPLC-Protokolls, wie unten beschrieben, die Reinheit des Aß-Peptids zu bestimmen. Store-Peptide in ihrer lyophilisierten Form bei -20 ° C für einen Zeitraum von bis zu 6 Monaten.
2. Analytische HPLC-Analyse des gereinigten Aß-Protein
- Bereiten Sie die HPLC-Puffer, wie in Unterabschnitt 1.1 beschrieben. des obigen Protokolls.
- Setup die analytische HPLC gemäß Schritt 1.2.1 und wie in Figur 1 mit dem 4,6 × 250 mm analytische Säule (1B, Spalte ganz rechts) und dem manuellen Injektor mit 20 & mgr; l Edelstahl - Injektionsschleife dargestellt (Abbildung 1C) ausgerüstet der Instrument.
- Programmieren der HPLC - Software die analytischen Verfahren , wie in Tabelle 2 gezeigt folgenden Anweisungen ähnlich zu denen in Schritt 1.3 ausgeführt werden .
| Zeit /min | % Puffer A a | % Puffer B b | Durchflussrate / ml min -1 |
| 0 | 95 | 5 | 1 |
| 30 | 50 | 50 | 1 |
Tabelle 2: Zeitplan für die HPLC - Reinheitsanalyse des Aß - Peptid. einen Puffer A - H 2 O mit 20 mM NH 4 OH; b 80% MeCN / 20% H 2 O mit 20 mM NH 4 OH.
- Reinheitsanalyse des Aß - Peptids
- Bereiten einer 1 mg / ml-Lösung des gereinigten Peptids durch Auflösen des Peptides in der Probenpufferlösung.
HINWEIS: Die Puffer Rezept kann in Unterabschnitt 1.1. Proteinkonzentration wird durch Messung der Protein - Absorption bei 280 nm (A 280 nm) bestimmt. 12 Die m olar Extinktionskoeffizienten (ε) verwendet Konzentration zu bestimmen ist ε = 1.490 dm 3 mol -1 cm -1. 13 - Injizieren Sie 20 ul der 1 mg / ml (222 & mgr; M) Lösung auf die HPLC-Säule und führen Sie die analytische Methode, die Einrichtung in 2,3 Schritt war.
HINWEIS: Die verbleibende Lösung nicht für die Analyse verwendet werden, können in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert, um das Aß-Peptid zu gewinnen. Die Gefriertrocknung Details können in Unterabschnitt 1.4.4 zu finden. Die Aß - Peptid werden aus der analytischen Säule zwischen 16 und 18 min (2D) eluieren. Verwenden Sie die integrierte Integrationsanalyse-Software, die die HPLC-Instrument begleitet die Reinheit des Aß-Peptids zu bestimmen. Die Reinheit wird durch die Integration von jedem der einzelnen Peaks im Spektrum bestimmt und Berechnen Peptid-peak Prozentbereich. Typischerweise sollte eine Reinigung von> 95% festgestellt werden.
- Bereiten einer 1 mg / ml-Lösung des gereinigten Peptids durch Auflösen des Peptides in der Probenpufferlösung.
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Abbildung 2: Repräsentative HPLC Spuren von Aß42. (A) Traditionelle C 4 Silika Reinigung Bedingungen: Puffer A: H 2 O mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Puffer B: MeCN (Acetonitril) mit 0,1% TFA, Gradient: 20 bis 27% Puffer B über 40 min , gefolgt durch isokratische 27% Puffer B; (B) Die präparative Reinigung der 25 x 300 mm 2 Polymer Spalte, Bedingungen: Puffer A: H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Gradient : 20 bis 27% Puffer B über 70 min durch isokratische 27% Puffer B; (C) Optimierte präparative Reinigung der 25 x 300 mm 2 Polymer Spalte werden die Bedingungen in Tabelle 1 beschrieben , befindet sich in Unterabschnitt 1.3 des Protokolls Beschreibungstext; (D) unter Verwendung Analytische HPLC die 4,6 x 250 mm 2 Polymer - Säule, Ltgitions: Puffer A: H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Gradienten-5 bis 50% Puffer B über 30 min. Für Teile A, B und C der Spitze-Aß42 entspricht, wird durch ein Sternchen gekennzeichnet. Sammlung des markierten Aß42 peak in Teil C mit einer Reinheit von> 95% ergibt, wie in Teil D. Massenspektrometrie gezeigt wurde verwendet, um die Identität des Aß42 Peak zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Representative Results
Die Reinigung des Aß42 Peptid , das eine Kombination aus der PLRP-S stationäre Phase und ein hoher pH - Wert der mobilen Phase führt zur Bildung eines scharfen, aufgelöst Peak für das Aß - Peptid bei einer Retentionszeit zwischen 72 und 74 min (2C) verwendet wird . Bestätigung der Identität der Peaks wird durch direkte Injektion Massenspektrometrie des gesammelten Eluenten erfolgen. Der Eluent kann für bis zu 12 h bei -20 ° C in Lösung gelagert werden. Längere Lagerzeiten können bei der Oxidation des Proteins führen. Um das gereinigte Peptid zu isolieren, ist der Eluent in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert. Analytische HPLC des gereinigten Peptids zeigt eine Reinheit von> 95% (Figur 2D). Das gleiche Verfahren kann verwendet werden , um die Aβ40 - Peptid (3A) ohne Modifikation des Verfahrens zu reinigen. Analytische HPLC zeigt eine Reinheit von Aβ40 zu mehr als 95% (3B). 
Abbildung 3: Repräsentative HPLC Spuren von Aβ40. (A) Optimierte präparative Reinigung der 25 x 300 mm 2 Polymer Spalte, Bedingungen sind in Tabelle 1 beschrieben , befindet sich in Unterabschnitt 1.3 des Protokolls Beschreibungstext. Die Peak-zu Aβ40 entspricht, mit einem Sternchen gekennzeichnet. (B) Analytische HPLC unter Verwendung der 4,6 x 250 mm 2 Polymer Spalte Bedingungen: Puffer A: H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H 2 O mit 20 mM NH 4 OH, Gradient : 5 bis 50% Puffer B über 30 min. Sammlung des markierten Aβ40 peak in Teil A mit einer Reinheit von> 95% ergibt , wie in Teil B. Massenspektrometrie gezeigt wurde verwendet , um die Identität des Aβ40 Peak zu bestimmen. Bitte klicken siee eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Um zu bestätigen , daß das gereinigte Peptid oligomeren Mischungen bilden können, führten wir photoinduzierten Vernetzung des unmodifizierten Proteine (PICUP) , wie zuvor beschrieben , 14, 15 und konnten Oligomerbildung robust zu beobachten. 10
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
