Summary
Heri vi rapportere en skreddersydd HPLC rensing protokoll som gir høy renhet amyloid beta 42 (Aβ42) og amyloid beta 40 (Aβ40) peptider, i stand til oligomerdannelsen. Amyloid beta er en svært aggregering utsatt, hydrofobe peptid innblandet i Alzheimers sykdom. Den amyloidogene natur av peptidet som gjør dets rensing en utfordring.
Introduction
Alzheimers sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som effekter over 35 millioner mennesker verden over. 1 Impliserte sterkt i begynnelsen og utviklingen av sykdommen, er det svært utsatt aggregering, hydrofobt peptid Amyloid beta (Ap). 2. Ap varierer fra 36 til 43 aminosyrer i lengde, er det imidlertid antatt at en 42-aminosyre-variant, amyloid beta 42 (Aβ42), er det mest giftige formen av proteinet. 3 Dette skyldes i hovedsak til evnen til Aβ42 til lett danne diffusible, oligomeric arter som antas å være spesielt nevrotoksiske enheter. 4 For å fremme forståelsen av Ap peptid, er det viktig å rutinemessig oppnå høy renhet materiale. Tilstedeværelsen av sporforurensninger har vist seg å dramatisk endre aggregering tilbøyelighet egenskapene til peptidet. 5
Traditionally har høy ytelse væskekromatografi (HPLC) separering av hydrofobe peptider slik som Ap blitt gjort ved bruk av en kombinasjon av C-4 eller C-8 silika-baserte stasjonære faser og en sur mobil fase. 6 kan imidlertid slike forhold være en utfordring for rensing av peptidet. Den lave isoelektriske punktet til Ap peptidet (pI ca. 5,5) 7 betyr at under sure betingelser, er peptidaggregering øket, og som et resultat av brede, ikke-oppløste HPLC-topper som ofte er vanskelig å isolere blir produsert (figur 2A). Videre er slike brede topper inneholder ofte urenheter som kan påvirke aggregering profilen av peptidet, og som vanligvis krever påfølgende runder av rensing som kan dramatisk påvirke mengden av peptidet produsert.
Poly (styren / divinylbenzen) stasjonær fase, PLRP-S, representerer en alternativ metode for vannrensingying hydrofobe peptider. Den stasjonære fase er blitt anvendt i rensingen av en rekke forskjellige proteiner og messenger ribonukleinsyrer (mRNA). 8, krever 9 PLRP-S stasjonær fase uten ekstra alkyl ligand for reversfaseseparasjon, og enda viktigere er kjemisk stabilt ved høy pH, hvilket fører til deaggregation av peptidet. 7 Heri, rapporterer vi en skreddersydd HPLC rensing protokoll som gir høy renhet amyloid beta 42 (Aβ42) og amyloid beta 40 (Aβ40) peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparativ HPLC Rensing av Aβ40 eller Aβ42 Peptide
- Forbered følgende buffere for HPLC rensing.
- Forbered buffer A (20 mM NH4OH) ved å tilsette 1,3 ml NH4OH (28% løsning) til 1000 ml med ultrarent vann.
- Forbered buffer B (80% acetonitril med 20 mM NH4OH) ved å tilsette 1,3 ml NH4OH (28% løsning) til en løsning av 800 ml av HPLC-kvalitet acetonitril og 200 ml ultrarent vann.
- Fremstille prøveoppløsningsbuffer (0,1% NH4OH) ved å tilsette 100 ul av NH4OH (28% løsning) til 100 ml ultrarent vann.
- Oppsett av HPLC-instrument som er vist i figur 1.
- Monter løsemiddelflasker som inneholder buffer A og buffer B til inntakene av HPLC pumpe ved hjelp av polymer tubing. Fest polymer slangen til HPLC-pumpe med en i ett stykke montering. Sørg for at polymeren rør avhver buffer er festet til den korrekte innløpsventilen av instrumentet. Monter HPLC pumpe med en gassutskiller.
- Par HPLC-pumpe med innløp 300 Å 8 um 25 mm х 300 mm preparativ kolonne (figur 1B, helt til venstre kolonne, se Materialer List) ved anvendelse av polymer-rør.
- Fest polymer slangen til preparativ kolonne med en en-brikke finger tettsittende. Sikre at polymeren kolonnen er orientert på riktig måte.
NB: Den stasjonære fase av preparativ kolonne består av poly (styren-divinylbenzen) partikler. Den korrekte orientering av polymeren kolonnen merket på det ytre hylster med en enkelt retningspilen.
- Fest polymer slangen til preparativ kolonne med en en-brikke finger tettsittende. Sikre at polymeren kolonnen er orientert på riktig måte.
- Koble utløpet av kolonnen til den doble bølgelengde detektoren ved hjelp polymer røret og sette bølgelengde detektoren til 214 nm og 280 nm.
- Endre bølgelengde ved å endre Detekteringsbølgelengden parametre de i setup instrument metoden muligheten tilinnebygd programvare HPLC.
- Fest polymer slangen til innløpet av bølgelengde detektor med en i ett stykke finger støvtette. Fest polymer slangen til utgangsventilen til bølgelengde detektoren. Fest polymer slangen til utløpsventilen av HPLC detektor med en en-brikke finger tettsittende. Dette vil være den prøvetakingsrøret.
MERK: Mangelen på en sterk kromofor på Ap peptidet tilsier at 214 nm blir benyttet som den primære ultrafiolett (UV) bølgelengde for topp samling.
Figur 1: Eksperimentell oppsett av HPLC instrument som brukes for rensing av amyloid beta peptider. (A) Det kvaternære HPLC pumpe utstyrt med en gassutskiller og detektor med variabel bølgelengde innstilt på 214 nm og 280 nm; (B) HPLC-kolonner anvendt for rensing av de amyloid beta peptider, fravenstre til høyre, 25 x 300 mm 2 preparativ kolonne, 7,5 x 300 mm 2 semi preparativ kolonne og 4,6 x 250 mm 2 analytisk kolonne; (C) Manuell injektor med 20 ul av rustfritt stål injeksjonssløyfe som brukes for analytisk HPLC; (D) Manuell injektor med 10 ml rustfri stål injeksjonssløyfe som brukes for preparative og semi preparativ rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Programmere HPLC programvare for å kjøre rensemetoden som vist i Tabell 1. Skriv rensemetoden ved å endre løsemiddel timeplan parameter (i oppsett instrument metoden alternativ bygget inn i HPLC-programvaren). Slå på HPLC pumpe ved å klikke på "på" knappen på HPLC-programvaren.
MERK: Pumpen vil begynne å levere starter forholdet mellom buffer A og buffer B gjennom preparative kolonne og HPLC-instrument.- La systemet i 30 min til fullt likevekt.
| Tid / min | % Av buffer A en | % Av buffer B b | Flow Rate d / ml min -1 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75,5 | 24.5 | 6 |
| 45.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 5 | 95 c | 6 |
<strong> Tabell 1: Tidsplan for rensing av Aβ42 og Aβ40 peptider som bruker mm polymer kolonne 25 × 300. en Buffer A - H 2 O med 20 mM NH4OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH; c Ran i 15 min for å vaske kolonnen før den neste injeksjonen av prøven; d For å kjøre en strømningshastighet på 6 ml / min på HPLC-instrumentering, må trykkgrense for å bli redusert til 200 bar.
- Rensing av Ap peptid prøven
Merk: Det urene peptid ble oppnådd via automatisert faststoff-fase peptidsyntese. 10- Oppløs 3 mg urent Ap peptid i 4 ml av prøven oppløsningsbuffer. Sonikere prøven i 30-60 s ved romtemperatur og ved en frekvens på 40 kHz for å lette oppløsningen.
- Injiser hele prøven på HPLC-kolonnen ved hjelp av et 5 ml plast-sprøyte utstyrt med en 16-gaugenål av rustfritt stål. Kjør rensemetode som er beskrevet i undertrinn 1.3.
MERK: Systemet gjør det mulig for prøveinjeksjon gjøres gjennom bruk av en manuell injektor utstyrt med en 10 ml rustfri stål injeksjonssløyfe (figur 1D). Ønsket Ap peptid vil elueres mellom 72 og 74 min som en skarp løst topp (figur 2C). - Samle opp prøven i et 50 ml konisk sentrifugerør. Bekrefte identiteten til den Ap topp ved direkte injeksjon av massespektrometri av den oppsamlede elueringsmiddel. 11. Vogn elueringsmiddel for opp til 12 timer ved -20 ° C.
MERK: Lagring av løsningen for perioder lengre enn 12 timer er ikke anbefalt på grunn av potensialet for oksidasjon av peptid. - Isolere det rensede peptid ved flash-frysing av oppsamlet alikvoten / alikvoter av Ap peptid i flytende nitrogen og Lyofiliser. Utføre lyofiliseringen av frysetørking av prøven ved en temperatur på -60 ° C og et pressikker og 20 mTorr i et tidsrom på 24 timer.
- Kjør analytisk HPLC-protokollen som beskrevet nedenfor for å bestemme renheten av Ap peptid. Oppbevar peptider i deres frysetørket form ved -20 ° C i et tidsrom på opp til 6 måneder.
2. Analytisk HPLC-analyse av den rensede Ap Protein
- Forbered HPLC buffere som beskrevet i kapittel 1.1. av ovennevnte protokoll.
- Oppsett av analytisk HPLC i henhold til trinn 1.2.1 og som vist i figur 1 med 4,6 x 250 mm analytisk kolonne (figur 1B, kolonnen helt til høyre), og den manuelle injektoren med 20 ul av rustfritt stål injeksjonssløyfe (figur 1C) tilpasset instrument.
- Programmere HPLC programvare for å kjøre den analysemetode som er vist i tabell 2, ved å følge instruksjonene som ligner på dem i trinn 1,3.
| Tid /min | % Av buffer A en | % Av buffer B b | Strømningshastighet / ml min-1 |
| 0 | 95 | 5 | 1 |
| 30 | 50 | 50 | 1 |
Tabell 2: Table for HPLC-renhet analyse av Ap-peptid. en Buffer A - H 2 O med 20 mM NH4OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH.
- Renhetsanalyse av Ap peptid
- Fremstill en 1 mg / ml oppløsning av det rensede peptid ved oppløsning av peptidet i prøvebufferoppløsning.
MERK: Bufferen oppskrift kan finnes i kapittel 1.1. Proteinkonsentrasjon bestemmes ved å måle protein absorpsjonen ved 280 nm (A 280 nm). 12 m Olar ekstinksjonskoeffisient (ε) anvendt for å bestemme konsentrasjonen er ε = 1490 dm 3 mol -1 cm -1. 1. 3 - Injiser 20 ul av 1 mg / ml (222 pM) løsningen på HPLC-kolonnen og kjørt den analytiske metode som ble satt opp i trinn 2,3.
NB: Den gjenværende løsning som ikke brukes til analyse kan flash-frosset i flytende nitrogen og lyofilisert for å utvinne det Ap peptid. Frysetørking detaljer kan finnes i kapittel 1.4.4. Ap peptid vil elueres fra den analytiske kolonnen mellom 16 og 18 minutter (figur 2D). Bruk den innebygde integrasjons analyse programvare som følger med HPLC-instrument for å fastslå renheten av Ap peptid. Renhet bestemmes ved å integrere hver av de enkelte topper i spekteret og beregning av peptid-peak prosentområdet. Vanligvis bør en rensing av> 95% fastslås.
- Fremstill en 1 mg / ml oppløsning av det rensede peptid ved oppløsning av peptidet i prøvebufferoppløsning.
"Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Figur 2: Representative HPLC spor av Aβ42. (A) Tradisjonell C 4 silika rensing betingelser: Buffer A: H2O med 0,1% trifluoreddiksyre (TFA), buffer B: MeCN (acetonitril) med 0,1% TFA, gradient: 20 til 27% buffer B i løpet av 40 minutter, fulgt av isokratisk 27% buffer B; (B) Preparativ rensing ved anvendelse av 25 x 300 mm 2 polymer kolonne, betingelser: Buffer A: H2O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient : 20 til 27% buffer B i løpet av 70 minutter etterfulgt av isokratisk 27% buffer B; (C) Optimalisert preparativ rensing ved anvendelse av 25 x 300 mm kolonne 2-polymer, blir betingelsene beskrevet i tabell 1, som ligger i under avsnitt 1.3 i protokollen beskrivelsesteksten; (D) Analytisk HPLC ved bruk av 4,6 x 250 mm kolonne 2-polymer, diritions: Buffer A: H 2 O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient-5 til 50% buffer B i løpet av 30 min. For deler A, B og C på toppen som tilsvarte Aβ42 er markert med en stjerne. Oppsamling av det merkede Aβ42 toppen i del C viser en renhet på> 95%, som vist i del D. Massespektrometri ble anvendt for å bestemme identiteten til Aβ42 topp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensing av Aβ42 peptidet ved anvendelse av en kombinasjon av den PLRP-S-stasjonær fase og en høy pH-mobil fase resulterer i dannelse av en skarp, løst topp for Ap-peptid ved en oppholdstid mellom 72 og 74 min (figur 2C). Bekreftelse av identiteten av toppen skjer ved direkte innsprøyting av massespektrometri av den oppsamlede elueringsmiddel. Elueringsmidlet kan oppbevares ved -20 ° C i oppløsning i opptil 12 timer. Lengre tids lagring kan føre til oksidasjon av proteinet. For å isolere det rensede peptid, er elueringsmidlet flash-frosset i flytende nitrogen og lyofilisert. Analytisk HPLC av det rensede peptid viser en renhet på> 95% (figur 2D). Den samme prosedyre kan anvendes for å rense den Aβ40 peptid (figur 3A) uten modifikasjon av metoden. Analytisk HPLC viser en renhet på Aβ40 til å være større enn 95% (figur 3B). 
Figur 3: Representative HPLC spor av Aβ40. (A) optimalisert preparativ rensing ved anvendelse av 25 x 300 mm kolonne 2-polymer, blir betingelsene beskrevet i tabell 1, som ligger i under avsnitt 1.3 i protokollen beskrivelsestekst. Toppen som tilsvarer Aβ40 er merket med en stjerne. (B) Analytisk HPLC ved anvendelse av 4,6 x 250 mm 2 polymer kolonne, betingelser: Buffer A: H2O med 20 mM NH4OH, buffer B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient : 5 til 50% buffer B i løpet av 30 min. Oppsamling av det merkede Aβ40 toppen i del A viser en renhet på> 95%, som vist i del B. Massespektrometri ble anvendt for å bestemme identiteten til Aβ40 topp. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
For å bekrefte at det rensede peptidet kan danne oligomere blandinger, utførte vi foto-indusert tverrbinding av umodifiserte proteiner (picup) som tidligere beskrevet 14, 15 og var i stand til å observere robust oligomerdannelse. 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HPLC-rensing av Ap-peptidet er i stor grad avhengig av valget av både den stasjonære fasen som anvendes ved rensingen og den mobile fase valgt for å eluere peptidet. Den lave isoelektriske punkt av peptidet og høy tilbøyelighet til aggregering gjengi tradisjonelle kromatografiske betingelser for separering av hydrofobe proteiner (C4 eller C8 stasjonær fase kombinert med en sur mobil elueringsmiddel) utfordrende, med Ap-peptid ved å eluere som en forlenget bred, ikke løst peak (figur 2A).
For å omgå dette problem, PLRP-S stasjonær fase kjemisk stabilt ved høy pH-verdi ble funnet å være effektiv for rensing av Ap peptid (figur 2B og 2C). Bruken av en høy pH-verdi mobil fase minimaliseres graden av aggregering, og når optimalisert, ga opphav til en sterk, godt løst topp. I den optimaliserte protokollen, prosentandelen av buffer B var hurtig switched fra 20% til 27% ved 52 minutters tidspunkt, og som et resultat, ga opphav til et veldefinert Ap topp (figur 2C). Denne optimaliserte protokollen er avhengig av alle de hydrofobe urenheter elueres fra kolonnen under den første 20 til 24,5% økning i buffer B konsentrasjon. Hvis urenheter er funnet som er av en lignende hydrofobisitet som Ap peptidet, kan deretter ytterligere optimalisering av HPLC-protokollen være berettiget. Den optimaliserte metoden var svært reproduserbare blant enkelte grupper av syntetisert Ap og var i stand til å rense både 40 og 42 varianter av peptid uten noen endringer i optimalisert prosedyre (figur 3). For begge peptidene, ble renheten som bestemt ved analytisk HPLC funnet å være større enn 95%.
Gitt de rapporter om sporforurensninger som endrer aggregering tilbøyelighet til Ap peptidet, er det tilrådelig at en ortogonal biofysisk karakterisering bli anvendt for å bekrefteat det rensede peptid er i stand til å gjennomgå oligomerisering. Ved hjelp av tidligere rapportert protokoller vi valgte å utføre picup. 14, 15 picup analyse av de rensede proteiner demonstrerer den karakteristiske monomer gjennom heksamer populasjon fordelingen for Aβ40 peptidet og monomeren gjennom heptamer fordeling forbundet med Aβ42 peptidet. 10 Disse resultatene bekrefter at rensingen av Ap-peptider ved hjelp av den PLRP-S-stasjonær fase og en høy pH-mobil elueringsmiddel resulterer i Ap-proteiner som er i stand til aggregering.
Renseprosedyren rapportert er utformet for å være i stand til å rense opp til 3 mg av Ap peptid i et enkelt kromatografisk løp. For denne fremgangsmåten, er det avgjørende å angi strømningshastigheten for HPLC-instrument ved 6 ml / min. Hvis lavere strømningsrater HPLC pumpe benyttes, skal HPLC kjøretid utvides for å imøtekomme dette. Converog omgir, kan anvendelse av høyere strømningshastigheter tilsi en reduksjon i den HPLC kjøretid. Imidlertid kan reduksjonen av kjøretiden resultere i co-eluering av Ap topp med andre topper og derfor redusere renheten av Ap peptidet oppsamlet. Videre kan HPLC-instrumentering og størrelsen på den kromatografiske kolonnen som brukes for rensing i stor grad påvirke mengden av materiale som kan renses i en enkelt kjøring. Hvis ingen topp er produsert ved den forventede elueringsmiddel for tiden av Ap-peptid, og en stor topp fremstilles ved elueringsmiddel tidspunkt som tilsvarer den løsningsmiddelfronten, da for mye materiale ble først påført på kolonnen. Å redusere mengden av materiale som injisert på HPLC-kolonnen for hvert forsøk vil omgå dette problemet. Når Ap-peptidet er blitt renset, er det sterkt anbefalt at løsningen frysetørkes så raskt som mulig. Langvarig lagring av peptidet i løsning kan føre til oksydasjon av Ap og derfor dannelsen av urenheter. den pukerhet av Ap peptidet bør alltid bli bestemt ved hjelp av analytisk HPLC. Spormengder av urenheter som kan endre aggregering tilbøyelighet av peptidet dramatisk. Dersom analytisk HPLC trasen viser tilstedeværelse av urenheter, og deretter prøven, skal gjenkastes HPLC-renseprotokoll og dets renhet på nytt bestemt ved analytisk HPLC.
Håpet er at dette skreddersydd prosedyre for rensing av Aβ42 og Aβ40 peptider vil være til nytte for det vitenskapelige samfunnet og tillater brukere å oppnå høy renhet Ap stand oligomerdannelsen. Det ville være forventet at denne fremgangsmåten kan tilpasses andre amyloidogene peptider som er vanskelig å isolere og rense.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Agilent for deres teknisk assistanse. Kate Markham og Rafael Palomino er kreditert for sin første hjelp i syntese og rensing av Ap peptid og Dr Hsiau-Wei Lee takkes for hans hjelp i forberedelsene Figur 1 av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
