Summary
在此，我们报告说，得到高纯度的β淀粉样蛋白42（Aβ42）和β淀粉样蛋白40（Aβ40）肽，能够形成低聚物量身定制的HPLC纯化协议。 β淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏症牵连高度易聚集，疏水肽。该肽的淀粉样蛋白性质使得其净化是一个挑战。
Introduction
阿尔茨海默氏症是一种神经退行性疾病的全球影响超过35万人。 1在疾病的发作和发展强烈牵连，是高度易聚集，疏水肽β淀粉样蛋白（Aβ）。 2Aβ从长度36至43个氨基酸的范围内，但是，它被认为是42-氨基酸变体，淀粉样蛋白β42（Aβ42），是蛋白质的最毒的形式。 3这是由于在大多数情况下，以Aβ42的容易地形成被认为是特别神经毒性实体扩散，低聚物质的能力。 4为了进一步提供了对Aβ肽的了解，有必要定期地获得高纯度的材料。微量杂质的存在已经显示出显着改变肽的聚集倾向的属性。 五
ŧraditionally，高效液相色谱（HPLC）的疏水性肽，例如Aβ的分离已通过使用C 4或C 8的二氧化硅基固定相和酸性流动相的组合完成的。 6然而，这样的条件可以提出一个挑战的肽的纯化。所述Aβ肽的低等电点（pI约5.5）7意味着在酸性条件下，肽聚集增加，并且作为结果宽，非分辨的HPLC峰是常常难以分离产生（ 图2A）。此外，这样的宽峰常常含有可能影响所述肽的聚集的空间，通常需要后续的轮次的纯化，其可以极大地影响肽的产生量的杂质。
的聚（苯乙烯/二乙烯基苯）固定相，PLRP-S，表示PURIF的替代手段英疏水性肽。固定相已在许多不同的蛋白质和信使核糖核酸（mRNA）的的纯化被使用。 8，9 PLRP-S固定相需要用于反相分离没有额外的烷基配体，而且更重要的是化学稳定在高pH导致肽的解聚。 7在此，我们报告说，得到高纯度的β淀粉样蛋白42（Aβ42）和β淀粉样蛋白40（Aβ40）肽量身定制的HPLC纯化协议。
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Protocol
1.Aβ40或Aβ42肽的制备型HPLC纯化
- 准备以下缓冲区的HPLC纯化。
- 加入1.3毫升NH 4 OH（28％溶液）到1000毫升超纯水制备缓冲液A（20毫米NH 4 OH）。
- 通过加入1.3毫升的 NH 4 OH（28％溶液）的800毫升的HPLC级乙腈和200毫升的超纯水的溶液中制备的缓冲液B（80％乙腈的20mM NH 4 OH）。
- 通过加入100微升的NH 4 OH（28％溶液）至100毫升的超纯水制备样品溶解缓冲液（0.1％的NH 4 OH）。
- 设置为在图1所示的高效液相色谱仪。
- 适合的溶剂瓶是包含缓冲A和缓冲B到HPLC泵的使用聚合物管道入口。附加聚合物管与单件式接头的HPLC泵。确保聚合物管每个缓冲器被装配到仪器的正确入口阀。契合脱气HPLC泵。
- 耦合HPLC泵与300埃为8μm25毫米х300毫米制备柱的入口使用聚合物管（ 图1B，最左边列中，见材料列表）。
- 附加聚合物管连接到制备柱上用一单件手指紧接头。确保聚合物列以正确的方式定向。
注：制备柱的固定相由聚（苯乙烯 - 二乙烯基苯）的颗粒。该聚合物列的正确方向上标有与单个方向箭头的外壳。
- 附加聚合物管连接到制备柱上用一单件手指紧接头。确保聚合物列以正确的方式定向。
- 使用聚合物管列的出口连接到双波长检测器和波长检测器设定至214纳米和280纳米。
- 在的设置仪器方法选项改变检测波长参数改变波长内置型HPLC软件。
- 附加聚合物管波长检测器的入口有一个单件的手指紧身。附加聚合物管连接到波长检测器的输出阀。与单件式手指紧身附加聚合物管连接到HPLC检测器的出口阀。这将是样品收集管。
注：缺乏对Aβ肽的强烈的发色团的决定了214nm处被用作初级紫外线（UV）波长为峰集合。
图1：用于淀粉样蛋白β肽的纯化的HPLC仪器的实验装置。 （A）中的季HPLC泵装有一个脱气器和可变波长检测器设定至214纳米和280纳米;用于淀粉样蛋白β肽的纯化（B）的HPLC柱，从从左到右，25×300毫米2制备柱，7.5×300毫米2半制备柱和4.6×250毫米2分析柱; （C）手动进样器与用于HPLC分析20微升不锈钢注射循环; （D）的手动喷射器与用于制备和半制备纯化10mL的不锈钢注射环。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 编程性HPLC软件以运行该纯化方法如表1所示，通过改变溶剂时间表参数（在内置到HPLC软件的安装仪器方法选项）输入的纯化方法。通过点击HPLC软件的“上”按钮打开HPLC泵。
注：该泵将开始提供缓冲液A开始比，并通过预备缓冲液Barative柱和HPLC仪器。- 离开系统30分钟以充分平衡。
| 次/分 | 缓冲液A 一的％ | 缓冲液B 的B％ | 流量d /毫升-1分 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75.5 | 24.5 | 6 |
| 45.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.01 | 80 | 20 | 6 |
| 52.02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 五 | 95℃ | 6 |
<强>表1：时间表使用25×300毫米聚合物列中的Aβ42和Aβ40肽的纯化。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH; Ç冉15分钟以洗涤之前样品的下一注射柱; d在为了运行上的HPLC仪器6毫升/分钟的流速，压力限制需要被降低到200巴。
- 该Aβ肽样品的分离纯化
注意：通过自动固相肽合成而获得粗肽。 10- 溶解3毫克粗的Aβ肽在4毫升的样品溶解缓冲液中。超声处理样品30-60■在室温下，并在40千赫兹以促进溶解的频率。
- 注入整个样品上用装有16号5毫升塑料注射器HPLC柱不锈钢针。如在子步骤1.3中概述运行的纯化方法。
注：该系统使样品注入到通过使用安装有10毫升不锈钢注射环（ 图1D）的手动喷射器来完成。所需的Aβ肽将洗脱分钟72和74之间作为一个尖锐分辨峰（ 图2C）。 - 收集样品到50mL锥形离心管中。确认Aβ峰通过收集洗脱液直接注入质谱的身份。 11商店洗脱液为在-20℃达12小时。
注：长于12小时没有到期的肽的氧化宜电位期间将溶液的贮藏。 - 隔离通过快速纯化肽冷冻收集的等分试样/液氮冷冻干燥的Aβ肽的等分试样。通过冷冻干燥该样品在-60℃，PRES的温度下进行冷冻干燥确保20毫托，为期24小时的。
- 运行分析型HPLC协议如下所述来确定Aβ肽的纯度。商店肽在-20℃，为期6个月的冷冻干燥的形式。
2.纯化的Aβ蛋白的分析性HPLC分析
- 准备HPLC缓冲区在小节1.1概述。上述协议。
- 设置的分析性HPLC按步骤1.2.1并且与4.6×250毫米分析柱（ 图1B，最右列），并用20微升不锈钢注入环的手动进图1所示（ 图1C）装配到仪器。
- 编程性HPLC软件以运行该分析方法如表2所示下列类似于在步骤1.3的指令。
| 时间 /分 | 缓冲液A 一的％ | 缓冲液B 的B％ | 流量/毫升-1分 |
| 0 | 95 | 五 | 1 |
| 三十 | 50 | 50 | 1 |
表2：时间表的Aβ肽的HPLC纯度分析。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH。
- 该Aβ肽的纯度分析
- 通过在样品缓冲液中的肽的溶解制备纯化的肽的1毫克/毫升溶液。
注：缓冲区配方可在小节1.1中找到。蛋白质浓度通过在280nm（A 280毫微米 ）测定蛋白质的吸收来确定。 12 m个用于确定浓度OLAR消光系数（ε）为ε= 1,490分米3摩尔-1 -1。 13 - 注入1毫克/毫升（222μM）溶液到HPLC柱20微升并运行的分析方法，该方法是设置在步骤2.3。
注：不用于分析剩余的溶液可以在液氮快速冷冻和冷冻干燥以回收的Aβ肽。冻干细节可以在子1.4.4节中找到。 Aβ的肽将洗脱从16和18分钟（ 图2D）之间的分析柱。使用伴随HPLC仪器来确定Aβ肽的纯度内置整合分析软件。纯度通过每个单独的峰的积分在光谱并计算肽峰面积百分比来确定。通常情况下，“95％的纯化应来确定。
- 通过在样品缓冲液中的肽的溶解制备纯化的肽的1毫克/毫升溶液。
“图2”SRC =“/文件/ ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg”/>
图2：Aβ42的代表性HPLC曲线。 （A）的传统的 C 4的二氧化硅纯化，条件为：缓冲液A：H 2 O与0.1％三氟乙酸（TFA），缓冲液B：MeCN中（乙腈），0.1％TFA，梯度：20到27％缓冲液B，经40分钟，随后通过等度27％缓冲液B; （B）使用25×300毫米2聚合物列，条件制备纯化：缓冲液A：H 2 O 20毫米NH 4 OH，缓冲液B：80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH，渐变：70分钟; 20到27％缓冲液B，接着等度27％缓冲液B; （ 三 ）优化使用25×300毫米2聚合物制备色谱柱净化，条件在位于小节协议描述文本1.3表1所示; （D）分析用HPLC使用4.6×250毫米2聚合物柱，CONDitions：缓冲液A：H 2 O 20毫米NH 4 OH，缓冲液B：80％乙腈/ 20％H 2 O超过30分钟20毫米NH 4 OH，梯度5至50％缓冲液B。对于部分A，B和C对应Aβ42峰用星号标记。标记Aβ42峰值在C部分揭示了> 95％的纯度所示部分D质谱的集合被用来确定Aβ42峰的身份。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Representative Results
所述Aβ42肽的使用和PLRP-S固定相的组合的高pH的流动相在用于Aβ肽的尖锐，解析峰的形成在保留时间72和74分钟（ 图2C）之间的结果的纯化。峰的身份的确认是通过收集洗脱液直接注射质谱完成。洗脱液可以存储在长达12小时的溶液-20℃。存储的时间较长，可能会导致该蛋白质的氧化。以分离纯化的肽，洗脱剂是闪光灯在液氮中并冻干冷冻。该纯化的肽的分析型HPLC显示> 95％（ 图2D）的纯度。相同的过程可用于未经方法的修改来净化Aβ40肽（ 图3A）。分析型HPLC表明Aβ40的纯度为大于95％（ 图3B）。 
图3：Aβ40的代表性HPLC曲线。 （ 一 ）优化利用25×300毫米2聚合物制备色谱柱净化，条件在位于该协议说明文字小节1.3表1所示。对应Aβ40的峰标有星号。 （ 二 ）分析HPLC使用4.6×250毫米2聚合物柱条件：缓冲液A：H 2 O 20毫米NH 4 OH，缓冲液B：80％乙腈/ 20％H 2 O 20毫米NH 4 OH，渐变：在30分钟内5〜50％缓冲液B。标记Aβ40峰A部分揭示了> 95％的纯度所示B部分质谱的集合被用来确定Aβ40峰的身份。 请点击她的E要查看此图的放大版本。
为了确认该纯化的肽可以形成低聚混合物，我们进行如前所述14,15和能够鲁棒地观察寡聚物形成未修饰的蛋白质（PICUP）的光致交联。 10
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Discussion
所述Aβ肽的HPLC纯化是高度依赖于两者在纯化中使用的固定相和选择，以洗脱所述肽的流动相的选择。肽和高倾向聚集低等电点呈现疏水蛋白质的分离（C4或加上酸性移动洗脱液C8固定相）挑战传统色谱条件下，与Aβ肽洗脱作为延长的宽，非分辨峰（ 图2A）。
为了避免这个问题，PLRP-S固定相，在高pH下是化学稳定的被发现是有效的Aβ肽（ 图2B和2C）的纯化。使用高pH流动相的最小化聚集程度，和优化时，就产生了一个尖锐的，很好分辨的峰。在优化的协议，缓冲液B的比例为迅速SWITC从20％建置到27％在52分钟的时间点，其结果，就产生了一个良好定义的Aβ峰（ 图2C）。这种优化的协议依赖于所有的疏水杂质被从柱中缓冲液B的浓度初始20至24.5％的增加的过程中洗脱。如果发现杂质，这是一个类似疏水性的Aβ肽，高效液相色谱协议，那么进一步的优化可能有必要。优化的方法，合成Aβ的个别批次之间高度重复性，并能够净化肽的两个40和42的变种没有任何改变优化的过程（ 图3）。对于这两种肽，如通过分析型HPLC确定的纯度被认为是大于95％。
定的微量杂质改变Aβ肽的聚集倾向的报告，这是可取的，正交的生物物理表征被用于确认该纯化的肽是能够进行低聚。使用先前报道，我们选择执行PICUP协议。 如图14所示 ，纯化的蛋白质的15 PICUP分析表明通过用于Aβ40肽和通过七聚体分布与Aβ42肽相关联的单体六聚人口分布的特性的单体。 10这些结果证实使用PLRP-S固定相和Aβ蛋白，其能够聚合的高pH移动洗脱液结果的Aβ肽的该纯化。
报告的纯化方法被设计为能够净化最多3毫克的Aβ肽在单一色谱运行。对于此过程，它是设置在6毫升/分钟高效液相色谱仪的流率的关键。如果所使用的HPLC泵的低流率时，HPLC的运行时间应扩展到容纳于此。 CONVERsely，采用较高的流速可以保证在HPLC运行时间的减少。然而，减少的运行时间可导致与其它峰的Aβ峰的共洗脱并因此降低收集到的Aβ肽的纯度。此外，用于纯化色谱柱的HPLC仪器和尺寸可以极大地影响可在单次运行中纯化的材料的量。如果没有峰是在Aβ肽的预期洗脱时间产生，并且一个大的峰值在对应于溶剂前沿洗脱液时间产生的，然后太多的材料最初被装载到柱上。减少材料注射到HPLC柱每次运行的量将绕过这个问题。一旦Aβ肽得到了净化，强烈建议溶液中尽快冷冻干燥。在溶液中的肽的长期贮存会导致Aβ的氧化，因此，形成的杂质。普该Aβ肽RITY应始终由HPLC分析确定。痕量的杂质可以显着改变肽的聚集倾向。如果分析型HPLC跟踪显示的杂质的存在，则该样品应重新经受HPLC纯化协议并通过分析HPLC纯度重新确定。
希望对Aβ42和Aβ40肽的提纯这种量身定制的过程将有利于为科学界，使用户能够获得高纯度Aβ能够寡聚物形成。可以预计，这个过程可以适用于其他淀粉样蛋白形成肽难以分离和纯化。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想感谢安捷伦为他们提供技术援助。凯特·马卡姆和拉斐尔·帕洛米诺都记在合成的初始帮助纯化的Aβ肽和Hsiau伟李博士在准备手稿图1感谢他的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
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