Summary
Suncus murinusの肝外胆管における神経フィラメントタンパク質の発現を視覚化するための全身免疫組織化学的アプローチ。ここに表示されます。このプロトコルは、 S. murinusまたは他の種のすべての内臓器官の神経支配を分析するために使用することができる。
Abstract
この研究は、 Suncus murinus（ S. murinus）における胆道の神経支配を標識するためにニューロフィラメントタンパク質抗体を使用して、全マウント免疫組織化学染色方法を詳細に説明する ）。最初に、検体をS. murinusから解剖し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した。第2に、酵素処理および潜在的な内因性ペルオキシダーゼ不活性化を行った。次いで、試験片を一次抗体である抗神経フィラメントタンパク質抗体に3-6日間曝露した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体とインキュベートした。呈色反応は、検体を3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）基質と反応させることによって明らかにした。この方法は、すべての内臓器官の神経支配を分析するために適用することができる。さらに、このプロトコールは、他のニューロン抗体を試験するために適合させることもできるが、抗体の最適化最初に行う必要があります。この方法はもともとKuratani and Tanaka 1,2,3によって導入された。
Introduction
家のムスクシュル、 Suncus murinusは、InsectivoraとSoricidae目に属する。この小さな哺乳類は東南アジア全域に分布しており、人間の住居や牛のペンの近くにある家や草地に生息しています4 。この種は、マウス、ラット、ウサギのような他の実験動物と比べてヒトに類似した一般的な形態学的特徴を示す。以前、膵臓6 、大十二指腸乳頭7 、幽門8 、胆嚢5 、および肝外胆道9の末梢神経を標識するために、 S.ムリナスニューロフィラメントタンパク質（NFP）に対する末梢ニューロンマーカーを用いた全マウント免疫染色を用いた。
NFPは、成熟した神経細胞骨格の一部である巨大分子複合体である。神経フィラメント関連タンパク質NFPとザイソソームとの間の相互作用を媒介する。酵素機能およびリンカータンパク質の構造はいずれもNFP 10によって調節される。 NFP複合体は、NF-L（70kDa）、NF-M（150-160kDa）、およびNF-H（200kDa）の3つのポリペプチドからなる。 NFPは、中枢神経系および末梢神経系の両方におけるニューロンの軸索に見出され得る。抗ヒトNFP抗体は、中枢神経系および末梢神経系の軸索を標識することが示されている。解剖学的および電気生理学的研究により、括約筋、胆嚢および近位胃腸管が11,12,13,14に接続されていることが示された。しかしながら、それらのニューロン結合の形態学的特徴はまだ定義されていない。
この研究は、 S. murinus bilの神経支配を標識するための全マウント免疫組織化学的染色法の使用を実証しているNFP抗体を用いたiary tract。
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Protocol
すべての実験手順は、東京都大学機関動物管理委員会（IACUC）によって承認された。動物は、実験動物のケアおよび使用のためのガイドおよびカナダ動物飼育評議会の実験動物のケアおよび使用のためのガイドに従って収容および処理された。東京都大学フロンティアヘルスサイエンス学科Functional Morphology Laboratoryで飼育維持されている動物を使用しました。
1.動物のケアと住居
- 閉鎖した繁殖コロニーからS. murinus 7頭（体重が70〜90gの雌3頭、雄4頭）を得る。
- 紙ストリップを含む木製の巣箱を備えたプラスチックケージに離乳後（出生後20日）個別にS. murinusをケージに入れる。慣習的に調整された動物の部屋に入れてください：23-27℃、湿度コントロールなし、そして12:12時間の明暗サイクル。供給業者イーグル・マス・ペレットと水を自由に与えます。
2.組織の準備
- 4％（w / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を調製するために、PFA40gを0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）1000mLに溶解する。ヒュームの棚で、溶液が透明になるまでボルテックスで混合する。 4％PFA O / Nは4℃で保管してください。
注意：PFAを取り扱う際は、適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。 - 動物を灌流して固定するために、それをエーテルで麻酔し、次にそれにsomnopentyl（ペントバルビタールナトリウム、0.6mL / kg体重）の腹腔内注射を与える。
- 動物が完全に麻酔された後、メスで腹腔を開き、腹部の真ん中に3cmの長さの腹部切開部を作ります。腹部大動脈の切開部のすぐ上のレベルで腹部大動脈にカテーテルを腸骨動脈に挿入する。
- ソノノペンチルを注射する（ペントバルビタール体重1kgあたり1.0mL）。完全な安楽死後、0.01M PBS（pH 7.4）で灌流し、次いで煙霧棚で4％PFAで灌流する。
- 灌流後、白いネオプレンラテックス（希薄白色ネオプレンラテックス3：2、蒸留水（DW））を2〜3mL注入して血管に標識する。
- 肝臓、胆嚢、総胆管、十二指腸、膵臓などの腹部の器官を関連する神経や血管から抽出する。
- 約12 mLの青色ネオプレンラテックス（希釈した白色ネオプレンラテックス10 mLに1滴の青色インクを加える）を胆嚢に注入して、胆管系を標識する。
- 全マウント免疫染色のために、4℃で4％PFAで一晩固定してください。
注意：PFAは有毒です。 PFAの直接取り扱いは避けてください。 PFAはヒューム棚に使用する必要があります。
3.全身免疫組織化学
注：プロトコールを通して、洗浄、抗体インキュベーション、および着色を含む、the標本は、室温または4℃でゆっくりとロッキングして、ナットレーター上に留まらなければなりません。
- 1日目：潜在的な内因性ペルオキシダーゼの酵素処理および不活性化
- 調製した試験片をDW 4xで室温で1時間、適切な大きさのガラスバイアル中で洗浄する。 PFAを取り除くために検体をナレーターで静かに揺する。溶液を交換する際には、試料に損傷を与えないでください。
- 1％（w / v）のオルト過ヨウ素酸を調製するには、100mLのDW中に1gのオルト過ヨウ素酸を溶解する。
- 内因性ペルオキシダーゼ反応を防ぐために、1％オルト過ヨウ素酸中で20分間RTで検体をインキュベートする。
- 0.004gのパパインを0.025mol / Lのトリス - 塩酸緩衝液（pH7.6）100mLに溶解して0.004％（w / v）のパパインを調製する。
- DWで10分間RTで検体を洗浄する。
- 穏やかに振盪しながら恒温槽中で37℃で2時間、新たに調製した0.004％パパインで検体をインキュベートする。
- Dを用いて検体を洗浄するWで50〜60分間RTでインキュベートした。
- 試料を4％CO / Nで4％PFAに保存する。
- 2日目：酵素処理
- 保管した試験片をDWで4時間、室温で1時間洗浄する。
- 穏やかに振盪しながら恒温槽中で37℃で2時間、新たに調製した0.004％パパインで検体をインキュベートする。
- DWで50〜60分間RTで標本を洗浄する。試料を4％CO / Nで4％PFAに保存する。
- 3日目：凍結処理
- 上記のように、保存した試験片を室温で1時間、DW 4xで洗浄する。
- 2.5g、5gおよび10gのスクロースをそれぞれ0.01M PBS（100mLのPBS中に溶解することにより2.5％（w / v）、5％（w / v）および10％ pH7.4）。
- 2.5％（w / v）、5％（w / v）および10％（w / v）スクロースにそれぞれ30分間浸漬する。
- 試料を-20℃で30〜60分間凍結し、RTで完全に解凍する。サイクルを3回繰り返す。
- 上2％Triton X-100（v / v）を補充し、2mLのTriton X-100を100mLの0.01M PBS（pH 7.4）に加える。
- 4％CO / Nで2％Triton X-100に検体を保存する。
- 4日目：一次抗体インキュベーション
- ウシ血清アルブミン（BSA）0.2g、トリトンX-100 0.3ml、アジ化ナトリウム0.1gを0.01M PBS（pH 7.4）100mlに溶解して、一次抗体の希釈液を調製する。
注意：アジ化ナトリウムは急性毒性があります。吸入および接触は避けなければならない。適切なPPEを着用してください。 - 上記の希釈バッファー（ステップ3.4.1）で1：600の一次抗体（NFP）を希釈する。検体をNFP抗体と4℃で3〜6日間インキュベートし、検体をナテーター上で静かに揺り動かします。より大きな検体は、 インキュベーション時間の増加を必要とする。
- ウシ血清アルブミン（BSA）0.2g、トリトンX-100 0.3ml、アジ化ナトリウム0.1gを0.01M PBS（pH 7.4）100mlに溶解して、一次抗体の希釈液を調製する。
- 二次抗体インキュベーション
- 未結合の一次抗体を除去するために、RTでそれぞれ1時間、PBS 4x中で検体を洗浄する。 0.2gのBSAと0.3mLのTriton X-100を100mLの0.01M PBS（pH 7.4）に溶解することにより、二次抗体のための希釈溶液を調製する。
- 希釈バッファー（ステップ3.5.2）で二次抗体（ペルオキシダーゼ結合、アフィニティー精製ヒツジ抗マウスIgG-HRP）を1：600希釈する。検体を2次抗体と4℃で3日間インキュベートし、検体をナイトレーター上で静かに揺り動かします。
- 着色
- 溶液を暗所に保ち、ヒューム皿の下で0.05 mol / L Tris-HCl緩衝液（pH 7.6）100 mLに3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（DAB）0.002 gを加えてDAB着色溶液を調製する。
- PBSで4℃で1時間、標本を室温で洗浄する。
- 新たに調製したDAB着色溶液に30％H 2 O 210μLを添加し、4℃/ Nでまたは3日間インキュベートする。
- 反応をplaで停止する最適染色強度に達したときに、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBS中で標本を染色する。
注：西洋ワサビペルオキシダーゼを阻害するので、このステップまでアジ化ナトリウムを使用しないでください。
- 染色組織のイメージング
- 慎重に、検体をPBSを含むペトリ皿（高さ5cm、直径10cm）に移す。実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、全マウント画像をキャプチャします。
注：完全にマウントされた組織は、透明なガラス皿上のPBSに完全に浸した状態で撮像する必要があります。
- 慎重に、検体をPBSを含むペトリ皿（高さ5cm、直径10cm）に移す。実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、全マウント画像をキャプチャします。
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Representative Results
図1〜4は、 S. murinusの肝外胆管におけるNFP陽性神経線維の典型的な結果を示す。 （ 図1 ）、胆嚢（ 図2 ）、上部胆管（ 図3 ）、および十二指腸乳頭領域（ 図4 ）の画像全体において、NFPに対する抗体は高い特異性および最小限度を再現可能に標識したバックグラウンド。
形状および大きさにかかわらず、標本のすべての組織について、被験者の神経を同時に染色することができる。肝外胆管の神経支配に加えて、食道および胃の迷走神経の走りおよび分布密度は明白に示された（ 図1 ）。
図2 ）。
上部胆管には、2種類の神経束が標識されていた。細かい神経束は、不規則で密集した神経回路網を形成し、接着して走り、胆道の上/中に存在した。より厚い神経束は胆道の表面に平行に分布していた（ 図3 ）。
総胆管には青色のネオプレンラテックス、白いネオプレンのラテックスにはラベリングした。総胆管の末端および十二指腸乳頭領域の細い神経線維は、高cで明瞭に示された （ 図4 ）。
図1：胆道、食道、および胃におけるNFP陽性神経線維。矢印は食道に沿って胃に流れている迷走神経を示しています。 CBD、共通胆管;食道、食道; St、胃。スケールバー=1300μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：胆嚢のNFP陽性神経線維。胆嚢の血管は白いラテックスで標識した。豊富な神経支配が胆嚢の頸部に生じた（矢印）。スケールバー=1,000μm。ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：上胆管のNFP陽性神経線維。 2種類の神経束が観察された。 1つのタイプは、接着して走り、肝外胆道の上/中に存在する細い神経束であった（矢印）。他のタイプは、肝外胆道の表面に平行に分布し、胆嚢と十二指腸（三角）の間を走るより厚い神経束であった。 PV、Portal Vein。スケールバー=650μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：十二指腸乳頭領域におけるNFP陽性神経線維。総胆管は青色ラテックスで標識し、血管は白いラテックス（*）で標識した。矢印は総胆管の末端の神経支配を示し、三角は総胆管および血管から来る十二指腸乳頭領域（P）の神経支配を示す。スケールバー=1,000μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、ニューロフィラメントタンパク質に対する抗体を用いて肝外胆道の神経支配を視覚化するための実験手順を説明している。このプロトコルは、KurataniおよびTanaka 1,2,3によって記述されたプロトコルから適合させた。
この実験では、全マウント染色法が2〜3週間続くので、各実験のタイムラインを計画します。組織を入れた容器は、凍結/解凍プロセスを除いて、常にナットで回転させる必要があります。特に、一次抗体および二次抗体とのインキュベーション中、試験片を反応液に均一に曝露するために、検体をナッターで回転させながら冷蔵保存室にセットした。 1％（w / v）オルト過ヨウ素酸、0.004％（w / v）パパイン、および一次/二次抗生物質のための希釈バッファーダイスは各実験ごとに新しく作らなければならない。プロトコール全体を通して、溶液を交換する際に試料に触れたり損傷したりしないように、溶液は鉗子15で取り除かれる代わりに注ぎ出されるべきである。
PFAで固定した後、サンプルをDWまたはPBSで十分に洗浄する必要があります。さらに、パパインインキュベーションによる酵素処理は重要である。抗原回収に使用される熱および酵素は、抗体の浸透のために組織を調製するのに役立つ。溶液の浸透を促進するために、-20℃で30分間または-80℃/ 15分間の凍結処理によって、組織の外側膜を破壊しなければならない。
溶液が完全な検体をインキュベーションできることを保証するために、十分な量の緩衝液に実験検体を完全に浸すことが重要です。一次抗体のインキュベーション時間は、経験的に決定しなければならないdを異なる組織およびサンプルサイズについて測定した。通常、2〜3cmのサンプルでは3日でなければなりません。最適な希釈は、各抗体について経験的に決定されなければならない。適切な抗体バッファーを使用する場合は、1：600の希釈液を1次抗体と2次抗体の両方に推奨します。
この研究は、 S. murinusの胆道における神経フィラメントタンパク質発現を明らかにする多目的全マウント免疫組織化学的アプローチのプロトコルを詳細に記載している。この方法は、多くの種のすべての内臓器官の神経支配を分析するために使用することができます。さらに、このプロトコールは、他のニューロン抗体を試験するために適合させることもできるが、抗体の最適化を行うべきである。
しかしながら、この技術は、浅い神経組織を標識し、3次元の神経支配モデルを構築することには限界があった。また、神経線維の特徴（ すなわち交感神経または同位体）を同定することができなかった無関心、運動または感覚など ）。
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Disclosures
著者らは、利益相反を宣言していない。
Acknowledgments
著者には謝辞はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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