Summary
En helmonterad immunohistokemisk metod för att visualisera neurofilamentproteinuttryck i det extrahepatiska gallvägen i Suncus murinus. Presenteras här. Detta protokoll kan användas för att analysera innervärdet av alla viscerala organ i S. murinus eller andra arter.
Abstract
Detta arbete beskriver den fullständiga monteringen av immunhistokemiska färgmetoder i detalj, med användning av neurofilamentproteinantikroppar för att märka innervation av gallvägarna i Suncus murinus ( S. murinus ). Först dissekerades provet från S. murinus och fixerades i 4% paraformaldehyd (PFA). För det andra utfördes en enzymatisk behandling och potentiell endogen peroxidasinaktivering. Provet exponerades sedan för den primära antikroppen, anti-neurofilamentproteinantikroppen, i 3-6 dagar. Den inkuberades sedan med den sekundära antikroppen konjugerad med pepparrotsperoxidas. Färgreaktionen avslöts genom att reagera provet med ett 3,3'-diaminobensidin (DAB) substrat. Denna metod kan tillämpas för att analysera innerveringen av alla viskosorgan. Vidare kan detta protokoll också anpassas för att testa andra neuronala antikroppar, men optimering av antibodiesEs bör göras först. Denna metod introducerades ursprungligen av Kuratani och Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
Husets muskeshuggare , Suncus murinus , tillhör ordningen Insectivora och familjen Soricidae. Detta lilla däggdjur distribueras i hela Sydostasien och bevarar hus och gräsbevuxna områden som ligger nära mänskliga livsmiljöer eller nötkreaturpennor 4 . Denna art uppvisar allmänna morfologiska egenskaper som liknar människor än andra laboratoriedjur, såsom mus, råtta och kanin 5 . Tidigare användes helmonterad immunförstärkning med en perifer neuronmarkör för S. murinus neurofilamentprotein (NFP) för att märka perifera nerver i bukspottkörteln 6 , huvudduodenal papillan 7 , pylorus 8 , gallblåsan 5 och extrahepatisk gallvägar 9 .
NFP är ett makromolekylärt komplex som ingår i den mogna neuronala cytoskeletten. Neurofilamentrelaterat proteinS mediera interaktioner mellan NFP och zygosomen. Både enzymfunktionen och strukturen hos linkerproteiner regleras av NFP 10 . NFP-komplexet är tillverkat av tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) och NF-H (200 kDa). NFP kan hittas i neuronal axon i både det centrala och perifera nervsystemet. Anti-human NFP-antikropp har visat sig markera axoner i det centrala och perifera nervsystemet. Anatomiska och elektrofysiologiska undersökningar har visat att sfinkteren, gallblåsan och proximal mag-tarmkanalen är anslutna 11 , 12 , 13 , 14 . De morfologiska egenskaperna hos deras neuronala förbindelser har emellertid ännu inte definierats.
Detta arbete demonstrerar användningen av en helmonterad immunohistokemisk färgmetod för att märka innervationen av S. murinus bilIarykan med en NFP-antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden godkändes av Tokyo Metropolitan University Institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC). Djurna hölls och hanterades i enlighet med guiden för vård och användning av laboratoriedjur och handledningen för vård och användning av experimentdjur av det kanadensiska rådet om djurvård. Vi använde djur uppfödda och upprätthållna vid funktionell morfologilaboratoriet, avdelningen för gränshälsovetenskap, Tokyo Metropolitan University, Japan.
1. Djurvård och bostäder
- Skaffa 7 S. murinus (3 honor och 4 hanar som väger 70-90 g) från en sluten avelkoloni.
- Kaka S. murinus individuellt efter avvänjning (20 d efter födseln) i plastburar utrustade med en trästackbox innehållande pappersremsor. Förvara dem i ett konventionellt konditionerat djurrum: 23-27 ° C, ingen luftfuktighetskontroll och en 12:12 h ljus: mörk cykel. Leverans kommersiellIalöringspellets och vatten ad libitum.
2. Vävnadspreparat
- För att framställa 4% (vikt / volym) paraformaldehyd (PFA), upplös 40 g PFA i 1000 ml 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4). Blanda med en virvel i ett rökskåp tills lösningen är klar. Förvara 4% PFA O / N vid 4 ° C.
Varning: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av PFA. - För att perfekta och fixa djuret bedöva det med eter och ge sedan en intraperitoneal injektion av somnopentyl (pentobarbitalnatrium, 0,6 ml / kg kroppsvikt).
- Efter att djuret är fullständigt narkotiserat, öppna bukhålan med en skalpell, vilket skapar en mittlinje i magen 3 cm lång. Medan den inferiora vena-cavaen inkuberas för exsanguination, sätt in en kateter retrogradely i buken aorta vid nivån omedelbart ovanför bifurcationen av denna artär i de gemensamma iliacartärerna.
- Injicera somnopentyl (pentobarbital såDium, 1,0 ml / kg kroppsvikt). Efter fullständig eutanasi, perfusera med 0,01 M PBS (pH 7,4) och sedan med 4% PFA i ett rökskåp.
- Efter perfusion injicera 2-3 ml vit neopren latex (utspädd vit neopren latex 3: 2 med destillerat vatten (DW)) för att märka blodkärlen.
- Extrahera bukorganen, inklusive levern, gallblåsan, vanliga gallkanalen, duodenum och bukspottkörteln med de relaterade nerverna och kärlen.
- Injicera ca 0,1 ml blå neopren latex (sätt en droppe blå bläck till 10 ml av den utspädda vita neopren latexen) till gallblåsan för att märka gallret.
- Efter fixning över natten med 4% PFA vid 4 ° C för helmonterad immunostaining.
Varning: PFA är giftigt. Undvik att hantera PFA direkt. PFA ska användas i ett skåp.
3. Helmonterad immunhistokemi
Anm .: Under protokollet, inklusive under tvätt, antikroppsinkubation och färgning, thE-provet måste förbli på nutatorn, gnugga försiktigt vid RT eller vid 4 ° C.
- Dag 1: Enzymatisk behandling och inaktivering av potentiellt endogent peroxidas
- Tvätta preparatet med DW 4x i 1 h vardera vid RT i en glasflaska med lämplig storlek. Vagga provet försiktigt på nutatorn för att ta bort PFA. Undvik att skada provet vid utbyte av lösningar.
- För att förbereda 1% (w / v) ortoperiodsyra, lösa upp 1 g ortoperaidinsyra i 100 ml DW.
- Inkubera provet i 1% ortoperiodinsyra i 20 minuter vid RT för att förhindra någon inneboende peroxidasreaktion.
- Framställ 0,004% (vikt / volym) papain genom att lösa 0,004 g papain i 100 ml 0,025 mol / L Tris-HCl-buffert (pH 7,6).
- Tvätta provet med DW i 10 minuter vid RT.
- Inkubera provet i nyberedd 0,004% papain i 2 timmar vid 37 ° C i ett konstant temperaturbad med mild rockning.
- Tvätta provet med DW i 50-60 min vid RT.
- Förvara provet i 4% PFA vid 4 ° C / N.
- Dag 2: Enzymatisk behandling
- Tvätta det lagrade provet med DW 4 gånger i 1 h var vid RT.
- Inkubera provet i nyberedd 0,004% papain i 2 timmar vid 37 ° C i ett konstant temperaturbad med mild rockning.
- Tvätta provet med DW i 50-60 minuter vid RT. Förvara provet i 4% PFA vid 4 ° C / N.
- Dag 3: Frysbehandling
- Tvätta det lagrade provet med DW 4x i 1 h vardera vid RT, som ovan.
- Förbered 2,5% (vikt / volym), 5% (vikt / volym) och 10% (vikt / volym) sackaros genom upplösning av 2,5 g, 5 g respektive 10 g sackaros i 100 ml 0,01 M PBS PH 7,4).
- Sänk provet i 2,5% (vikt / volym), 5% (vikt / volym) och 10% (vikt / volym) sackaros i 30 min vardera.
- Frys provet vid -20 ° C i 30-60 minuter och tina därefter det fullständigt vid RT; Upprepa cykeln 3x.
- ToppRepare 2% Triton X-100 (volym / volym), tillsätt 2 ml Triton X-100 till 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Förvara provet i 2% Triton X-100 vid 4 ° C / N.
- Dag 4: inkubation av primär antikropp
- Förbered utspädningslösningen av den primära antikroppen genom att upplösa 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 och 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
Varning: Natriumazid är akut giftigt. Inandning och beröring måste undvikas. Använd lämplig PPE. - Späd den primära antikroppen (NFP) 1: 600 i ovanstående spädningsbuffert (steg 3.4.1). Inkubera provet med NFP-antikropp vid 4 ° C i 3-6 dagar, så att provet försiktigt gungar på nutatorn. Större exemplar kommer att kräva ökade inkubationstider.
- Förbered utspädningslösningen av den primära antikroppen genom att upplösa 0,2 g bovint serumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 och 0,1 g natriumazid i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Sekundär antikropp inkubation
- Tvätta provet i PBS 4x i 1 h vardera vid RT för att avlägsna obundet primär antikropp. Förbered utspädningslösningen för den sekundära antikroppen genom att upplösa 0,2 g BSA och 0,3 ml Triton X-100 i 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
- Späd den sekundära antikroppen (peroxidas-konjugerad, affinitetsrenad får-anti-mus-IgG-HRP) 1: 600 i utspädningsbufferten (steg 3.5.2). Inkubera provet med sekundär antikropp vid 4 ° C i 3 d, och håll provet vaggande försiktigt på nutatorn.
- Färgsättning
- Förbered DAB färglösning genom att tillsätta 0,002 g 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) till 100 ml 0,05 mol / L Tris-HCl-buffert (pH 7,6) under ett rökskåp, vilket håller lösningen i mörkret.
- Tvätta proven vid RT i PBS 4x i 1 h vardera.
- Tillsätt 10 μl 30% H 2 O 2 i nyberedd DAB-färglösning och inkubera med lösningen vid 4 ° C / N eller 3 d medan du gnuggar försiktigt på nutatorn.
- Stoppa reaktionen med plaCingprovet i PBS med 0,04% natriumazid när den optimala färgningsintensiteten uppnås.
OBS: Undvik användning av natriumazid tills detta steg, eftersom det hämmar pepparrotperoxidas.
- Bildning av den färgade vävnaden
- Överför försiktigt provet till en petri-glasskål (5 cm hög, 10 cm i diameter) innehållande PBS. Fånga helmonterade bilder med en kamera monterad på ett stereomikroskop.
OBS! Helmonterad färgad vävnad ska avbildas medan den nedsänktes fullständigt i PBS på en transparent glasskål.
- Överför försiktigt provet till en petri-glasskål (5 cm hög, 10 cm i diameter) innehållande PBS. Fånga helmonterade bilder med en kamera monterad på ett stereomikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna 1-4 visar typiska resultat för NFP-positiva nervfibrer i det extrahepatiska gallvägen i S. murinus . Antikroppen mot NFP reproducerbart märkt innervationen i hela bilden av det extrahepatiska gallvägarna ( Figur 1 ), gallblåsan ( Figur 2 ), den övre gallkanalen ( Figur 3 ) och duodenal papillanområdet ( Figur 4 ), med hög specificitet och minimal bakgrund.
För alla vävnader i provet, oavsett form och storlek, kan tegmentala nerver färgas samtidigt. Förutom det extrahepatiska gallvägarnas innervation uppvisades otvetydigt löpning och fördelningstäthet hos matstrupen i matstrupen och magen ( Figur 1 ).
Figur 2 ).
I den övre gallgången märktes två typer av nervbuntar. De fina nervknippen bildade ett oregelbundet och tätt nervernät, sprang klibbigt och bodde kvar i / i gallvägen; De tjockare neurala buntarna fördelades parallellt med gallret i ytan ( Figur 3 ).
Den gemensamma gallkanalen märktes med blå neopren latex och kärlen med vit neopren latex. De tunna nervfibrerna i slutet av den gemensamma gallkanalen och den duodenala papillanområdet visades tydligt med hög c Ontrast ( Figur 4 ).
Figur 1: NFP-positiva nervfibrer i gallvägen, matstrupen och magen. Pilar visar vagus som går längs matstrupen till magen. CBD, vanligt gallkanal; Es, matstrupe; St, mage. Skalstång = 1 300 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: NFP-positiva nervfibrer i gallblåsan. Blodkärlen i gallblåsan märktes med vit latex. Riklig innervation inträffade i gallblåsans hals (pilar). Skala bar = 1000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: NFP-positiva nervfibrer i övre gallkanalen. Två typer av nervbuntar observerades. En typ var de fina nervbuntarna som sprang klibbigt och bosatte sig på / i det extrahepatiska gallret (pilar); Den andra typen var tjockare neurala buntar som fördelades parallellt med ytan av extrahepatisk gallvägar och sprang mellan gallblåsan och duodenum (trianglar). PV, Portal Vein. Skalstång = 650 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: NFP-positiva nervfibrer i Duodenal Papilla-området. Den gemensamma gallkanalen märktes med blå latex och kärlen med vit latex (*). Pilar visar innervationen i slutet av den gemensamma gallkanalen, och trianglar visar innervationen av duodenal papillanområdet (P), som kommer från den gemensamma gallkanalen och kärlen. Skala bar = 1000 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver det experimentella förfarandet för visualisering av det extrahepatiska gallvägarnas innervation genom att använda en antikropp mot neurofilamentprotein. Detta protokoll anpassades från protokollet som beskrivs av Kuratani och Tanaka 1 , 2 , 3 .
För detta experiment, planera tidslinjen för vart och ett av experimenten, eftersom hela monteringsfärgningen fortsätter i 2-3 veckor. Fartyget som innehåller vävnaden måste alltid roteras på en mutter, utom under frysnings- / tinasprocessen. Speciellt under inkubation med primära och sekundära antikroppar sattes provet i en kallförvaringskammare under rotering på en nutatör för att säkerställa enhetlig exponering av provet till reaktionslösningarna. Flera lösningar - 1% (vikt / volym) ortoperiodinsyra, 0,004% (vikt / volym) papain och utspädningsbuffert för primär / sekundär antiboDör - måste göras färskt för varje experiment. Genom protokollet, för att undvika att röra och skada provet vid byte av lösningar, bör lösningarna hällas i stället för att avlägsnas med tång 15 .
Efter fixering med PFA ska proven tvättas tillräckligt med DW eller PBS. Dessutom är den enzymatiska behandlingen med papaininkubationen viktig. Värmen och enzymet som används för antigenhämtning hjälper till att förbereda vävnaden för antikroppsgenomträngning. För att förbättra lösningenas penetration bör vävnadsens yttre membran avbrytas genom en frysbehandling vid -20 ° C under 30 minuter eller -80 ° C / N 15 .
Det är viktigt att fullständigt nedsänka försöksprovet i tillräckliga volymer buffertlösning för att säkerställa att lösningen kan inkubera hela provet. Inkubationstiden för den primära antikroppen måste bestämmas empirisktD för olika vävnader och provstorlekar. Vanligtvis måste det vara 3 dagar för ett 2-3 cm prov. Den optimala utspädningen måste bestämmas empiriskt för varje antikropp. En utspädning på 1: 600 rekommenderas för både primära och sekundära antikroppar när man använder lämplig antikroppsbuffert.
Detta arbete beskriver i detalj protokollet av en mångsidig helmonterad immunohistokemisk metod för att avslöja neurofilamentproteinuttryck i gallret hos gallonus. Denna metod kan användas för att analysera innervation av alla viscerala organ i många arter. Vidare kan detta protokoll också anpassas för att testa andra neuronala antikroppar, men optimering av antikropparna bör utföras.
Emellertid var tekniken begränsad vid märkning av grund nervös vävnad och vid konstruktion av en tredimensionell modell av innervation. Det kunde också inte identifiera egenskaperna hos nervfibrerna ( dvs. sympatisk eller parAsympatisk, motorisk eller sensorisk, etc. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
