Summary
सनकस मूरीनस में ऊष्ठीय पित्त पथ में neurofilament प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए, एक संपूर्ण पर्वत immunohistochemical दृष्टिकोण। यहां प्रस्तुत किया गया है इस प्रोटोकॉल का उपयोग एस। मूरीनस या अन्य प्रजातियों में सभी आंत के अंगों के इनहेरियेशन के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Abstract
यह काम पूरे-माउंट इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनाइजिंग विधि को विस्तार से बताता है, सनस्कस मूरीनस ( एस। मुरीनस में पितरी पथ के मूलकरण को लेबल करने के लिए neurofilament प्रोटीन एंटीबॉडी का उपयोग करके) )। सबसे पहले, नमूना एस murinus से विच्छेदित किया गया था और 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय। दूसरा, एक एंजाइमिक उपचार और संभावित अंतर्जात पेरोक्साइड निष्क्रियता का प्रदर्शन किया गया। नमूना तब 3-6 दिनों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी, एंटी-न्यूरॉफिलमेंट प्रोटीन एंटीबॉडी के सामने निकला था। यह तब माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubated था जो हॉर्सडाडिश पेरोक्साइड के साथ संयुग्मित किया गया था। रंग की प्रतिक्रिया 3,3'-हिरनोबेंजिडाइन (डीएबी) सब्सट्रेट के साथ नमूने पर प्रतिक्रिया के द्वारा प्रकट हुई। इस विधि को सभी आंतों के अवयवों के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य न्यूरॉनल एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन एंटीबॉडी का अनुकूलनएस पहले किया जाना चाहिए यह विधि मूल रूप से कुराटानी और तनाका 1 , 2 , 3 द्वारा प्रस्तुत की गई थी।
Introduction
घर कस्तूरी झांकना , सनकस मूरीनस , इनसेक्टीवोरो और परिवार सोरिसिडे के आदेश से संबंधित है। यह छोटे स्तनपायी दक्षिण पूर्व एशिया में वितरित किया जाता है और घरों और घास वाले क्षेत्रों में रहती है जो मानव बस्तियों या पशु कलम 4 के पास स्थित हैं। यह प्रजाति सामान्य रूप से अन्य प्रयोगशाला पशुओं, जैसे माउस, चूहा, और खरगोश 5 की तुलना में मनुष्यों के समान सामान्य रूपात्मक लक्षण दर्शाती है। इससे पहले, एस। मूरीनस न्यूरोफिलमेट प्रोटीन ( एनएफपी ) के लिए पेरीफेरल न्यूरॉन मार्कर के साथ पूरे माउंट इम्यूनोस्टाईंग का उपयोग अग्न्याशय 6 , प्रमुख डुओडानल पपिल 7 , पिलोरस 8 , पित्ताशय की थैली 5 , और ऊष्माशक पित्त पथ 9 में परिधीय नसों को लेबल करने के लिए किया गया था।
एनएफपी एक macromolecular जटिल है जो परिपक्व न्यूरोनल साइटोस्केलेटन का हिस्सा है। न्यूरोफ़िलामेंट से संबंधित प्रोटीनएनएफपी और ज़ीगोज़म के बीच मध्यस्थता का मध्यस्थता दोनों एंजाइम फ़ंक्शन और लिंकर प्रोटीन की संरचना को एनएफपी 10 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। एनएफपी कॉम्प्लेक्स तीन पॉलिप्टाइड के बने हैं: एनएफ-एल (70 केडीए), एनएफ-एम (150-160 केडीए), और एनएफ-एच (200 केडीए)। एनएफपी केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र दोनों में neuronal axons में पाया जा सकता है। एंटी-मानव एनएफपी एंटीबॉडी को केंद्रीय और पेरीफेरल नर्वस सिस्टम के एंजंस को लेबल करने के लिए दिखाया गया है। शारीरिक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल जांच से पता चला है कि दबानेवाला यंत्र, पित्ताशय का पत्थर, और समीपस्थ जठरांत्र संबंधी मार्ग 11 , 12 , 13 , 14 से जुड़े हैं। हालांकि, उनके न्यूरोनल कनेक्शन की रूपात्मक विशेषताएं अभी तक परिभाषित नहीं हुई हैं।
यह काम एस। मूरीन बील के मूलरूप को लेबल करने के लिए एक संपूर्ण-माउंट इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टैनिंग विधि को दर्शाता हैएक एनएफपी एंटीबॉडी के साथ आर्यन मार्ग
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Protocol
टोक्यो मेट्रोपॉलिटन यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसीएसी) ने सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी थी। पशुओं को देखभाल और प्रयोगशाला के प्रयोग के लिए गाइड और लैबोरेटरी जानवरों के उपयोग और पशु देखभाल पर कनाडाई परिषद के प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और उपयोग की मार्गदर्शिका के अनुसार संभाला गया था । जापान में टोक्यो मेट्रोपॉलिटन यूनिवर्सिटी, फ्रंटियर हेल्थ साइंसेज विभाग, फंक्शनल मोर्फोलॉजी लैबोरेटरी, पर हम नस्लें और रखरखाव करते थे।
1. पशु की देखभाल और आवास
- एक बंद प्रजनन कॉलोनी से 7 एस। मुरीनस (3 महिलाएं और 4-नर वजन वाले 70-90 ग्रा) प्राप्त करें।
- पिंजरे एस कुरीन व्यक्तिगत रूप से प्लास्टिक के पिंजरों में (जन्म के बाद 20 डी) दूध पिलाने के बाद एक लकड़ी के घोंसले बॉक्स से युक्त कागज स्ट्रिप्स युक्त। उन्हें पारंपरिक रूप से वातानुकूलित पशु कक्ष में रखें: 23-27 डिग्री सेल्सियस, कोई आर्द्रता नियंत्रण नहीं, और 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र आपूर्ति वाणिज्यIal ट्राउट छर्रों और पानी के शौकीन।
2. ऊतक की तैयारी
- 4% (डब्ल्यू / वी) पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) तैयार करने के लिए, पीएफए में 40 ग्राम 0.01 एम फॉस्फेट-बीफ़ेड सलाईन (पीबीएस, पीएच 7.4) के 1,000 मिलीलीटर में भंग कर दें। एक धूआं अलमारी में, समाधान स्पष्ट होने तक एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ओ / एन स्टोर करें
सावधानी: पीएफए को संभालने के दौरान उचित निजी सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें। - जानवरों को छिलके और ठीक करने के लिए, इसे ईथर के साथ अनैतिक बनाना और फिर इसे सोनोपेंटेन्टल (पेंटोबारबिटल सोडियम, 0.6 एमएल / किलोग्राम वजन) का एक इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन देना।
- जानवर पूरी तरह से मादक होने के बाद, एक स्केलपेल के साथ पेट की गुहा खोलो, एक मध्यम आकार के पेट की चीरे को 3 सेमी लंबा बनाएं। अन्वेषण करने के लिए अवर विना कावा को उकसाने के दौरान, इस धमनी के विभाजन के तुरंत ऊपर उदरगत महाधमनी में एक कैथेटर डालना, आम iliac धमनियों में।
- सोनोपेंटीले इंजेक्शन (पेंटोबारबिटल तोDium, 1.0 एमएल / किलोग्राम वजन)। पूर्ण इच्छामृत्यु के बाद, 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) और फिर 4% पीएफए के साथ एक धूआं अलमारी में छिड़कें।
- छिड़काव के बाद, रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए सफेद न्यूओप्रीन लेटेक्स (श्वेत neoprene लेटेक्स 3: 2 डिस्टिल्ड वॉटर (डीडब्ल्यू) के साथ 2-3 एमएल) इंजेक्षन करें।
- संबंधित तंत्रिकाओं और जहाजों के साथ यकृत, पित्ताशय की थैली, आम पित्त वाहिनी, ग्रहणी, और अग्न्याशय एन ब्लॉक सहित पेट के अंगों को निकालें।
- लगभग 0.1 एमएल नीली neoprene लेटेक्स (पतला सफेद neoprene लेटेक्स के 10 एमएल के लिए नीली स्याही की एक बूंद जोड़) पित्त प्रणाली लेबल करने के लिए पित्ताशय की थैली को इंजेक्षन।
- पूरे-माउंट इम्यूनोस्टेनेशन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए के साथ रात भर पोस्ट-फिक्स करें।
सावधानी: पीएफए विषाक्त है। पीएफए से निपटने से बचें पीएफए का उपयोग एक धूआं अलमारी में किया जाना चाहिए
3. पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री
नोट: धोना, एंटीबॉडी ऊष्मायन, और रंगाई, वें सहित, प्रोटोकॉल के दौरानए नमूनायटर पर रहना चाहिए, धीरे-धीरे आरटी पर कमाल करना या 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए ।
- 1 दिन: संभावित अंतर्जात पेरोक्साइड के एंजाइमेटिक उपचार और निष्क्रियता
- एक उचित आकार के कांच शीशी में आरटी पर प्रत्येक 1 घंटे के लिए डीडब्ल्यू 4x के साथ तैयार नमूना धो लें। पीएएफए को निकालने के लिए नटोरेटर पर नरम रॉक करें। नमूनों को नुकसान पहुंचाने से बचें, जब समाधान का आदान-प्रदान
- 1% (वाय / वी) ऑर्थोपेरोडीडिक एसिड तैयार करने के लिए, डीडब्ल्यू के 100 एमएल में ऑर्थोपेरोडिडिक एसिड के 1 ग्राम भंग।
- किसी भी आंतरिक पेरोक्साइड प्रतिक्रिया को रोकने के लिए आरटी पर 20 मिनट के लिए 1% ऑर्थोपेरोडिक एसिड में नमूना सेते हैं।
- 0.04 एमओएल / एल ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 7.6) में 100 एमएल में 0.004 ग्राम पपीन को भंग करके 0.004% (डब्ल्यू / वी) पपैन तैयार करें।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए डीडब्ल्यू के साथ नमूना धो लें
- नरम कमाल के साथ लगातार तापमान के तापमान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ताजा तैयार 0.004% पपैन में नमूना सेते हैं।
- डी के साथ नमूना धो लेंआरटी पर 50-60 मिनट के लिए डब्ल्यू
- 4 डिग्री सीओ / एन में 4% पीएफए में नमूना स्टोर करें
- दिन 2: एनजीमेटिक उपचार
- आरटी पर प्रत्येक 1 घंटे के लिए DW 4 बार के साथ संग्रहीत नमूना धो लें।
- नरम कमाल के साथ लगातार तापमान के तापमान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ताजा तैयार 0.004% पपैन में नमूना सेते हैं।
- आरटी पर 50-60 मिनट के लिए डीडब्ल्यू के साथ नमूना धो लें। 4 डिग्री सीओ / एन में 4% पीएफए में नमूना स्टोर करें
- दिन 3: बर्फ़ीली उपचार
- उपरोक्त के अनुसार आरटी पर प्रत्येक 1 घंटे के लिए DW 4x के साथ संग्रहीत नमूना को धो लें।
- 0.01 एम पीबीएस के 100 एमएल में, क्रमशः 2.5 ग्राम, 5 ग्राम और 10 ग्राम सूक्रोज को भंग करके 2.5% (डब्ल्यू / वी), 5% (डब्ल्यू / वी), और 10% (डब्ल्यू / वी) सोक्रोज तैयार करें ( पीएच 7.4)।
- 2.5% (w / v), 5% (w / v), और 10% (w / v) 30 मिनट प्रत्येक के लिए सूक्रोज में नमूना विसर्जित करें।
- नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए फ्रीज करें और फिर इसे आरटी पर पूरी तरह पिघलना; चक्र 3x को दोहराएं
- पी के लिए2% ट्राइटन एक्स-100 (वी / वी) का दोबारा, 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) के ट्रिपन एक्स-100 से 100 एमएल के 2 एमएल जोड़ें।
- नमूना को 2% ट्राइटन एक्स -100 में 4 डिग्री सीओ / एन में स्टोर करें
- दिन 4: प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
- बोवाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) के 0.2 ग्राम, ट्राइटन एक्स -100 के 0.3 एमएल, और 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) के 100 एमएल में 0.1 ग्राम सोडियम एजाइड को भंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के समाधान तैयार करें।
सावधानी: सोडियम अजाइड तीव्र विषाक्त है। साँस लेना और छूने से बचा जाना चाहिए। उचित पीपीई पहनें - प्राथमिक एंटीबॉडी (एनएफपी) 1: 600 को कमजोर पड़ने वाले बफर (चरण 3.4.1) में पतला। नमूनों को एनएफपी एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-6 दिनों तक सेते, नटोरर पर धीरे से कमाल करते हुए नमूना रखते हुए। बड़े नमूने के लिए ऊष्मायन समय में वृद्धि की आवश्यकता होगी ।
- बोवाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) के 0.2 ग्राम, ट्राइटन एक्स -100 के 0.3 एमएल, और 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) के 100 एमएल में 0.1 ग्राम सोडियम एजाइड को भंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के समाधान तैयार करें।
- माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
- प्रतिबाधा प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस 4x में नमूना धो लें 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7.4) के 100 एमएल में 0.2 ग्राम बीएसए और 0.3 एमएल ट्रिटोन एक्स -100 भंग करके द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने के समाधान तैयार करें।
- कमजोर पड़ने वाले बफर (चरण 3.5.2) में माध्यमिक एंटीबॉडी (पेरोक्साइड-संयुग्मित, आत्मीयता-शुद्ध भेड़ विरोधी माउस आईजीजी-एचआरपी) 1: 600 को पतला। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी के माध्यमिक एंटीबॉडी से सेते हैं, और नटोरेटर पर धीरे से कमाल करने वाले नमूने रखें।
- रंगाई
- अंधेरे में समाधान को रखने के लिए, धूआं अलमारी के नीचे 0.003 ग्राम 3,3'-हिरनोबेंजिडाइन टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) को 0.05 मॉल / एल ट्राइस-एचसीएल बफर (पीएच 7.6) के 100 एमएल तक जोड़कर तैयार करें।
- 1 एच के लिए पीबीएस 4x में आरटी पर नमूनों को धो लें
- ताजे तैयार किए गए थपका रंग के समाधान में 10 μL 30% एच 2 ओ 2 जोड़ें और समाधान के साथ 4 डिग्री सीओ / एन या 3 डी के लिए सेवन करें और धीरे-धीरे नायटर पर रौंदते रहें।
- पीएलए द्वारा प्रतिक्रिया रोकें0.04% सोडियम अजाइड के साथ पीबीएस में नमूना देना, जब इष्टतम धुंधला तीव्रता पहुंच जाती है।
नोट: इस चरण तक सोडियम एजाइड के उपयोग से बचें, क्योंकि यह हॉर्सडाडिश पेरोक्साइड को रोकता है।
- दाग टिशू इमेजिंग
- नमूना को पेटी कांच के डिश (5 सेंटीमीटर ऊंची, व्यास में 10 सेंटीमीटर) में स्थानांतरित करें, जिसमें पीबीएस मौजूद है। एक स्टीरियोमोरिक्रोस्कोप पर घुड़सवार कैमरा का उपयोग करके पूरे-माउंट चित्र कैप्चर करें।
नोट: पारदर्शी ग्लास डिश पर पीबीएस में पूरी तरह से डूबते हुए पूरे माउंट दाग टिशू को इमेज किया जाना चाहिए।
- नमूना को पेटी कांच के डिश (5 सेंटीमीटर ऊंची, व्यास में 10 सेंटीमीटर) में स्थानांतरित करें, जिसमें पीबीएस मौजूद है। एक स्टीरियोमोरिक्रोस्कोप पर घुड़सवार कैमरा का उपयोग करके पूरे-माउंट चित्र कैप्चर करें।
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Representative Results
आंकड़े 1 - 4 एस । मूरीनस में ऊष्मीय पेटी पथ में एनएफपी-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं के लिए विशिष्ट परिणाम दिखाते हैं । एनएफपी के प्रति एंटीबॉडी ने उच्च विशिष्टता और न्यूनतम के साथ ऊर्ध्वाधर पित्त पथ ( चित्रा 1 ), पित्ताशय की थैली ( चित्रा 2 ), ऊपरी पित्त वाहिनी ( चित्रा 3 ), और ग्रहणीदार पेपिलिया क्षेत्र ( चित्रा 4 ) की संपूर्ण छवि में प्रत्यारोपण नामित किया है पृष्ठभूमि।
नमूना के सभी ऊतकों के लिए, आकार और आकार की परवाह किए बिना, एक ही समय में टेग्नेटिकल तंत्रिकाओं को रंग दिया जा सकता है। अतिरिक्त गर्भस्थ पित्त पथ के अस्तित्व के अलावा, घुटकी और पेट के वोगों के चलने और वितरण घनत्व को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया था ( चित्रा 1 )।
चित्रा 2 ) के फूनुस की तुलना में गर्दन में मस्तिष्क में अधिकरण की घनत्व अधिक थी।
ऊपरी पित्त नलिका में, दो प्रकार के तंत्रिका बंडलों को लेबल किया गया था। ठीक तंत्रिका बंडलों ने नसों के एक अनियमित और घने नेटवर्क का गठन किया, चिपचिपा रूप से भाग गया, और पितरी पथ में रहने पर; घने तंत्रिका बंडलों को पितरी पथ की सतह ( चित्रा 3 ) के समानांतर वितरित किया गया था।
सामान्य पित्त नलिका नीले neoprene लेटेक्स और सफेद neoprene लेटेक्स के साथ जहाजों के साथ लेबल किया गया था। सामान्य पित्त वाहिनी के अंत में पतली तंत्रिका फाइबर और डुओडानल पपिलिया क्षेत्र को स्पष्ट रूप से उच्च सी के साथ दिखाया गया था ओट्रास्ट ( चित्रा 4 )।
चित्रा 1: पित्त पथ में एनएफपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर, एसिफगस और पेट। तीर पोषण के साथ घुटकी के साथ चलने वाले वोग्स को दिखाते हैं। सीबीडी, सामान्य पित्त वाहिनी; Es, अन्नफिगस; सेंट, पेट स्केल बार = 1,300 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: पित्ताशय की थैली में एनएफपी पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं। पित्ताशय की थैली के रक्त वाहिकाओं को सफेद लेटेक्स के साथ लेबल किया गया था। प्रचुर मात्रा में स्थिरता पैतृक तलवार (तीर) की गर्दन में हुई। स्केल बार = 1000 माइक्रोनRef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ऊपरी पित्त नलिका में एनएफपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर। दो प्रकार के तंत्रिका बंडलों को मनाया गया। एक प्रकार का एक अच्छा तंत्रिका बंडल होता है जो चिपकने वाला था और ऊपरी हड्डी वाला पथरी (तीर) में रहता था; दूसरे प्रकार के घुटने वाले तंत्रिका बंडल थे जो ऊर्ध्वपथीय पित्त पथ की सतह के समानांतर वितरित किए गए थे और पित्ताशय की चक्की और ग्रहणी (त्रिभुज) के बीच भाग रहे थे। पीवी, पोर्टल की नस स्केल बार = 650 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: डुओडेनल पापीला क्षेत्र में एनएफपी-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर। सामान्य पित्त वाहिनी को नीले लेटेक्स और सफेद लेटेक्स (*) के साथ जहाज लगाया गया था। तीर आम पित्त नल के अंत के संरक्षण को दर्शाती है, और त्रिकोणों में द्विपक्षीय पेपिलिया क्षेत्र (पी) के मूलरूप को दिखाया जाता है, जो आम पित्त नलिका और जहाजों से आता है। स्केल बार = 1000 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यह काम, न्यूरोफिलामेंट प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए असाधारण पित्तिक पथ के अन्वेषण के दृश्य के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल को कुरातिनी और तनाका 1 , 2 , 3 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था।
इस प्रयोग के लिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए समयरेखा की योजना बनाएं, क्योंकि पूरे माउंट स्टैनिंग दृष्टिकोण 2-3 सप्ताह तक जारी रहता है। ऊतक वाले पोत को फ्रीटर / थॉ प्रक्रिया के दौरान, हर समय एक नायटर पर घुमाया जाना चाहिए। विशेष रूप से प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के दौरान, नमूना प्रतिक्रिया समाधान के लिए नमूना के एकसमान जोखिम सुनिश्चित करने के लिए एक nutator पर घूर्णन करते समय एक ठंडा भंडारण कक्ष में स्थापित किया गया था। कई समाधान - 1% (वाय / वी) ऑर्थोपेरोडीडिक एसिड, 0.004% (डब्ल्यू / वी) पपीन, और प्राथमिक / द्वितीयक एंटीबो के लिए कमजोर पड़ने वाले बफरमरता है - प्रत्येक प्रयोग के लिए ताज़ा होना चाहिए प्रोटोकॉल के दौरान, समाधान बदलते समय नमूना को छूने और हानि करने से बचने के लिए, संदंश 15 के साथ हटाए जाने के बजाय समाधान निकाला जाना चाहिए।
पीएफए के साथ फिक्सिंग के बाद, नमूने डीडब्ल्यू या पीबीएस के साथ पर्याप्त रूप से धोया जाना चाहिए। इसके अलावा, papain ऊष्मायन के साथ एंजाइमी उपचार महत्वपूर्ण है। एंटीजेन पुनर्प्राप्ति के लिए इस्तेमाल गर्मी और एंजाइम एंटीबॉडी पैंट के लिए ऊतक तैयार करने में मदद करते हैं। समाधान के प्रवेश को बढ़ाने के लिए, ऊतक के बाहरी झिल्ली को ठंडे उपचार से -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट या -80 डिग्री CO / एन 15 के लिए बाधित किया जाना चाहिए।
यह बफर समाधान के पर्याप्त मात्रा में प्रयोगात्मक नमूनों को पूरी तरह से डुबो देना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समाधान पूरे नमूना को सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी का ऊष्मायन समय व्यावहारिक रूप से निर्धारित होना चाहिएविभिन्न ऊतकों और नमूना आकारों के लिए घ। आमतौर पर, यह 2-3 सेमी नमूना के लिए होना चाहिए। इष्टतम कमजोर पड़ने वाले प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुभवपूर्वक निर्धारित किया जाना चाहिए। उचित एंटीबॉडी बफर का उपयोग करते समय 1: 600 पर एक कमजोर पड़ने की प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए सिफारिश की जाती है।
यह काम एस murinus के पित्त पथ में neurofilament प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रकट करने के लिए एक बहुमुखी पूरे माउंट immunohistochemical दृष्टिकोण के प्रोटोकॉल, विस्तार से वर्णन करता है । इस पद्धति का उपयोग कई प्रजातियों में सभी आंत अंगों के अन्वेषण का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य न्यूरॉनल एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन एंटीबॉडी का अनुकूलन किया जाना चाहिए।
हालांकि, तकनीक उथले तंत्रिका ऊतक के लेबलिंग और इन्वर्धन के तीन आयामी मॉडल के निर्माण में सीमित थी। इसके अलावा, यह तंत्रिका फाइबर की विशेषताओं की पहचान नहीं कर सका ( यानी सहानुभूति या सममूल्यAsympathetic, मोटर या संवेदी, आदि )।
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Disclosures
लेखक किसी प्रकार के हित संघर्ष की घोषणा नहीं करते।
Acknowledgments
लेखकों के पास कोई स्वीकार नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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