Summary
Ein ganzheitlicher immunhistochemischer Ansatz, um die Neurofilament-Protein-Expression im extrahepatischen Gallengang in Suncus murinus zu visualisieren. Wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe in S. murinus oder anderen Spezies zu analysieren.
Abstract
Diese Arbeit beschreibt die Vollständige Immunhistochemie Färbung Methode im Detail, mit Neurofilament Protein-Antikörper, um die Innervation der Gallenwege in Suncus murinus ( S. murinus ). Zuerst wurde das Exemplar von S. murinus seziert und in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Zweitens wurde eine enzymatische Behandlung und potentielle endogene Peroxidase-Inaktivierung durchgeführt. Die Probe wurde dann dem primären Antikörper, Anti-Neurofilament-Protein-Antikörper, für 3-6 Tage ausgesetzt. Es wurde dann mit dem sekundären Antikörper inkubiert, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war. Die Farbreaktion wurde durch Umsetzen der Probe mit einem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat aufgedeckt. Diese Methode kann angewendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe zu analysieren. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um andere neuronale Antikörper zu testen, aber die Optimierung der antibodiEs sollte zuerst getan werden. Diese Methode wurde ursprünglich von Kuratani und Tanaka 1 , 2 , 3 eingeführt.
Introduction
Das Haus Moschusspitzmaus , Suncus murinus , gehört zur Ordnung Insektivora und die Familie Soricidae. Dieses kleine Säugetier ist in Südostasien verteilt und bewohnt Häuser und Rasenflächen, die in der Nähe von menschlichen Wohnräumen oder Viehstiften liegen 4 . Diese Spezies weist allgemeine morphologische Merkmale auf, die den Menschen ähnlicher sind als andere Labortiere wie Maus, Ratte und Kaninchen 5 . Bisher wurde eine Vollmontage-Immunfärbung mit einem peripheren Neuron-Marker für S. murinus- Neurofilament-Protein (NFP) verwendet, um die peripheren Nerven in der Bauchspeicheldrüse 6 , der großen Duodenalpapille 7 , dem Pylorus 8 , der Gallenblase 5 und dem extrahepatischen Gallengang 9 zu markieren.
NFP ist ein makromolekularer Komplex, der Teil des reifen neuronalen Zytoskeletts ist. Neurofilament-verwandtes ProteinS Zwischenwechsel zwischen NFP und dem Zygosom. Sowohl die Enzymfunktion als auch die Struktur der Linkerproteine werden durch NFP 10 reguliert. Der NFP-Komplex besteht aus drei Polypeptiden: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) und NF-H (200 kDa). NFP kann in neuronalen Axonen sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem gefunden werden. Anti-Human-NFP-Antikörper wurde gezeigt, um Axone des zentralen und peripheren Nervensystems zu etikettieren. Anatomische und elektrophysiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass der Sphinkter, die Gallenblase und der proximale Magen-Darm-Trakt 11 , 12 , 13 , 14 verbunden sind. Allerdings sind die morphologischen Merkmale ihrer neuronalen Verbindungen noch nicht definiert.
Diese Arbeit zeigt die Verwendung einer ganz-montierten immunhistochemischen Färbemethode, um die Innervation des S. murinus bil zu etikettierenIary Trakt mit einem NFP-Antikörper.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tokyo Metropolitan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Kanadischen Rates für Tierpflege untergebracht und behandelt . Wir benutzten Tiere, die im Functional Morphology Laboratory, Department of Frontier Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Japan gezüchtet und gepflegt wurden.
1. Tierpflege und Wohnraum
- Erhalten Sie 7 S. murinus (3 Frauen und 4 Männer mit einem Gewicht von 70-90 g) aus einer geschlossenen Zuchtkolonie.
- Käfig der S. murinus einzeln nach der Entwöhnung (20 d nach der Geburt) in Plastikkäfige ausgestattet mit einem hölzernen Nistkasten mit Papierstreifen. Halten Sie sie in einem konventionell konditionierten Tierraum: 23-27 ° C, keine Feuchtigkeitsregelung und ein 12:12 h Licht: dunkler Zyklus. Versorgung commercPellets und Wasser ad libitum.
2. Gewebevorbereitung
- Zur Herstellung von 4% (Gew./Vol.) Paraformaldehyd (PFA) werden 40 g PFA in 1000 ml 0,01 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gelöst. In einem Abzug, mischen mit einem Wirbel, bis die Lösung klar ist. Die 4% PFA O / N bei 4 ° C aufbewahren.
Achtung: Bei der Handhabung von PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. - Um das Tier zu perfundieren und zu fixieren, es mit Äther zu betäuben und dann eine intraperitoneale Injektion von Somnopentyl (Pentobarbital-Natrium, 0,6 ml / kg Körpergewicht) zu geben.
- Nachdem das Tier vollständig narkotisiert ist, öffne die Bauchhöhle mit einem Skalpell und schaffe einen Mittellinien-Bauchschnitt 3 cm lang. Während man die untere Hohlvene zum Exsanguinieren eindringt, führe einen Katheter nachträglich in die Bauchaorta ein, und zwar auf dem Niveau unmittelbar oberhalb der Verzweigung dieser Arterie in die Arteria iliaca-Arterien.
- Injizieren Sie Somnopentyl (Pentobarbital soDium, 1,0 mL / kg Körpergewicht). Nach vollständiger Euthanasie mit 0,01 M PBS (pH 7,4) und dann mit 4% PFA in einem Abzug.
- Nach der Perfusion 2-3 ml weißer Neopren-Latex (verdünnter weißer Neopren-Latex 3: 2 mit destilliertem Wasser (DW)) einspritzen, um die Blutgefäße zu etikettieren.
- Entleeren Sie die Bauchorgane, einschließlich der Leber, Gallenblase, gemeinsame Gallengang, Duodenum und Pankreas en bloc, mit den verwandten Nerven und Gefäßen.
- Injizieren Sie etwa 0,1 ml blauen Neopren-Latex (fügen Sie einen Tropfen blauer Tinte zu 10 ml des verdünnten weißen Neopren-Latex hinzu) an die Gallenblase, um das Gallensystem zu markieren.
- Nach-Fixierung über Nacht mit 4% PFA bei 4 ° C für Vollmontage-Immunfärbung.
Achtung: PFA ist giftig. Vermeiden Sie die Handhabung von PFA direkt. PFA sollte in einem Abzug verwendet werden.
3. Vollständige Immunhistochemie
Anmerkung: Während des Protokolls, einschließlich während des Waschens, Antikörperinkubation und Färbung, thDie Probe muss auf dem Nutator bleiben, vorsichtig bei RT oder bei 4 ° C schaukeln .
- Tag 1: Enzymatische Behandlung und Inaktivierung potentieller endogener Peroxidase
- Die vorbereitete Probe mit DW 4x für jeweils 1 h bei RT in einer entsprechend bemessenen Glasampulle waschen. Führen Sie die Probe sanft auf die Nutator, um die PFA zu entfernen. Vermeiden Sie es, die Probe beim Austausch von Lösungen zu beschädigen.
- Zur Herstellung von 1% (w / v) Orthopiodsäure, löst man 1 g Orthopiodsäure in 100 ml DW auf.
- Inkubieren Sie die Probe in 1% orthoperiodischer Säure für 20 min bei RT, um eine intrinsische Peroxidase-Reaktion zu verhindern.
- 0,004% (w / v) Papain durch Auflösen von 0,004 g Papain in 100 ml 0,025 mol / l Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) vorbereiten.
- Die Probe mit DW für 10 min bei RT waschen.
- Inprobieren Sie die Probe in frisch zubereiteten 0,004% Papain für 2 h bei 37 ° C in einem konstanten Temperaturbad mit sanftem Schütteln.
- Waschen Sie das Exemplar mit DW für 50-60 min bei RT.
- Die Probe in 4% PFA bei 4 ° CO / N aufbewahren.
- Tag 2: Enzymatische Behandlung
- Waschen Sie die gespeicherte Probe mit DW 4 mal für jeweils 1 h bei RT.
- Inprobieren Sie die Probe in frisch zubereiteten 0,004% Papain für 2 h bei 37 ° C in einem konstanten Temperaturbad mit sanftem Schütteln.
- Die Probe mit DW für 50-60 min bei RT waschen. Die Probe in 4% PFA bei 4 ° CO / N aufbewahren.
- Tag 3: Einfrieren Behandlung
- Waschen Sie die gespeicherte Probe mit DW 4x für 1 h jeweils bei RT, wie oben.
- 2% (w / v), 5% (w / v) und 10% (w / v) Saccharose durch Auflösen von 2,5 g, 5 g bzw. 10 g Saccharose in 100 ml 0,01 M PBS ( PH 7,4).
- Tauchen Sie die Probe in 2,5% (w / v), 5% (w / v) und 10% (w / v) Saccharose für jeweils 30 min ein.
- Die Probe bei -20 ° C für 30 - 60 min einfrieren und bei RT vollständig auftauen; Wiederholen Sie den Zyklus 3x.
- Oben2% Triton X-100 (v / v) abgeben, 2 ml Triton X-100 zu 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) zugeben.
- Die Probe in 2% Triton X-100 bei 4 ° CO / N aufbewahren.
- Tag 4: Inkubation des primären Antikörpers
- Die Verdünnungslösung des primären Antikörpers wird durch Auflösen von 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 und 0,1 g Natriumazid in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) hergestellt.
Achtung: Natriumazid ist akut toxisch. Einatmen und Berühren müssen vermieden werden. Tragen Sie geeignete PPE. - Verdünnen Sie den primären Antikörper (NFP) 1: 600 im obigen Verdünnungspuffer (Schritt 3.4.1). Inkubieren Sie die Probe mit NFP-Antikörper bei 4 ° C für 3-6 Tage, wobei die Probe vorsichtig auf dem Nuss- Größere Exemplare benötigen erhöhte Inkubationszeiten.
- Die Verdünnungslösung des primären Antikörpers wird durch Auflösen von 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 und 0,1 g Natriumazid in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) hergestellt.
- Sekundäre Antikörper-Inkubation
- Waschen Sie die Probe in PBS 4x für 1 h jeweils bei RT, um ungebundenen primären Antikörper zu entfernen. Die Verdünnungslösung für den sekundären Antikörper durch Auflösen von 0,2 g BSA und 0,3 ml Triton X-100 in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) vorbereiten.
- Verdünnen Sie den sekundären Antikörper (Peroxidase-konjugiertes, affinitätsgereinigtes Schaf-anti-Maus-IgG-HRP) 1: 600 im Verdünnungspuffer (Schritt 3.5.2). Inkubieren Sie die Probe mit dem sekundären Antikörper bei 4 ° C für 3 d und halten Sie die Probe vorsichtig auf den Nutator.
- Färbung
- Vorbereitung der DAB-Farblösung durch Zugabe von 0,002 g 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) zu 100 ml 0,05 mol / l Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) unter einem Abzug, wobei die Lösung im Dunkeln gehalten wird.
- Waschen Sie die Proben bei RT in PBS 4x für jeweils 1 h.
- 10 μl 30% iges H 2 O 2 in frisch hergestellter DAB-Farblösung zugeben und mit der Lösung bei 4 ° CO / N oder für 3 d inkubieren, während sie vorsichtig auf den Nuss-
- Stoppen Sie die Reaktion von plaCing die Probe in PBS mit 0,04% Natriumazid, wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Natriumazid bis zu diesem Schritt, da es die Meerrettichperoxidase hemmt.
- Bildgebung des gefärbten Gewebes
- Sorgfältig die Probe auf eine Petrischale (5 cm hoch, 10 cm im Durchmesser) mit PBS übertragen. Erfassen Sie ganzheitliche Bilder mit einer Kamera, die auf einem Stereomikroskop montiert ist.
HINWEIS: Vollständig gefärbtes Gewebe sollte abgebildet werden, während es vollständig in PBS auf einer transparenten Glasschale eingetaucht wird.
- Sorgfältig die Probe auf eine Petrischale (5 cm hoch, 10 cm im Durchmesser) mit PBS übertragen. Erfassen Sie ganzheitliche Bilder mit einer Kamera, die auf einem Stereomikroskop montiert ist.
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Representative Results
Die Abbildungen 1 - 4 zeigen typische Ergebnisse für NFP-positive Nervenfasern im extrahepatischen Gallengang in S. murinus . Der Antikörper gegen NFP markierte reproduzierbar die Innervation im gesamten Bild des extrahepatischen Gallenganges (Abbildung 1 ), Gallenblase (Abbildung 2 ), oberer Gallengang (Abbildung 3 ) und Duodenalpapillen (Abbildung 4 ) mit hoher Spezifität und minimal Hintergrund.
Für alle Gewebe der Probe, unabhängig von Form und Größe, können die tegmentalen Nerven gleichzeitig gefärbt werden. Neben der Innervation des extrahepatischen Gallenganges zeigte sich die Lauf- und Verteilungsdichte des Vagus der Speiseröhre und des Magens eindeutig (Abbildung 1 ).
Abb. 2 ).
Im oberen Gallengang wurden zwei Arten von Nervenbündeln markiert. Die feinen Nervenbündel bildeten ein unregelmäßiges und dichtes Netz von Nerven, liefen klebend und wohnten auf dem Gallengang; Die dickeren neuronalen Bündel wurden parallel zur Oberfläche des Gallenganges verteilt (Abbildung 3 ).
Der gemeinsame Gallengang wurde mit blauem Neopren-Latex und den Gefäßen mit weißem Neopren-Latex markiert. Die dünnen Nervenfasern am Ende des gemeinsamen Gallenganges und des Duodenalpapillengebietes wurden mit hoher c deutlich gezeigt Ontrast (Abbildung 4 ).
Abbildung 1: NFP-positive Nervenfasern im Gallengang, der Speiseröhre und der Magen. Pfeile zeigen die Vagus entlang der Speiseröhre auf den Bauch. CBD, Gemeinsame Gallengang; Es, Ösophagus; St, magen Maßstab = 1300 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: NFP-positive Nervenfasern in der Gallenblase. Die Blutgefäße der Gallenblase wurden mit weißem Latex markiert. Im Nacken der Gallenblase (Pfeile) trat eine reichliche Innervation auf. Maßstab = 1.000 μmRef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: NFP-positive Nervenfasern im Oberen Gallengang. Es wurden zwei Arten von Nervenbündeln beobachtet. Ein Typ war die feinen Nervenbündel, die klebend anliefen und auf dem extrahepatischen Gallengang (Pfeile) wohnten; Der andere Typ war dickere neuronale Bündel, die parallel zur Oberfläche des extrahepatischen Gallenganges verteilt waren und zwischen Gallenblase und Duodenum (Dreiecke) liefen. PV, Portalvene Maßstab = 650 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: NFP-positive Nervenfasern im Duodenal-Papilla-Bereich. Der gemeinsame Gallengang wurde mit blauem Latex und den Gefäßen mit weißem Latex (*) markiert. Die Pfeile zeigen die Innervation des Endes des gemeinsamen Gallenganges, und Dreiecke zeigen die Innervation des Duodenalpapillengebietes (P), die aus dem gemeinsamen Gallengang und den Gefäßen stammt. Maßstab = 1.000 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Verfahren zur Visualisierung der Innervation des extrahepatischen Gallenweges unter Verwendung eines Antikörpers gegen Neurofilamentprotein. Dieses Protokoll wurde aus dem von Kuratani und Tanaka 1 , 2 , 3 beschriebenen Protokoll angepasst.
Für dieses Experiment planen Sie die Timeline für jedes der Experimente, da der Voll-Mount-Färbe-Ansatz für 2-3 Wochen andauert. Das Gefäß, das das Gewebe enthält, muss zu jeder Zeit auf einem Nutator gedreht werden, außer während des Gefrier- / Tau-Prozesses. Insbesondere während der Inkubation mit den primären und sekundären Antikörpern wurde die Probe in eine Kältespeicherkammer gegeben, während sie sich auf einem Nussring drehte, um eine gleichmäßige Belichtung der Probe gegenüber den Reaktionslösungen zu gewährleisten. Mehrere Lösungen - 1% (w / v) orthoperiodische Säure, 0,004% (w / v) Papain und der Verdünnungspuffer für das primäre / sekundäre AntibiotikumStirbt - muss für jedes Experiment frisch gemacht werden. Während des Protokolls, um zu vermeiden, zu berühren und zu beschädigen die Probe beim Ändern von Lösungen, sollten die Lösungen ausgegossen werden, anstatt mit Pinzette entfernt werden 15 .
Nach der Fixierung mit PFA sollten die Proben ausreichend mit DW oder PBS gewaschen werden. Darüber hinaus ist die enzymatische Behandlung mit der Papain-Inkubation wichtig. Die Hitze und das Enzym, das für die Antigen-Retrieval verwendet wird, helfen, das Gewebe für die Antikörperpenetration vorzubereiten. Um das Eindringen der Lösungen zu verbessern, sollte die äußere Membran des Gewebes durch eine Gefrierbehandlung bei -20 ° C für 30 min oder -80 ° CO / N 15 unterbrochen werden.
Es ist wichtig, die experimentelle Probe in ausreichenden Mengen an Pufferlösung vollständig zu tauchen, um sicherzustellen, dass die Lösung die gesamte Probe inkubieren kann. Die Inkubationszeit des primären Antikörpers muss empirisch bestimmenD für verschiedene Gewebe und Probengrößen. Normalerweise muss es 3 Tage für eine 2-3 cm Probe sein. Die optimale Verdünnung muss für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden. Eine Verdünnung bei 1: 600 wird sowohl für den primären als auch für den sekundären Antikörper empfohlen, wenn der entsprechende Antikörperpuffer verwendet wird.
Diese Arbeit beschreibt im Detail das Protokoll eines vielseitigen, vollständigen immunhistochemischen Ansatzes, um die Neurofilament-Protein-Expression im Gallengang von S. murinus zu zeigen . Diese Methode kann verwendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe in vielen Arten zu analysieren. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um andere neuronale Antikörper zu testen, aber eine Optimierung der Antikörper sollte durchgeführt werden.
Allerdings war die Technik bei der Etikettierung von flachem Nervengewebe und bei der Konstruktion eines dreidimensionalen Modells der Innervation begrenzt. Auch konnte man die Eigenschaften der Nervenfasern nicht identifizieren ( dh sympathisch oder parAsympathisch, motorisch oder sensorisch usw. ).
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Anerkennung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
