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Biology

Utilizzando un metodo immunohistochemico integrale per studiare l'innervazione del tratto bipolare in Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55483
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Frontier Health Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Anatomy, Tokyo Medical University, 3Area of Regulatory Biology, Division of Life Science, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

Summary

Un approccio immunoistochimico a tutto tondo, per visualizzare l'espressione di proteine ​​del neurofilamento nel tratto biliare extraepatico in Suncus murinus. È qui presentato. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali di S. murinus o di altre specie.

Abstract

Questo lavoro descrive dettagliatamente il metodo di colorazione immunohistochemica a tutto campo, utilizzando l'anticorpo proteico neurofilamento per etichettare l'innervazione del tratto biliare in Suncus murinus ( S. murinus   ). In primo luogo, il campione è stato disciolto da S. murinus e fissato in 4% di paraformaldeide (PFA). In secondo luogo, sono stati eseguiti un trattamento enzimatico e una potenziale inattivazione endogena della perossidasi. Il campione è stato poi esposto all'anticorpo primario, anticorpo anti-neurofilamento proteico, per 3-6 giorni. Fu quindi incubato con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. La reazione a colori è stata rivelata reagendo il campione con un substrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Questo metodo può essere applicato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali. Inoltre, questo protocollo può anche essere adattato per testare altri anticorpi neuronali, ma l'ottimizzazione degli antibodiDovrebbe essere fatto prima. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .

Introduction

Il muschio della casa, Suncus murinus , appartiene all'ordine Insectivora e alla famiglia Soricidae. Questo piccolo mammifero è distribuito in tutto il Sud-Est asiatico e abita case e aree erbose che si trovano vicino a abitazioni umane o penne di bestiame 4 . Questa specie presenta caratteristiche morfologiche generali più simili agli esseri umani rispetto ad altri animali da laboratorio, come il topo, il topo e il coniglio 5 . In precedenza, l'immunostaining con un marker di neurone periferico per la proteina del neurofilamento di S. murinus (NFP) è stato usato per etichettare i nervi periferici nel pancreas 6 , maggiore papilla duodenale 7 , pylorus 8 , cistifellea 5 e tratto biliare extraepatico 9 .

NFP è un complesso macromolecolare che fa parte del citoscheletro neuronale maturo. Proteina legata al neurofilamentoLe interazioni mediate tra NFP e zigosoma. La funzione enzimatica e la struttura delle proteine ​​di collegamento sono regolate da NFP 10 . Il complesso NFP è costituito da tre polipeptidi: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) e NF-H (200 kDa). NFP può essere trovato in assoni neuronali sia nel sistema nervoso centrale che nei periferici. È stato dimostrato che l'anticorpo anti-umano del NFP ha etichettato assoni del sistema nervoso centrale e periferico. Le indagini anatomiche ed elettrofisiologiche hanno dimostrato che lo sfintere, la cistifellea e il tratto gastrointestinale prossimale sono collegati 11 , 12 , 13 , 14 . Tuttavia, le caratteristiche morfologiche delle loro connessioni neuronali non sono ancora state definite.

Questo lavoro dimostra l'utilizzo di un metodo di colorazione immunohistochemico a tutto campo per etichettare l'innervazione del S. murinus bilCon un anticorpo NFP.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Tokyo Metropolitan University (IACUC). Gli animali sono stati alloggiati e trattati secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la Guida per la cura e l'uso degli animali sperimentali del Consiglio canadese sulla cura degli animali. Abbiamo usato animali allevati e mantenuti presso il Laboratorio Morfologico Funzionale, Dipartimento di Scienze della Salute Frontiere, Tokyo Metropolitan University, Giappone.

1. Cura degli animali e alloggi

  1. Ottenere 7 S. murinus (3 femmine e 4 maschi che pesano 70-90 g) da una colonia di riproduzione chiusa.
  2. Gabbia il S. murinus individualmente dopo lo svezzamento (20 d dopo la nascita) in gabbie di plastica dotate di una scatola di nido di legno contenente strisce di carta. Tenerli in un ambiente animale convenzionalmente condizionato: 23-27 ° C, nessun controllo dell'umidità e 12:12 h luce: ciclo scuro. Fornitura commercPellicole di trota e acqua ad libitum.

2. Preparazione del tessuto

  1. Per preparare 4% (w / v) paraformaldeide (PFA), sciogliere 40 g di PFA in 1.000 ml di salinio fosfato-bufferizzato da 0,01 M (PBS, pH 7,4). In un armadio di fumo, mescolare usando un vortice fino a quando la soluzione è chiara. Conservare il 4% PFA O / N a 4 ° C.
    Attenzione: indossare adeguate apparecchiature protettive personali (PPE) durante la manipolazione del PFA.
  2. Per perfezionare e fissare l'animale, anestetizzarlo con l'etere e poi darle un'iniezione intraperitoneale di somnopentil (pentobarbital sodio, 0,6 ml / kg di peso corporeo).
  3. Dopo che l'animale è completamente narcotizzato, aprire la cavità addominale con un bisturi, creando un'incisione addominale mediana di 3 cm di lunghezza. Mentre incide la vena cava inferiore per exsanguining, inserire un catetere retrogradamente nell'aorta addominale al livello immediatamente superiore alla biforcazione di questa arteria nelle arterie ilieche comuni.
  4. Iniettare somnopentil (pentobarbital cosìDium, 1,0 mL / kg di peso corporeo). Dopo la completa eutanasia, perfezionare con 0,01 M PBS (pH 7,4) e poi con 4% PFA in un armadio di fumo.
  5. Dopo la perfusione, iniettare 2-3 mL di lattice in neoprene bianco (diluire il lattice di neoprene bianco 3: 2 con acqua distillata (DW)) per etichettare i vasi sanguigni.
  6. Estrarre gli organi addominali, compresi il fegato, la cistifellea, il canale biliare comune, il duodeno e il pancreas in blocco, con i nervi e le patologie correlate.
  7. Iniettare circa 0,1 ml di lattice blu in neoprene (aggiungere una goccia di inchiostro blu a 10 ml del lattice in neoprene bianco diluito) alla cistifellea per etichettare il sistema biliare.
  8. Post-fix durante la notte con il 4% di PFA a 4 ° C per l'immunostaining completo.
    Attenzione: il PFA è tossico. Evitare di gestire direttamente PFA. PFA dovrebbe essere utilizzato in un armadio di fumo.

3. Immunohistochemistry intero-mount

Nota: Durante il protocollo, incluso durante il lavaggio, l'incubazione degli anticorpi e la colorazione, thIl campione deve rimanere sul nocciolatore, scivolando delicatamente a RT oa 4 ° C.

  1. Giorno 1: trattamento enzimatico e inattivazione di potenziali perossidasi endogena
    1. Lavare il campione preparato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT in un flaconcino di vetro adeguatamente dimensionato. Far scivolare il campione delicatamente sul nocciolatore per rimuovere il PFA. Evitare di danneggiare il campione quando si scambiano soluzioni.
    2. Per preparare l'acido ortoperiodico al 1% (v / v), sciogliere 1 g di acido orthoperiodic in 100 mL di DW.
    3. Incubare il campione in 1% di acido orthoperiodic per 20 minuti a RT per evitare qualsiasi reazione perossidasi intrinseca.
    4. Preparare il papaino 0,004% (w / v) sciogliendo 0,004 g di papava in 100 ml di tampone Tris-HCl 0,025 mol / l (pH 7,6).
    5. Lavare il campione con DW per 10 minuti a RT.
    6. Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo.
    7. Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT.
    8. Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N.
  2. 2 ° giorno: trattamento enzimatico
    1. Lavare il campione memorizzato con DW 4 volte per 1 h ciascuno a RT.
    2. Incubare il campione in papato di 0,004% preparato fresco per 2 ore a 37 ° C in un bagno a temperatura costante con un leggero dondolo.
    3. Lavare il campione con DW per 50-60 minuti a RT. Conservare il campione in 4% PFA a 4 ° CO / N.
  3. Giorno 3: trattamento congelante
    1. Lavare il campione memorizzato con DW 4x per 1 h ciascuno a RT, come sopra.
    2. Preparare rispettivamente 2,5 g, 5 g e 10 g di saccarosio in 100 ml di PBS di 0,01 M (si raccomanda il 2,5% (w / v), il 5% (w / v) e il 10% PH 7,4).
    3. Immergere il campione in 2,5% (w / v), 5% (w / v) e 10% (w / v) di saccarosio per 30 minuti ciascuno.
    4. Fermare il campione a -20 ° C per 30-60 minuti e poi scollegarlo completamente a RT; Ripetere il ciclo 3x.
    5. SuperioreRicaricare il 2% di Triton X-100 (v / v), aggiungere 2 mL di Triton X-100 a 100 mL di 0,01 M PBS (pH 7,4).
    6. Conservare il campione in 2% di Triton X-100 a 4 ° CO / N.
  4. 4 ° giorno: Incubazione primaria dell'anticorpo
    1. Preparare la soluzione di diluizione dell'anticorpo primario sciogliendo 0,2 g di albumina Bovine Serum (BSA), 0,3 ml di Triton X-100 e 0,1 g di sodio azide in 100 ml di PBS da 0,01 M (pH 7,4).
      Attenzione: l'azido di sodio è acutamente tossico. Inalazione e tocco devono essere evitati. Indossare un adeguato DPI.
    2. Diluire l'anticorpo primario (NFP) 1: 600 nel precedente tampone di diluizione (punto 3.4.1). Incubare il campione con l'anticorpo NFP a 4 ° C per 3-6 giorni, mantenendo il campione delicatamente dondolando sul nutatore. I campioni più grandi richiedono tempi di incubazione aumentati.
  5. Incubazione secondaria anticorpale
    1. Lavare il campione in PBS 4x per 1 h ciascuno a RT per rimuovere l'anticorpo primario non legato. Preparare la soluzione di diluizione per l'anticorpo secondario sciogliendo 0,2 g di BSA e 0,3 ml di Triton X-100 in 100 ml di PBS di pH 0,01 (pH 7,4).
    2. Diluire l'anticorpo secondario (perossidasi-coniugato, affinità-pecore anti-mouse IgG-HRP) 1: 600 nel tampone di diluizione (punto 3.5.2). Incubare il campione con l'anticorpo secondario a 4 ° C per 3 d, e mantenere il campione dondolando delicatamente sul nocciolo.
  6. Colorazione
    1. Preparare la soluzione di colorazione DAB con l'aggiunta di 0,002 g di 3,3'-diaminobenzidin-tetraidloruro (DAB) a 100 ml di tampone Tris-HCl (pH 7,6) di 0,05 mol / l sotto un armadio di fumo mantenendo la soluzione al buio.
    2. Lavare gli esemplari a RT in PBS 4x per 1 h ciascuno.
    3. Aggiungere 10 μl di 30% di H 2 O 2 in soluzione di colorazione DAB preparata di fresco e incubare con la soluzione a 4 ° CO / N o per 3 giorni mentre dondolando delicatamente sul nutatore.
    4. Arrestare la reazione con plaIl campione in PBS con azoto sodico al 0,04% quando viene raggiunta l'intensità di colorazione ottimale.
      NOTA: Evitare l'uso di sodio azide fino a questo passaggio, in quanto inibisce la perossidasi di rafano.
  7. Imaging del tessuto macchiato
    1. Trasferire con cura il campione su un piatto di vetro di Petri (5 cm di altezza, 10 cm di diametro) contenente PBS. Cattura immagini integrali utilizzando una fotocamera montata su uno stereomicroscopio.
      NOTA: Il tessuto macchiato interamente montato dovrebbe essere imaged mentre è immerso completamente in PBS su un piatto di vetro trasparente.

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Representative Results

Le figure da 1 a 4 mostrano risultati tipici per le fibre nervose NFP-positive nel tratto biliare extraepatico di S. murinus . L'anticorpo contro NFP riproduce etichettato l'innervazione nell'intera immagine del tratto biliare extraepatico ( Figura 1 ), della cistifellea ( Figura 2 ), del canale biliare superiore ( Figura 3 ) e dell'area della papilla duodenale ( Figura 4 ), con elevata specificità e minima sfondo.

Per tutti i tessuti del campione, indipendentemente dalla forma e dalla dimensione, i nervi tegmentali possono essere tinti contemporaneamente. Oltre all'innervazione del tratto biliare extraepatico, la densità di funzionamento e distribuzione del vagus dell'esofago e dello stomaco è stata esposta in modo non ambiguo ( Figura 1 ).

Figura 2 ).

Nel condotto biliare superiore sono stati etichettati due tipi di fasci nervosi. I fasci nervosi fini formavano una rete irregolare e densa di nervi, corse ad adesivo e risiedevano nel tratto biliare; I fasci neurali più spessi sono stati distribuiti paralleli alla superficie del tratto biliare ( Figura 3 ).

Il condotto biliare comune è stato etichettato con lattice blu neoprene e le vasi con lattice in neoprene bianco. Le fibre nervose sottili alla fine del canale biliare comune e l'area papilla duodenale sono state chiaramente dimostrate con c Ontrast ( Figura 4 ).

Figura 1
Figura 1: Fibre nervose NFP-positive nel tratto biliare, l'esofago e lo stomaco. Le frecce mostrano il vagus che corre lungo l'esofago allo stomaco. CBD, Common Bile Duct; Es, esofago; St, stomaco. Barra di scala = 1.300 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: NFP-positive fibre nervose nella cistifellea. I vasi sanguigni della cistifellea erano etichettati con lattice bianco. L'innervazione abbondante si è verificata nel collo della colecisti (frecce). Barra di scala = 1000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Fibre nervose NFP-positive nel tubo superiore. Sono stati osservati due tipi di fasci nervosi. Un tipo era i fasci nervosi fini che correvano adesivamente e si trovavano nel / nel tratto biliare extraepatico (frecce); L'altro tipo era fasci neurali più spessi distribuiti parallelamente alla superficie del tratto biliare extraepatico e correva tra la colecisti e il duodeno (triangoli). PV, Portal Vein. Barra di scala = 650 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 Figura 4: Fibre nervose NFP-positive nell'area papilla duodenale. Il canale biliare comune è stato etichettato con lattice blu e le vasi con lattice bianco (*). Le frecce mostrano l'innervazione dell'estremità del condotto biliare comune e i triangoli mostrano l'innervazione dell'area della papilla duodenale (P), proveniente dal canale biliare comune e dai vasi. Barra di scala = 1000 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo lavoro descrive la procedura sperimentale per la visualizzazione dell'innervazione del tratto biliare extraepatico usando un anticorpo contro la proteina del neurofilamento. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo descritto da Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .

Per questo esperimento, pianificare la timeline per ciascuno degli esperimenti, in quanto l'approccio di colorazione a tutto tondo continua per 2-3 settimane. La vasca contenente il tessuto deve essere ruotata in un nutatore in qualsiasi momento, tranne che durante il processo di congelamento / scongelamento. Particolarmente durante l'incubazione con gli anticorpi primari e secondari, il campione è stato impostato in una camera di stoccaggio fredda mentre ruota su un nutatore per garantire l'esposizione uniforme del campione alle soluzioni di reazione. Diverse soluzioni - 1% (w / v) acido ortoperiodico, 0,004% (w / v) papain e il tampone di diluizione per l'antibo primario / secondarioMuore - deve essere fresco per ogni esperimento. Durante il protocollo, per evitare di toccare e danneggiare il campione quando si cambiano le soluzioni, le soluzioni devono essere versate invece di essere rimosse con le pinze 15 .

Dopo il fissaggio con PFA, i campioni devono essere lavati sufficientemente con DW o PBS. Inoltre, il trattamento enzimatico con l'incubazione papaina è importante. Il calore e l'enzima usato per il recupero di antigeni aiutano a preparare il tessuto per la penetrazione di anticorpi. Per migliorare la penetrazione delle soluzioni, la membrana esterna del tessuto deve essere interrotta con un trattamento di congelamento a -20 ° C per 30 minuti o -80 ° CO / N 15 .

È importante sommare completamente il campione sperimentale in adeguati volumi di soluzione tampone per assicurare che la soluzione possa incubare l'intero campione. Il tempo di incubazione dell'anticorpo primario deve essere determinato empiricamenteD per diversi tessuti e dimensioni del campione. Di solito, deve essere di 3 giorni per un campione di 2-3 cm. La diluizione ottimale deve essere determinata empiricamente per ciascun anticorpo. Si raccomanda una diluizione a 1: 600 sia per gli anticorpi primari che per quelli secondari quando si utilizza il appropriato tampone anticorpale.

Questo lavoro descrive in dettaglio il protocollo di un approccio immunohistochemico versatile a tutto sesto per rivelare l'espressione proteica del neurofilamento nel tratto biliare di S. murinus . Questo metodo può essere utilizzato per analizzare l'innervazione di tutti gli organi viscerali in molte specie. Inoltre, questo protocollo può anche essere adattato per testare altri anticorpi neuronali, ma deve essere eseguita l'ottimizzazione degli anticorpi.

Tuttavia, la tecnica è stata limitata nell'etichettatura dei tessuti nervosi superficiali e nella costruzione di un modello tridimensionale di innervazione. Inoltre, non ha potuto identificare le caratteristiche delle fibre nervose ( cioè simpatiche o parAsintomatici, motori o sensoriali, ecc. ).

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori non hanno alcun riconoscimento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
orthoperiodic acid Wako 162-00732
papain Wako 164-00172
bovine serum albumin (BSA) Wako 010-15131
sodium azide Nacalai Tesque 312-33
neurofilament protein (NFP) antibody Dako M0762, lot 089, clone: 2F11
peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP MBL Code 330
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) Wako 349-00903
imidazole Sigma I-0125

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References

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