This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
Nitrogenoksyd (NO •) er en liten rest, som medierer flere viktige cellulære funksjoner i pattedyr, bakterier og planter. Til tross for at det finnes et stort antall metoder for å påvise NEI • in vivo og in vitro, er den sanntids overvåking av NO • ved encellede nivå svært utfordrende. De fysiologiske eller patologiske effekter av NO • bestemmes av den faktiske konsentrasjon og holdetid av denne radikale. Følgelig er metoder som tillater den encellede deteksjon av NO • er svært ønskelig. Nylig har ekspandert vi pallen ifølge NO • indikatorer ved å innføre ett fluorescerende protein-baserte genetisk kodet nitrogenoksid (NO) • sonder (geNOps) som direkte svare til cellulære NO • svingninger og dermed løser dette behovet. Her viser vi bruken av geNOps å vurdere intracellulære NO • signaler som reaksjon på to forskjellige kjemiske NO • -liberating molekyler. Våre resultater also bekrefter at nyfremstilt 3- (2-hydroksy-1-metyl-2-nitrosohydrazino) -N-metyl-1-propanamin (NOC-7) har en mye høyere potensial til å fremkalle forandring i de intracellulære NO • nivåer sammenliknet med den uorganisk NEI • donor natriumnitroferricyanid (SNP). Videre ble dual-color levende celle bildebehandling ved hjelp av de grønne geNOps (G-geNOp) og kjemisk Ca 2+ indikator Fura-2 utført for å visualisere stram regulering av Ca 2+ -avhengige NEI • dannelse i enkelt endotelceller. Disse representative eksperimenter viser at geNOps er egnet verktøy for å undersøke sanntid generasjon og nedbrytning av encellede NO • signaler i ulike forsøksoppsett.
Vi har nylig utviklet en ny klasse av genetisk kodet fluorescerende NO • sonder, kalt geNOps 1. Disse sensorene består av en enkelt bygget, bakterieavledet, NO • bindende domene 2, som er konjugert til en distinkt fluorescerende protein (FP) variant 3 (cyan, grønt eller orange FP). NEI • binding til den ikke-heme jern (II) senter 4 innenfor de geNOps reduserer vendte fluorescensintensiteten 1. Viktigere, gjenvinner geNOps fluorescens raskt og fullt når intracellulære NO • nivåer avta en. Følgelig geNOps tillate sanntid avbildning av (sub) cellulære NO • svingninger. Selv om NEI • sensing mekanisme geNOps fortsatt uklare så langt, har de vist seg å være gode NO • journalister, og dermed har styrken til å åpne opp en ny æra av polykromatisk, kvantitativ NEI • bioimaging med høy romlig og tidsmessige vedtak 1, 5. Andre tilgjengelige fluorescerende NO • prober er basert på små kjemiske forbindelser, som trenger å bli lastet inn i cellene, og blir irreversibelt endret av NO • 6. Andre ulemper ved INGEN • sensitive små fluorophores er deres potensial cytotoksisitet og relativt lav spesifisitet som gjør det vanskelig å bruke dem i en pålitelig, analytisk og avgjørende måte 7, 8, 9. Selv om effektiv bruk av genetisk kodet fluorescerende prober krever effektiv genoverføring teknikker, har FP-baserte genetisk kodet sensorer dukket opp som uunnværlig verktøy som har revolusjonert vår forståelse av den indre funksjon av celler 10, 11. Før utviklingen av de enkelte FP-baserte geNOps, et Förster resonans energioverføring (FRET) -baserte NO • sensor, referert til som NOA-1-12, ble konstruert. Sato et al. designet denne sofistikerte sonde som består av to subenheter av NO • -sensitive løselig guanylatsyklase (SGC), begge konjugert å slite-baserte sensorer som rapporterer syklisk guanosinmonofosfat (cGMP) nivåer 12. Ettersom dette sonde reagerer cGMP, det bare indirekte registrerer intracellulære NO • svingninger 12. Selv om NOA-en reagerer NO • forhøyninger i nano-molar serien, har dette verktøyet ikke blitt brukt ofte så langt, sannsynligvis på grunn av begrensninger med hensyn til tilgjengelighet og gjennomførbarhet av denne voluminøse todelte sensor.
Allsidige funksjoner av NO •, som slag fundamental biologiske prosesser har blitt godt karakterisert 13, 14. Mange studier viste at NO-konsentrasjonen •n innenfor celler og underdomener bestemmer celle skjebne i helse og sykdommer 14, 15, 16. I pattedyr, NO • hovedsak generert enzymatisk i ulike celletyper med godt karakterisert nitrogenoksid syntase (NOS) familie 17. Så langt har tre isoformer av NOS blitt beskrevet 18, 19, 20; disse er Ca2 + / kalmodulin-avhengig endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 og neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, og Ca2 + / kalmodulin-uavhengig konstitutivt aktiv induserbar NOS (iNOS eller GB-PS 2) 20. Videre har eksistensen av mitokondriell NOS (mtNOS) også blitt foreslått 21. Imidlertid er mtNOS betraktes som en spleisevariant av nNOS, og er derfor ikke klassifisert separat som en isoform 21. En annen isoform, bortsett fra de i pattedyrceller, er den såkalte bakterie NOS (bNOS), hovedsakelig i gram-positive bakterier 22. Den enzymatiske produksjon av NO • er sterkt kontrollert og er avhengig av tilgjengeligheten av flere kofaktorer slik som nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADPH), flavin-adenin-dinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylært oksygen og L-arginin 17. Den kationiske aminosyren L-arginin er det substrat som omdannes til L-citrullin ved NEI • produksjon 17. I tillegg til den svært regulert enzymatisk generering av NO • er det blitt postulert at radikalet kan reduseres ikke-enzymatisk fra nitritt bassenger av mitokondrier i henhold hypoksiske betingelser 23. Når NO • blir produsert i en celle, kan den fritt diffundere gjennom biomembraner 14,ref "> 15. Men den meget korte halveringstiden til dette radikal er i hovedsak bestemt av de miljømessige forhold, og forskjellige reaksjonsveier og kjemiske reaksjoner effektivt nedbryter NO • nivåer 24. Til slutt, dannelse, diffusjon, og degradering av NO • avhenger på forskjellige miljøparametere som bestemmer den effektive konsentrasjonen av de høyt biologisk aktivt molekyl 24.
Den geNOps teknologien tillater direkte påvisning av (sub) cellulær NEI • svingninger 1 og er derfor egnet til å granske, og nylig oppdage mekanismene som er ansvarlig for oppbygging og nedbryting av cellulære NO • signaler. Her gir vi enkle protokoller og representative resultater for bruk av geNOps å visualisere eksogent fremkalt og endogent generert NO • profiler, på nivået av individuelle celler. Dessuten kan geNOps teknologien tilpasses for apgrammet i andre celle modellsystemer for å studere de komplekse mønstre av NO • dannelse, diffusjon, og degradering i respons til forskjellige stimuli cellulære og påkjenninger.
Siden oppdagelsen av NO • som en viktig signalmolekyl i biologi 28, har den spesifikke sanntidsmåling av resten i enkeltceller, vev og hele dyr med høy oppløsning i en gjennomførbar og pålitelig måte blitt håpet. Her rapporterer vi bruk av nyutviklede genetisk kodet fluorescerende NO • prober (geNOps) som gjør det mulig eksakt live-cell imaging av NO • signaler ved hjelp av bredt felt fluorescens mikros en.
For å omgå forseggjort og invasive transfeksjonsteknologier prosedyrer HEK celle klone som stabilt uttrykker grønt fluorescerende G-geNOp ble brukt til å kvantifisere eksogent generert encellede NO • profiler. Som HEK-celler som normalt ikke produserer NO • endogent 29, er denne celletype som er egnet for generering av et geNOp-baserte sensor cellelinje, som kan være nyttig for mange andre anvendelser i ko-kulturbetingelsermed NEI • produserende primære celler eller selv i levende dyr 30. Men i denne studien viser at det er kapasitet av forskjellige NO • -liberating forbindelser, forskjellige konsentrasjoner og stabiliteter, for å fremkalle intracellulære NO • signaler ved hjelp av G-geNOp uttrykkende HEK cellemodell. Våre data viste at ingen • -donor konsentrasjon, kvalitet og fremgangsmåte for anvendelse til slutt bestemme mønstre av intracellulære NO • profiler. Slik informasjon er uunnværlig for den in situ farmakokinetiske karakterisering av forskjellige NO • givere, som er indikativ for en rekke sykdommer. Spesielt geNOps har vist seg å stabilt svare på flere gjentatte anvendelser av NO • -donor pulser over svært lang tid en. Følgelig eksperimenter med NEI • -liberating forbindelser presentert her, tillater semi-kvantitative konklusjoner om de ulike amplituder og kinetikk respektive mobil NO226; signaler (figurene 1 og 2).
Selv om stabilt uttrykkende HEK-celleklon sannsynligvis stammer fra en enkelt celle ble en bred heterogenitet av G-geNOps ekspresjonsnivåer observert (figur 1). Det er et felles trekk ved stabile cellekloner som transkripsjonen av (genomet integrert) genet er under kontroll av flere faktorer, slik som forskjellige miljømessige påkjenninger 31 som påvirker cellevekstrater 32, og cellesyklusstatus 33. De enkle FP-baserte geNOps er ikke-ratiometrisk prober og, følgelig, NO •-indusert tap av fluorescens intensitet øker med geNOp ekspresjonsnivået 1. Følgelig er normalisering av signalene geNOps vesentlig for kvantifisering av cellulære NO • signaler særlig i tilfelle av en komparativ analyse. Som vist i vår siste undersøkelse, en streng lineær korrelasjon between basal fluorescensintensiteten av geNOps og styrken av NO • -indusert fluorescensslukking over et bredt område av fluorescensintensiteter er funnet en. Dette er en viktig funksjon i geNOps for absolutt kvantifisering av cellulære NO • signaler. Som vist i figur 1, normalisering av G-geNOps signaler som reaksjon på NOC-7 og SNP viste homogene NO • signaler i forskjellige HEK-celler fra den samme plate, noe som indikerer at HEK-cellene ikke er variert med hensyn til deres evne til å ta opp og forringe NEI • radikal som stammer fra NEI • donor. I motsetning til ved hjelp geNOps i HeLa-celler viste klare hetrogeniteter av cellulære NO • signaler mellom ulike celler som respons på NOC-7. Disse forskjellene peker på celletypespesifikke NO • metabolisme og nedbrytnings priser, noe som kan ha flere konsekvenser i cellefysiologi og patologi, og kan avdekkes ved hjelp av geNOps teknologi.
Likevel, to viktige funksjoner i geNOps må vurderes nøye for riktig bruk av sensorer og data tolkninger: i) geNOps krever tilstrekkelig jern (II) for å fullt ut svare på NEI • 1 og ii) avhengig av FP variant, kan geNOps være pH sensitive 1. Her beskriver vi en protokoll som er blitt funnet å være egnet for den ikke-toksisk jern (II) supplering av geNOps, som uttrykkes i enten HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se Protocol 2,6). Mens det har blitt vist at cellen behandling med jern (II) / vitamin C påvirket ikke cellemorfologi, celle-levedyktighet og metabolsk aktivitet av celler 1, kan det være nødvendig å optimalisere denne viktig skritt for andre celletyper og vev. Men i noen eksperimentelle betingelser, kan kravet til jern (II) lasting begrenser anvendeligheten av geNOps. Spesielt, har det vist seg at askorbat kan redusere NO • 35 og askorbat-jern (II) komplekser er i stand til å skatte NEI • 36, 37. Videre kan overskudd av jern (II) og askorbat induserer inflammatoriske responser 39 og frakople eNOS 41. Slike effekter må vurderes når du bruker geNOps teknologi. Det har vist seg at under visse eksperimentelle betingelser, blir den intracellulære pH-verdien påvirkes i betydelig grad 34, som har potensialet til å påvirke geNOps fluorescens 1. Spesielt, cyan og grønne geNOps variantene er relativt pH sensitive viser en nedgang på fluorescens ved forsuring en. Derfor kan akutte endringer av (sub) cellulær pH simulere falske Nei • signaler ved bruk av pH-følsomme geNOps. Som antydet i vårt tidligere arbeid, parallell bruk av NO • ufølsomme geNOps (geNOps mut) som negativ controls anbefales å dissekere ekte mobil NEI • signal fra pH endrer en. I tillegg cellulær pH-endringer kan inspiseres ved hjelp av pH-sonder som Sypher 34.
Videre visualisert vi den endogene enzymatiske NO • formasjon som reaksjon på en fysiologisk Ca2 + -mobilizing agonist i endotelcelle surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellelinje er en hyppig brukt modellsystem konsekvent uttrykke eNOS 38. Bruk av geNOps forbigående uttrykt i EA.hy926 celler, bekreftet at IP 3-formidlet Ca 2+ signaler fremkalle dyp NEI • formasjon i denne celletype, som ble nesten helt blokkert av L-NNA. For å timelig korrelere Ca 2+ med NO • signaler, ble G-geNOp-uttrykkende celler lastet med UV-hissige kjemisk Ca 2+ -indicator Fura-2 / am. Den spektrale adskillelse av Ca 2 + bundet og ubundet fura-2-fluo rescence fra G-geNOp signal lett kan oppnås med kommersielt tilgjengelige filter setter 40. Imaging begge prober avduket at Ca 2+ -triggered enzymatisk NEI • dannelse skjer mye tregere i forhold til cytosoliske Ca 2+ økningen i denne endothelial celletype. Lignende kinetikken av encellede NO • signaler i endotelceller fra bovin lunge-arterien ved celle behandling med IP-3 -generating agonist bradykinin, samt skjærspenninger har vært rapportert ved bruk av NOA-1, en indirekte høyt NEI • -sensitive sensor 12 . Følgelig er disse data understreker at Ca 2+ -evoked eNOS-avledede NO • formasjon krever en viss starttid før full enzymatisk aktivitet er nådd. Selv om kinetikken ved cellulær NO • dannelse, spredning og degradering kan ekstraheres fra andre data, for eksempel strekkbaserte målinger av NO • -indusert kar avkoblingss = "xref"> 26, den store fordelen med fluorescerende Nei • prober er at de direkte konvertere cellulære NO • svingninger i synlige signaler i sanntid. Derfor bildebehandling mobil Nei • signaler med geNOps gir høy romlig og tidsmessig oppløsning, og tilbyr unike muligheter i (re) undersøker (sub) cellulær NEI • homeostase. For eksempel, tenkelig eNOS skyt 42 i kombinasjon med geNOps teknologi i enkle endotelceller kan være egnet for å korrelere ferd med den subcellulære lokalisering og translokasjon av den NEI • produserende enzym eller andre relevante proteiner slik som kalmodulin og caveolin 43 NEI •.
Her beskriver vi praktisk anvendelse av G-geNOp uttrykke HEK og EA.hy926 celler til å visualisere eksogent og endogent generert cellulære NO • signaler på enkeltcellenivå og i sanntid på en vanlig bredt felt fluorescens microscope. Våre data antyder at geNOps er egnet til å spesifikt spore (sub) cellulære NO • dynamikk under ulike eksperimentelle forhold ved hjelp av alle slags interessante celletyper.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |