Atomic Force Microscopy Undersøgelser af DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Atomisk kraftmikroskopi (AFM) er en kraftfuld teknik til analyse af protein-DNA-interaktioner 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det kræver kun lave mængder prøveemne til direkte at visualisere heterogene prøver med en opløsning på det enkelte molekylniveau. Heterogenitet kan skyldes forskellige konformationelle eller oligomere tilstande af et protein. Specielt kan proteinkomplekser i forbindelse med protein-DNA-prøver vise forskellige støkiometrier og / eller konformationer induceret ved DNA-binding i almindelighed eller binding til et specifikt målsted inden for DNA. Heterogene prøver kan også indeholde to (eller flere) forskellige slags proteiner og forskellige proteinkomplekserFormer ( fx bestående af kun én type protein versus heteromere komplekser) kan interagere forskelligt med DNA. De undersøgelser, der diskuteres her, udnytter AFM-billeddannelse i luft på statiske, tørrede prøver af DNA-reparationsproteiner bundet til lange (~ 900 basepar, bp) DNA-fragmenter, der indeholder en læsion, hvilket repræsenterer et mål for disse proteiner. Den høje molekylære opløsning af AFM tillader sondringen mellem forskellige typer af proteinkomplekser og for at bestemme bindingspositionerne af proteinerne på DNA-fragmenterne. Det er vigtigt, at læsionerne indføres i DNA-substraterne på veldefinerede positioner. Fordi positionen af læsionsstedet i DNA'et er kendt, giver distributionerne af proteiner bundet til DNA indsigt i (forskellige) læsionsgenkendelsesegenskaber af (forskellige) proteinkomplekser, fx hvor godt de genkender en bestemt type læsion (sammenlignet med Til ikke-beskadiget DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Deres positioner på DNA'et tillader også sondringen mellem proteinkomplekser bundet specifikt ved læsionerne og komplekserne bundet uspecifikt andetsteds på DNA'et. Separat karakterisering af disse forskellige komplekse typer (komplekser bundet specifikt til læsionen versus uspecifikke komplekser) kan afsløre potentielle konformationsændringer i komplekserne induceret ved målstedidentifikation.
DNA-reparationsproteinerne fokuseret på her er helicaser, der er ansvarlige for læsionsgenkendelse i nukleotid-excisionsreparationen (NER) -vejen. I bakterier opnås NER ved proteinerne UvrA, UvrB og UvrC. UvrA er ansvarlig for indledende læsionsføler i et UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskompleks. Ved læsionsverifikation af UvrB omdanner dette kompleks til monomerisk UvrB bundet på læsionsstedet, og dette specifikke kompleks kan derefter rekruttere pRokaryotisk NER endonuclease UvrC. UvrC udskiller en kort (12-13 nt) strækning af enkeltstrenget DNA (ssDNA) indeholdende læsionen. Den manglende strækning bliver derefter genopfyldt af DNA-polymerase. Endelig forsegler DNA-ligase den nyligt syntetiserede strækning med det originale DNA 9 , 10 . I eukaryoter er de fleste proteiner fra NER-kaskaden en del af det store multimeriske transkriptionsfaktor IIH (TFIIH) kompleks. Efter indledende læsionssensor via det trimeriske CEN2-XPC-HR23B-kompleks rekrutteres TFIIH til DNA-målstedet. Når XPD i komplekset verificerer tilstedeværelsen af en NER mållæsion, rekrutteres de eukaryote NER endonukleaser XPG og XPF til at punkere en kort (24-32 nt) strækning af ssDNA indeholdende læsionen 9 , 10 . Her blev specifikt undersøgt helikaserne UvrB og XPD fra henholdsvis prokaryotisk og eukaryotisk NER. Disse helikaser kræver en uparget region iDNA (en DNA-boble) til tråd på en af de to DNA-enkeltstrenger og efterfølgende at omplacere langs denne streng brændt af ATP-hydrolyse. Ud over DNA-læsionerne blev der således introduceret en DNA-boble i substraterne, der fungerer som ladningssted for proteinerne.
Fremgangsmåden til fremstilling af specifikke lesions-DNA-substrater er blevet beskrevet tidligere 11 . Det kræver en cirkulær DNA-konstruktion (plasmid) med to tæt adskilte restriktionssteder for en nickase. I forbindelse med denne undersøgelse blev plasmidet pUC19N (2729 bp) anvendt (skabt af S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Dette plasmid indeholder tre tæt adskilte restriktionssteder for nickase Nt.BstNBI, der rammer en 48 nukleotid (nt) strækning. Efter inkubation med nickasen kan strækningen af ssDNA mellem disse steder fjernes og erstattes af et oligonukleotid indeholdende et hvilket som helst target-træk. Efter hvert trin testes fuldstændig enzymatisk fordøjelse via agarosegelelektroforese. Nikkel-cirkulært DNA kan skelnes på grund af dets lavere elektroforetiske mobilitet sammenlignet med det oprindelige supercoulerede plasmid. Gapping af DNA'et og udskiftning af den fjernede strækning med det specifikke substratoligonukleotid kan evalueres via fordøjelse med et restriktionsenzym, som udelukker substratet udelukkende inden for området mellem nicks. Linearisering af det cirkulære plasmid af enzymet vil således blive undertrykt for gapped DNA og genoprettet efter indsættelse af det specifikke oligonukleotid. Endelig tillader to endonuklease restriktionssteder (ideelt single cutters) genereringen af et lineært DNA-substrat med længde som ønsket og med det specifikke målsted i en defineret position såvel som en DNA-boble i en afstand fra læsionen, enten i 5 'Eller 3' retning.
Anerkendelse af læsionerne ved hjælp af NER-helicaser kan undersøges via AFM-billeddannelse. Stalled DNA-translokation af helicaserne ved tHans læsionssted er synligt som en top i proteinpositionsfordelingen på DNA'et og indikerer læsionsgenkendelse. Fordi DNA-translokation af disse helicaser desuden er retningsbestemt, med 5'-til-3'-polaritet angiver afhængigheden af læsionsgenkendelse på positionen af læsningsstedet (DNA-boblen opstrøms eller nedstrøms for læsionen) også, om læsionen fortrinsvis er genkendt På den translokerede eller på den modsatte ikke-translokerede ssDNA-streng 5 , 9 . I de følgende afsnit vil de anvendte metoder blive introduceret og væsentlige resultater fra disse eksperimenter vil kort diskuteres. Det er vigtigt, at analogt med det eksemplariske arbejde med DNA-reparation vist her, kan AFM-billeddannelse anvendes til undersøgelsen af forskellige DNA-interagerende systemer, såsom DNA-replikation eller transkription 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM statistiske analyser af bindingspositioner af proteiner på lange DNA-fragmenter, der indeholder specifikke målsteder, kan afsløre interessante detaljer om de specifikke strategier, der anvendes af proteinet til at genkende disse steder 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For at fortolke de resulterende positionsfordelinger skal positionerne af målene i DNA'et væ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD-holdige oligonukleotider og p44 blev venligt tilvejebragt af henholdsvis Samuel Wilson, Korbinian Heil og Thomas Carell og Gudrun Michels og Caroline Kisker. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 og TE-671/4 til IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
