Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), protein-DNA etkileşimlerinin analizi için güçlü bir tekniktir 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Tek molekül düzeyinde bir çözünürlükle heterojen örnekleri doğrudan görselleştirmek için yalnızca düşük miktarda numune malzemesi gerekir. Heterojenlik, bir proteinin farklı konformasyonel veya oligomerik durumlarından kaynaklanabilir. Özellikle, protein-DNA örnekleri bağlamında, protein kompleksleri genel olarak DNA bağlanması veya DNA içindeki spesifik bir hedef bölgeye bağlanma ile uyarılan farklı stoikiometri ve / veya konformasyonlar gösterebilir. Heterojen numuneler ayrıca iki (veya daha fazla) farklı protein türü ve farklı protein kompleksi içerebilirFormlar ( örn . Heteromerik komplekslere karşı yalnızca bir protein türünü kapsar) DNA ile farklı etkileşime girebilirler. Burada tartışılan çalışmalar, bu proteinlerin bir hedefini temsil eden bir lezyon içeren uzun (~ 900 baz çiftli, bp) DNA fragmanlarına bağlı DNA onarım proteinlerinin statik, kurutulmuş örnekleri üzerindeki havadaki AFM görüntülemesini kullanmaktadır. AFM'nin yüksek, moleküler çözünürlüğü, farklı protein kompleksleri türleri arasında ayrım yapmayı ve proteinlerin DNA fragmanları üzerindeki bağlanma yerlerini belirlemeyi sağlar. Önemli olan, lezyonlar, DNA substratlarına iyi tanımlanmış pozisyonlarda eklenir. DNA'daki lezyon yerinin konumu bilindiğinden, DNA'ya bağlı olan proteinlerin dağılımı, (farklı) protein komplekslerinin (farklı) lezyon tanıma özelliklerine, örneğin belirli bir lezyon tipini ne kadar iyi tanıdıklarını (karşılaştırıldığında) Hasar görmemiş DNA'ya) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . DNA'daki pozisyonları ayrıca lezyonlara spesifik olarak bağlanan protein kompleksleri ile DNA'nın başka yerlerinde spesifik olmayan şekilde bağlanmış olan kompleksler arasındaki ayrımı da mümkün kılar. Bu farklı karmaşık türlerin (lezyona spesifik olmayan komplekslere spesifik olarak bağlanan kompleksler) ayrı karakterizasyonu, hedef bölge tanımlamasında indüklenen komplekslerde potansiyel konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkarabilir.
Burada odaklanan DNA tamir proteinleri, nükleotid eksizyon tamiri (NER) yolunda lezyonun tanınmasından sorumlu helikazlardır. Bakterilerde NER, UvrA, UvrB ve UvrC proteinleriyle elde edilir. UvrA, bir UvaA 2 / UvrB 2 DNA tarama kompleksinde başlangıç lezyon algılamasından sorumludur. UvrB lezyon doğrulamasının ardından bu kompleks, lezyon yerinde bağlı monomerik UvrB'ye dönüşür ve bu spesifik kompleks pRokaryotik NER endonükleaz UvrC. UvrC, lezyonu içeren kısa (12-13 nt) bir tek sarmallı DNA (ssDNA) uzatır. Eksik streç daha sonra DNA polimeraz ile doldurulur. Son olarak, DNA ligazı yeni sentezlenmiş gerdirmeyi orijinal DNA 9 , 10 ile sızdırmaz hale getirir. Ökaryotlarda, NER basamaklarının çoğunun proteinleri büyük, multimerik transkripsiyon faktörü II H (TFIIH) kompleksinin bir parçasıdır. Trimerik CEN2-XPC-HR23B kompleksi yoluyla ilk lezyon algılamasından sonra, TFIIH DNA hedef bölgeye yönlendirilir. Kompleks içindeki XPD, bir NER hedef lezyon varlığını doğruladığında, ökaryot NER endonükleazlar XPG ve XPF, lezyon 9 , 10 içeren kısa (24-32 nt) bir ssDNA serisini tüketmek üzere görevlendirilir. Burada, özellikle sırasıyla prokaryotik ve ökaryotik NER'den gelen UvrB ve XPD helikazları incelenmiştir. Bu helikazlar, eşleştirilmemiş bir bölge gerektirir.DNA (bir DNA kabarcığı) iki DNA tek sarmalından birine bağlanıp daha sonra ATP hidroliziyle beslenen bu sarmal boyunca yer değiştirir. DNA lezyonlarına ilaveten, proteinler için yükleme yeri olarak işlev gören substratlara bir DNA kabarcığı ilave edildi.
Spesifik lezyon DNA substratlarının hazırlanması prosedürü daha önce 11 açıklanmıştır. Bir lümen için iki birbirine yakın aralıklı kısıtlama bölgeleri olan dairesel bir DNA yapısı (plazmid) gerektirir. Bu çalışma bağlamında plazmid pUC19N (2729 bp) kullanıldı (S. Wilson laboratuarı, NIEHS tarafından hazırlandı). Bu plazmit, 48 nükleotit (nt) bir gerilimi çerçeve içine alan Nt.BstNBI nickazı için birbirine yakın mesafeli üç sınırlama bölgesi içerir. Lipaz ile inkübe edildikten sonra, bu alanlar arasındaki ssDNA'nın uzantısı uzaklaştırılabilir ve herhangi bir hedef özelliği içeren bir oligonükleotid ile değiştirilebilir. Her adımdan sonra, enzimatik sindirim, agaroz jeliElektroforez. Yuvarlak dairesel DNA, orijinal süper-sargılı plazmid ile karşılaştırıldığında daha düşük elektroforetik hareketliliğinden dolayı ayırdedilebilir. DNA'nın boşluk bırakılması ve çıkarılan gerilmenin spesifik alt tabaka oligonükleotidiyle değiştirilmesi, alt tabakayı münhasıran çentikler arasındaki bölgede kesen bir kısıtlama enzimi ile sindirim yoluyla değerlendirilebilir. Dolayısıyla, dairesel plazmitin enzim tarafından doğrusallaştırılması, çakıştırılmış DNA için bastırılacak ve spesifik oligonükleotidin eklenmesinden sonra restore edilecektir. Son olarak, iki endonükleaz sınırlama alanı (ideal olarak tek kesiciler), arzu edilen uzunlukta ve belirlenmiş bir konumda spesifik hedef alanı ve aynı zamanda lezyondan belirli bir mesafede bulunan bir DNA kabarcık ile, doğrusal bir DNA substratının oluşturulmasına izin verir. 'Veya 3' yönünde.
Lezyonların NER helikazları tarafından tanınması AFM görüntüleme yoluyla araştırılabilir. Tepedeki helikazların duraklatılmış DNA translokasyonuLezyon bölgesi, DNA üzerindeki protein pozisyon dağılımında zirve olarak görünür ve lezyon tanımayı gösterir. Bu helikazların DNA translokasyonu ayrıca yönlü, 5'-3 'polarite ile lezyon tanımanın yükleme yerine (DNA kabarcık yukarı akış veya lezyonun aşağısında) bağımlılığı da lezyonun öncelikli olarak tanınıp onaylanmadığını gösterir Translokasyona uğratılmış veya tersine, translokasyona uğramamış ssDNA iplikçikleri 5 , 9 . Sonraki bölümlerde, kullanılan yöntemler tanıtılacak ve bu deneylerden elde edilen önemli bulgular kısaca tartışılacaktır. Önemli olarak, burada gösterilen DNA tamiri ile ilgili örnek çalışmalara benzeyen AFM görüntüleme, DNA replikasyonu veya transkripsiyon 8 , 12 , 13 , 14 gibi farklı DNA etkileşen sistemlerin çalışmasına uygulanabilir </> Sup.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirli hedef alanları içeren uzun DNA fragmanları üzerindeki proteinlerin bağlanma pozisyonlarının AFM istatistiksel analizleri, proteinin bu siteleri tanıması için kullanılan stratejilere ilginç ayrıntılar 2 , 3 , 4 , 5 , 6 gösterebilir. Ortaya çıkan konum dağılımlarını yorumlamak için DNA'daki hedeflerin pozisyonları tam olarak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD içeren oligonükleotidler ve p44 sırasıyla Samuel Wilson, Korbinian Heil ve Thomas Carell, ve Gudrun Michels ve Caroline Kisker tarafından nazikçe sağlandı. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 ve TE-671 / 4'ten BT'ye hibelerle desteklendi.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
