Summary

Atomic Force Microscopy Undersøkelser av DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

Published: May 24, 2017
doi:

Summary

Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.

Abstract

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.

Introduction

Atomisk kraftmikroskopi (AFM) er en kraftig teknikk for analyse av protein-DNA-interaksjoner 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det krever bare lave mengder prøveemne for direkte å visualisere heterogene prøver med en oppløsning på enkeltmolekylnivå. Heterogenitet kan skyldes forskjellige konformasjonelle eller oligomere tilstander i et protein. Spesielt kan proteinkompleksene i sammenheng med protein-DNA-prøver vise forskjellige støkiometrier og / eller konformasjoner indusert ved DNA-binding generelt eller bindende til et spesifikt målsted i DNA. Heterogene prøver kan også inneholde to (eller flere) forskjellige typer proteiner og forskjellige proteinkomplekserFormer ( f.eks . Som består av bare én type protein versus heteromere komplekser) kan interagere forskjellig med DNA. Studiene som diskuteres her, utnytter AFM-bildebehandling i luft på statiske, tørkede prøver av DNA-reparasjonsproteiner bundet til lange (~ 900 basepar, bp) DNA-fragmenter som inneholder en lesjon, som representerer et mål for disse proteinene. Den høye molekylære oppløsningen av AFM tillater forskjellen mellom forskjellige typer proteinkomplekser og å bestemme bindingsposisjonene av proteiner på DNA-fragmentene. Viktig er at lesjonene blir introdusert i DNA-substratene ved veldefinerte posisjoner. Fordi plasseringen av lesjonsstedet i DNA er kjent, gir fordelingen av proteiner bundet til DNA innsikt i (forskjellige) lesjonsgenkjenningsegenskaper av (forskjellige) proteinkompleksene, f.eks . Hvor godt de kjenner igjen en bestemt type lesjon (sammenlignet med Til ikke-skadet DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Deres posisjoner på DNA lar også skillet mellom proteinkomplekser bundet spesifikt til lesjonene og kompleksene bundet uspesifikt andre steder på DNA'et. Separat karakterisering av disse forskjellige komplekse typer (komplekser bundet spesifikt til lesjonen mot ikke-spesifikke komplekser) kan avsløre potensielle konformasjonsendringer i kompleksene indusert ved målstedidentifikasjon.

DNA-reparasjonsproteiner som er fokusert på her er helikaser som er ansvarlige for lesjonsgenkjenning i nukleotid-eksplisjonsreparasjonen (NER) -banen. I bakterier oppnås NER ved proteinene UvrA, UvrB og UvrC. UvrA er ansvarlig for innledende lesjonssensing i et UvaA 2 / UvrB 2 DNA-skanningskompleks. Ved lesjon verifisering av UvrB konverterer dette komplekset til monomer UvrB bundet på lesionsstedet, og dette bestemte komplekset kan deretter rekruttere pRokaryotisk NER endonuklease UvrC. UvrC aksepterer en kort (12-13 nt) strekning av enkeltstrenget DNA (ssDNA) som inneholder lesjonen. Den manglende strekk blir deretter påfyllt av DNA-polymerase. Endelig forsegler DNA-ligase den nylig syntetiserte strekk med det opprinnelige DNA 9 , 10 . I eukaryoter er de fleste proteiner i NER-kaskaden en del av det store multimeriske transkripsjonsfaktor II H (TFIIH) komplekset. Etter innledende lesjonsavkjenning via det trimeriske CEN2-XPC-HR23B-komplekset rekrutteres TFIIH til DNA-målstedet. Når XPD i komplekset verifiserer tilstedeværelsen av en NER-mållesjon, rekrutteres de eukaryote NER endonukleaser XPG og XPF for å aksessere en kort (24-32 nt) strekning av ssDNA som inneholder lesjonen 9 , 10 . Her ble spesielt undersøkt helikasene UvrB og XPD fra henholdsvis prokaryotisk og eukaryotisk NER. Disse helikasene krever en uparret region iDNA (en DNA-boble) for å tråkke på en av de to DNA-enkeltstrengene og deretter translokere langs denne strengen drevet av ATP-hydrolyse. I tillegg til DNA-lesjonene ble en DNA-boble introdusert i substratene som fungerer som lastingssted for proteinene.

Fremgangsmåten for fremstilling av spesifikke lesjon-DNA-substrater er blitt beskrevet tidligere 11 . Det krever en sirkulær DNA-konstruksjon (plasmid) med to tett avskilt restriksjonsseter for en nikase. I sammenheng med denne studien ble plasmidet pUC19N (2729 bp) brukt (opprettet av S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Dette plasmidet inneholder tre nært avsatte restriksjonssteder for nikase Nt.BstNBI som rammer en strekning på 48 nukleotid (nt). Etter inkubering med nikasen kan strekningen av ssDNA mellom disse stedene fjernes og erstattes av et oligonukleotid som inneholder hvilken som helst målfunksjon. Etter hvert trinn testes komplett enzymatisk fordøyelse via agarosegelelektroforese. Nikket sirkulært DNA kan skelnes på grunn av sin lavere elektroforetiske mobilitet sammenlignet med det opprinnelige supercoiled plasmidet. Gapping av DNA og erstatning av den fjernede strekk av det spesifikke substratoligonukleotidet kan evalueres via fordøyelse med et restriksjonsenzym som inkludere substratet utelukkende innenfor regionen mellom nicks. Linearisering av det sirkulære plasmidet av enzymet vil følgelig bli undertrykt for gapped DNA og gjenopprettet etter innsetting av det spesifikke oligonukleotid. Endelig tillater to endonuklease restriksjonssteder (ideelt single cutters) genereringen av et lineært DNA-substrat, med lengde som ønsket og med det spesifikke målstedet i en definert posisjon, så vel som en DNA-boble i en avstand fra lesjonen enten i 5 'Eller 3' retning.

Anerkjennelse av lesjonene ved NER-helikasene kan undersøkes via AFM-bildebehandling. Stalled DNA-translokasjon av helikasene ved tHan lesionssted er synlig som en topp i proteinposisjonsfordelingen på DNA og indikerer lesjonsgenkjenning. Fordi DNA-translokasjon av disse helikasene er videre retningsbestemt, med 5'-til-3'-polaritet, indikerer avhengigheten av lesjonsgenkjenning på posisjonen til lastingsstedet (DNA-boblen oppstrøms eller nedstrøms fra lesjonen) også om lesjonen er fortrinnsvis gjenkjent På den translokaterte eller på motsatt, ikke-translokulerte ssDNA-streng 5 , 9 . I de følgende avsnittene vil de brukte metodene bli introdusert, og store funn fra disse forsøkene vil bli kort diskutert. Viktig, analogt med det eksemplariske arbeidet med DNA-reparasjon vist her, kan AFM-bildebehandling påføres studier av forskjellige DNA-interaksjonssystemer, slik som DNA-replikasjon eller transkripsjon 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.

Protocol

1. Prøveforberedelse Fremstilling av DNA-substratene 11 Genererer et ssDNA gap i plasmidet Fullstendig fordøye en prøve av plasmidet (her: modifisert pUC19, pUC19N) i et reaksjonsrør med en passende nikase (her: Nt.BstNBI) etterfulgt av enzymvarmeinaktivering ved bruk av betingelser i henhold til produsentens protokoll (se figur 1 for en skjematisk presentasjon). Start med ~ 50 μl og ~ 500 nM plasmid for et tilstrekkelig utbytte. Verifi…

Representative Results

Å skille mellom forskjellige komplekse typer basert på proteinkompleksvolumer Helikaseaktiviteten til den prokaryote NER-helikase UvrB stimuleres ved DNA-binding 22 , 23 . UvrB krever en uparret region i DNA (en DNA-boble) for å laste riktig på en av de to enkelt ssDNA-strengene. In vivo er denne DNA-strukturen tilveiebrakt ved DNA-interaksjoner gjennom et an…

Discussion

AFM statistiske analyser av bindingsposisjoner av proteiner på lange DNA-fragmenter som inneholder spesifikke målsteder, kan avsløre interessante detaljer om de spesifikke strategiene som brukes av proteinet for å gjenkjenne disse nettstedene 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For å tolke de resulterende stillingsfordelingene må posisjonene til målene i DNA være nø…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PUC19N, CPD-holdige oligonukleotider og p44 ble levert av Samuel Wilson, Korbinian Heil og Thomas Carell og Gudrun Michels og Caroline Kisker. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 og TE-671/4 til IT.

Materials

Molecular Force Probe (MFP) 3D Asylum Research N/A atomic force microscope (AFM)
Precision 390 DELL N/A computer
ThermoMixer and 1.5 ml block Eppendorf 5382000015 heat block for DNA preparation
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes Carl Roth GmbH Y264.1 & Y267.1 heat block for protein-DNA incubations
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH 1704467 electrophoresis chamber with gel caster and power supply
Power Pac Basic Bio-Rad Laboratories GmbH 1645050 electrophoresis power supply
Centifuge 5415 D with rotor Eppendorf 2262120-3 table centrifuge
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 Ultralum 900-1322-02 UV irradiation table
NanoDrop ND-1000 VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH N/A UV spectrophotometer
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter Unity Lab Services N/A water deionization and filter unit
Name Company Catalog number Comments
Software
MFP software on Igor Pro Asylum Research N/A AFM software
ImageJ (open source Java image processing) NIH Image N/A Image analysis software
Excel (Microsoft Office) Microsoft Corporation N/A data analysis software
Origin9 / Origin2016 OriginLab Corporation N/A statistical data analysis and graphing software
Name Company Catalog number Comments
Material
OMCL-AC240TS Olympus OMCL-AC240TS AFM cantilevers
grade V-5 muscovite SPI Supplies 1805 mica sheets
Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell Millipore Ireland Ltd. UFC505096 centrifuge filters
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH 740 609.250 Agarose gel extraction kit
Rotilabo cellulose paper type 111A Carl Roth GmbH AP59.1 AFM deposition blotting paper
Anatop 25 (0.02 μm) Whatman GmbH 6809-2102 syringe filter
SSpI, BspQI New England Biolabs (NEB) R0132, R0712 restriction enzymes for DNA substrate preparation
XhoI, BglII R0146, R0144 restriction enzymes for DNA preparation controls
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI New England Biolabs (NEB) R0607 nickase
T4 DNA ligase New England Biolabs (NEB) M0202S Ligase
Tris, HEPES Carl Roth GmbH 4855, 9105 buffer chemicals
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate Carl Roth GmbH 3957, HN03, HN02, P026 salt chemicals
NaAc Sigma-Aldrich Chemie GmbH 32318 salt chemicals
DTT, TCEP, EDTA 6908, HN95, 8040 chemicals/reagents
agarose, acetic acid, HCl Carl Roth GmbH 2267, 3738, K025 reagents
ATPƔS Jena Bioscience NU-406 nucleotides
ATP Carl Roth GmbH K054 nucleotides
oligonucleotide #1 in Table 1 Biomers custom complementary DNA oligonucleotide
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 Integrated DNA Technologies (IDT) custom fluorescein containing oligonucleotides
oligonucleotides #4  and #5 in Table 1 private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) CPD containing oligonucleotides
SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml Sarstedt 72.704 and 72.706 incubation tubes
GeneRuler 1 kb Thermo Scientific SM0311 DNA ladder
6x concentrate gel loading dye purple New England Biolabs (NEB) 51406 DNA loading dye
Midori Green  Nippon Genetics Europe GmbH 999MG28055 DNA stain

References

  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Play Video

Cite This Article
Gross, J., Wirth, N., Tessmer, I. Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair. J. Vis. Exp. (123), e55501, doi:10.3791/55501 (2017).

View Video