Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Atomisk kraftmikroskopi (AFM) er en kraftig teknikk for analyse av protein-DNA-interaksjoner 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det krever bare lave mengder prøveemne for direkte å visualisere heterogene prøver med en oppløsning på enkeltmolekylnivå. Heterogenitet kan skyldes forskjellige konformasjonelle eller oligomere tilstander i et protein. Spesielt kan proteinkompleksene i sammenheng med protein-DNA-prøver vise forskjellige støkiometrier og / eller konformasjoner indusert ved DNA-binding generelt eller bindende til et spesifikt målsted i DNA. Heterogene prøver kan også inneholde to (eller flere) forskjellige typer proteiner og forskjellige proteinkomplekserFormer ( f.eks . Som består av bare én type protein versus heteromere komplekser) kan interagere forskjellig med DNA. Studiene som diskuteres her, utnytter AFM-bildebehandling i luft på statiske, tørkede prøver av DNA-reparasjonsproteiner bundet til lange (~ 900 basepar, bp) DNA-fragmenter som inneholder en lesjon, som representerer et mål for disse proteinene. Den høye molekylære oppløsningen av AFM tillater forskjellen mellom forskjellige typer proteinkomplekser og å bestemme bindingsposisjonene av proteiner på DNA-fragmentene. Viktig er at lesjonene blir introdusert i DNA-substratene ved veldefinerte posisjoner. Fordi plasseringen av lesjonsstedet i DNA er kjent, gir fordelingen av proteiner bundet til DNA innsikt i (forskjellige) lesjonsgenkjenningsegenskaper av (forskjellige) proteinkompleksene, f.eks . Hvor godt de kjenner igjen en bestemt type lesjon (sammenlignet med Til ikke-skadet DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Deres posisjoner på DNA lar også skillet mellom proteinkomplekser bundet spesifikt til lesjonene og kompleksene bundet uspesifikt andre steder på DNA'et. Separat karakterisering av disse forskjellige komplekse typer (komplekser bundet spesifikt til lesjonen mot ikke-spesifikke komplekser) kan avsløre potensielle konformasjonsendringer i kompleksene indusert ved målstedidentifikasjon.
DNA-reparasjonsproteiner som er fokusert på her er helikaser som er ansvarlige for lesjonsgenkjenning i nukleotid-eksplisjonsreparasjonen (NER) -banen. I bakterier oppnås NER ved proteinene UvrA, UvrB og UvrC. UvrA er ansvarlig for innledende lesjonssensing i et UvaA 2 / UvrB 2 DNA-skanningskompleks. Ved lesjon verifisering av UvrB konverterer dette komplekset til monomer UvrB bundet på lesionsstedet, og dette bestemte komplekset kan deretter rekruttere pRokaryotisk NER endonuklease UvrC. UvrC aksepterer en kort (12-13 nt) strekning av enkeltstrenget DNA (ssDNA) som inneholder lesjonen. Den manglende strekk blir deretter påfyllt av DNA-polymerase. Endelig forsegler DNA-ligase den nylig syntetiserte strekk med det opprinnelige DNA 9 , 10 . I eukaryoter er de fleste proteiner i NER-kaskaden en del av det store multimeriske transkripsjonsfaktor II H (TFIIH) komplekset. Etter innledende lesjonsavkjenning via det trimeriske CEN2-XPC-HR23B-komplekset rekrutteres TFIIH til DNA-målstedet. Når XPD i komplekset verifiserer tilstedeværelsen av en NER-mållesjon, rekrutteres de eukaryote NER endonukleaser XPG og XPF for å aksessere en kort (24-32 nt) strekning av ssDNA som inneholder lesjonen 9 , 10 . Her ble spesielt undersøkt helikasene UvrB og XPD fra henholdsvis prokaryotisk og eukaryotisk NER. Disse helikasene krever en uparret region iDNA (en DNA-boble) for å tråkke på en av de to DNA-enkeltstrengene og deretter translokere langs denne strengen drevet av ATP-hydrolyse. I tillegg til DNA-lesjonene ble en DNA-boble introdusert i substratene som fungerer som lastingssted for proteinene.
Fremgangsmåten for fremstilling av spesifikke lesjon-DNA-substrater er blitt beskrevet tidligere 11 . Det krever en sirkulær DNA-konstruksjon (plasmid) med to tett avskilt restriksjonsseter for en nikase. I sammenheng med denne studien ble plasmidet pUC19N (2729 bp) brukt (opprettet av S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Dette plasmidet inneholder tre nært avsatte restriksjonssteder for nikase Nt.BstNBI som rammer en strekning på 48 nukleotid (nt). Etter inkubering med nikasen kan strekningen av ssDNA mellom disse stedene fjernes og erstattes av et oligonukleotid som inneholder hvilken som helst målfunksjon. Etter hvert trinn testes komplett enzymatisk fordøyelse via agarosegelelektroforese. Nikket sirkulært DNA kan skelnes på grunn av sin lavere elektroforetiske mobilitet sammenlignet med det opprinnelige supercoiled plasmidet. Gapping av DNA og erstatning av den fjernede strekk av det spesifikke substratoligonukleotidet kan evalueres via fordøyelse med et restriksjonsenzym som inkludere substratet utelukkende innenfor regionen mellom nicks. Linearisering av det sirkulære plasmidet av enzymet vil følgelig bli undertrykt for gapped DNA og gjenopprettet etter innsetting av det spesifikke oligonukleotid. Endelig tillater to endonuklease restriksjonssteder (ideelt single cutters) genereringen av et lineært DNA-substrat, med lengde som ønsket og med det spesifikke målstedet i en definert posisjon, så vel som en DNA-boble i en avstand fra lesjonen enten i 5 'Eller 3' retning.
Anerkjennelse av lesjonene ved NER-helikasene kan undersøkes via AFM-bildebehandling. Stalled DNA-translokasjon av helikasene ved tHan lesionssted er synlig som en topp i proteinposisjonsfordelingen på DNA og indikerer lesjonsgenkjenning. Fordi DNA-translokasjon av disse helikasene er videre retningsbestemt, med 5'-til-3'-polaritet, indikerer avhengigheten av lesjonsgenkjenning på posisjonen til lastingsstedet (DNA-boblen oppstrøms eller nedstrøms fra lesjonen) også om lesjonen er fortrinnsvis gjenkjent På den translokaterte eller på motsatt, ikke-translokulerte ssDNA-streng 5 , 9 . I de følgende avsnittene vil de brukte metodene bli introdusert, og store funn fra disse forsøkene vil bli kort diskutert. Viktig, analogt med det eksemplariske arbeidet med DNA-reparasjon vist her, kan AFM-bildebehandling påføres studier av forskjellige DNA-interaksjonssystemer, slik som DNA-replikasjon eller transkripsjon 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.
AFM statistiske analyser av bindingsposisjoner av proteiner på lange DNA-fragmenter som inneholder spesifikke målsteder, kan avsløre interessante detaljer om de spesifikke strategiene som brukes av proteinet for å gjenkjenne disse nettstedene 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . For å tolke de resulterende stillingsfordelingene må posisjonene til målene i DNA være nø…
The authors have nothing to disclose.
PUC19N, CPD-holdige oligonukleotider og p44 ble levert av Samuel Wilson, Korbinian Heil og Thomas Carell og Gudrun Michels og Caroline Kisker. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 og TE-671/4 til IT.
Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
Precision 390 | DELL | N/A | computer |
ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Material | |||
OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |