Atomic Force Microscopy Undersökningar av DNA-lesionsigenkänning i Nucleotide Excision Repair
Summary
Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.
Abstract
AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.
Introduction
Atomkraftsmikroskopi (AFM) är en kraftfull teknik för analys av protein-DNA-interaktionerna 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Det kräver endast låga mängder provmaterial för att direkt visualisera heterogena prover med en upplösning på den enda molekylnivån. Heterogenitet kan härledas från olika konformationella eller oligomera tillstånd i ett protein. I synnerhet kan proteinkomplex i samband med protein-DNA-prover visa olika stökiometrier och / eller konformationer inducerade genom DNA-bindning i allmänhet eller bindande till en specifik målplats inom DNA. Heterogena prover kan också innehålla två (eller flera) olika typer av proteiner och olika proteinkomplexFormer ( t.ex. bestående av endast en typ av protein kontra heteromera komplex) kan interagera annorlunda med DNA. De studier som diskuteras här utnyttjar AFM-avbildning i luft på statiska, torkade prover av DNA-reparationsproteiner bundna till långa (~ 900 baspar, bp) DNA-fragment som innehåller en lesion, vilket representerar ett mål för dessa proteiner. Den höga molekylära upplösningen av AFM möjliggör distinktionen mellan olika typer av proteinkomplex och att bestämma bindningspositionerna för proteinerna på DNA-fragmenten. Viktigt är att lesionerna införs i DNA-substraten vid väldefinierade positioner. Eftersom läget för lesionsstället i DNA är känt, ger distributionerna av proteiner bundna på DNA inblick i (olika) lesionsigenkänningsegenskaper hos (olika) proteinkomplexen, t.ex. hur väl de känner igen en viss typ av lesion (jämfört med Till icke-skadat DNA) 2 , 3 , <supClass = "xref"> 4 , 5 , 6 . Deras positioner på DNA möjliggör också skillnaden mellan proteinkomplex bundna specifikt vid lesionerna och komplexen som är bundna ospecifikt på annat håll på DNA. Separat karakterisering av dessa olika komplexa typer (komplex bundna specifikt vid lesionen mot icke-specifika komplex) kan avslöja potentiella konformationsförändringar i de komplex som induceras vid identifiering av målplatsen.
DNA-reparationsproteinerna som är inriktade på här är helikaser som är ansvariga för lesionsigenkänning i nukleotidutjämningsreparationen (NER) -vägen. I bakterier uppnås NER genom proteinerna UvrA, UvrB och UvrC. UvrA är ansvarig för initial lesionsavkänning i ett UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskomplex. Vid lesionsverifiering av UvrB omvandlas detta komplex till monomeriskt UvrB bunden vid lesionsstället och detta specifika komplex kan sedan rekrytera pRokaryot NER-endonukleas UvrC. UvrC excises en kort (12-13 nt) sträckning av enkelsträngad DNA (ssDNA) innehållande lesionen. Den saknade sträckan fylles sedan av DNA-polymeras. Slutligen förseglar DNA-ligas den nyligen syntetiserade sträckan med det ursprungliga DNA 9 , 10 . I eukaryoter ingår de flesta proteinerna i NER-kaskaden i det stora multimeriska transkriptionsfaktorn IIH (TFIIH) -komplexet. Efter inledande lesionsavkänning via det trimera CEN2-XPC-HR23B-komplexet rekryteras TFIIH till DNA-målplatsen. När XPD inom komplexet verifierar närvaron av en NER-målskada, rekryteras de eukaryota NER-endonukleaserna XPG och XPF för att excisera en kort (24-32 nt) sträckning av ssDNA som innehåller lesionen 9 , 10 . Här studerades specifikt helikaserna UvrB och XPD från respektive prokaryotiska och eukaryota NER. Dessa helikaser kräver en oparad region iDNA (en DNA-bubbla) för att gänga på en av de två DNA-enskilda strängarna och därefter translokera längs denna sträng som drivs genom ATP-hydrolys. Förutom DNA-lesionerna infördes en DNA-bubbla i substraten som fungerar som laddningsställe för proteinerna.
Förfarandet för framställning av specifika lesions-DNA-substrat har beskrivits tidigare 11 . Det kräver en cirkulär DNA-konstruktion (plasmid) med två nära åtskilda restriktionsställen för en nickas. I samband med denna studie användes plasmiden pUC19N (2729 bp) (skapad av S. Wilsons laboratorium, NIEHS). Denna plasmid innehåller tre nära åtskilda restriktionsställen för nickas Nt.BstNBI som ramar en 48 nukleotid (nt) sträckning. Efter inkubering med nickaset kan sträckan av ssDNA mellan dessa ställen avlägsnas och ersättas med en oligonukleotid innehållande vilken som helst målsärdrag. Efter varje steg testas fullständig enzymatisk digestion via agarosgelelektrofores. Nicked-cirkulärt DNA kan särskiljas på grund av dess lägre elektroforetiska rörlighet jämfört med den ursprungliga supercoilerade plasmiden. Gappning av DNA: n och ersättning av den avlägsna sträckningen med den specifika substratoligonukleotiden kan utvärderas via digestion med ett restriktionsenzym som inciserar substratet uteslutande inom området mellan nicks. Linearisering av den cirkulära plasmiden av enzymet kommer således att undertryckas för det gapped-DNA och återställes efter införandet av den specifika oligonukleotiden. Slutligen medger två endonukleasrestriktionsställen (idealiskt enkla skärare) genereringen av ett linjärt DNA-substrat med längd som önskat och med den specifika målplatsen i en definierad position såväl som en DNA-bubbla på avstånd från lesionen antingen i 5 'Eller 3' riktning.
Erkännande av lesionerna med NER-helikaser kan undersökas via AFM-bildbehandling. Stallad DNA-translokation av helikaserna vid tHans lesionsplats är synlig som en topp i proteinpositionsfördelningen på DNA och indikerar lesionsigenkänning. Eftersom DNA-translokation av dessa helikaser är vidare riktningsvis, med 5'-till-3'-polaritet indikerar beroendet av lesionsigenkänning på läget för laddningsstället (DNA-bubblan uppströms eller nedströms från lesionen) också huruvida lesionen är företrädesvis igenkänd På den translokerade eller på motsatta, icke-translokerade ssDNA-strängen 5 , 9 . I de följande avsnitten kommer de använda metoderna att introduceras och stora fynd från dessa experiment kommer att diskuteras kortfattat. Betydande, analogt med det exemplifierande arbetet med DNA-reparation som visas här, kan AFM-imaging appliceras på studien av olika DNA-interaktionssystem, såsom DNA-replikation eller transkription 8 , 12 , 13 , 14 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM statistiska analyser av bindningspositioner av proteiner på långa DNA-fragment som innehåller specifika målställen kan avslöja intressanta detaljer om de specifika strategier som används av proteinet för att känna igen dessa platser 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . För att tolka de resulterande positionsfördelningarna måste positionerna för målen i DNA v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUC19N, CPD-innehållande oligonukleotider och p44 tillhandahölls vänligen av Samuel Wilson, Korbinian Heil och Thomas Carell, respektive Gudrun Michels och Caroline Kisker. Detta arbete stöddes av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 och TE-671/4 till IT.
Materials
| Molecular Force Probe (MFP) 3D | Asylum Research | N/A | atomic force microscope (AFM) |
| Precision 390 | DELL | N/A | computer |
| ThermoMixer and 1.5 ml block | Eppendorf | 5382000015 | heat block for DNA preparation |
| Rotilabo Block-Heater H 250 & blocks for 0.5 ml tubes | Carl Roth GmbH | Y264.1 & Y267.1 | heat block for protein-DNA incubations |
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1704467 | electrophoresis chamber with gel caster and power supply |
| Power Pac Basic | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1645050 | electrophoresis power supply |
| Centifuge 5415 D with rotor | Eppendorf | 2262120-3 | table centrifuge |
| Ultra-Lum electronic UV transillumonator MEB-15 | Ultralum | 900-1322-02 | UV irradiation table |
| NanoDrop ND-1000 | VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH | N/A | UV spectrophotometer |
| TKAX-CAD with 0.2 μm capsule filter | Unity Lab Services | N/A | water deionization and filter unit |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Software | |||
| MFP software on Igor Pro | Asylum Research | N/A | AFM software |
| ImageJ (open source Java image processing) | NIH Image | N/A | Image analysis software |
| Excel (Microsoft Office) | Microsoft Corporation | N/A | data analysis software |
| Origin9 / Origin2016 | OriginLab Corporation | N/A | statistical data analysis and graphing software |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Material | |||
| OMCL-AC240TS | Olympus | OMCL-AC240TS | AFM cantilevers |
| grade V-5 muscovite | SPI Supplies | 1805 | mica sheets |
| Amicon Ultra 0.5ml 50k Ultracell | Millipore Ireland Ltd. | UFC505096 | centrifuge filters |
| NucleoSpin Extract II | Macherey-Nagel GmbH | 740 609.250 | Agarose gel extraction kit |
| Rotilabo cellulose paper type 111A | Carl Roth GmbH | AP59.1 | AFM deposition blotting paper |
| Anatop 25 (0.02 μm) | Whatman GmbH | 6809-2102 | syringe filter |
| SSpI, BspQI | New England Biolabs (NEB) | R0132, R0712 | restriction enzymes for DNA substrate preparation |
| XhoI, BglII | R0146, R0144 | restriction enzymes for DNA preparation controls | |
| nicking restriction enzyme Nt.BstNBI | New England Biolabs (NEB) | R0607 | nickase |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs (NEB) | M0202S | Ligase |
| Tris, HEPES | Carl Roth GmbH | 4855, 9105 | buffer chemicals |
| NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate | Carl Roth GmbH | 3957, HN03, HN02, P026 | salt chemicals |
| NaAc | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | 32318 | salt chemicals |
| DTT, TCEP, EDTA | 6908, HN95, 8040 | chemicals/reagents | |
| agarose, acetic acid, HCl | Carl Roth GmbH | 2267, 3738, K025 | reagents |
| ATPƔS | Jena Bioscience | NU-406 | nucleotides |
| ATP | Carl Roth GmbH | K054 | nucleotides |
| oligonucleotide #1 in Table 1 | Biomers | custom | complementary DNA oligonucleotide |
| oligonucleotides #2, #3, and #6 in Table 1 | Integrated DNA Technologies (IDT) | custom | fluorescein containing oligonucleotides |
| oligonucleotides #4 and #5 in Table 1 | private (available from e.g. TriLink or GlenResearch) | CPD containing oligonucleotides | |
| SafeSeal reaction tube 0.5 ml and 1.5 ml | Sarstedt | 72.704 and 72.706 | incubation tubes |
| GeneRuler 1 kb | Thermo Scientific | SM0311 | DNA ladder |
| 6x concentrate gel loading dye purple | New England Biolabs (NEB) | 51406 | DNA loading dye |
| Midori Green | Nippon Genetics Europe GmbH | 999MG28055 | DNA stain |
References
- Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
- Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
- Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
- Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
- Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
- Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
- Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
- Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
- Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
- Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
- Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
- Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625 (2015).
- Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001 (2012).
- Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
- Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2012).
- Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
- Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954 (2014).
- Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
- Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
- Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
- Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
- Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
- Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
- Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
- Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
- Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
- Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
- Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).
