Summary
מיומנות מטבולית של מערכות במבחנה ב הוא דרישת מפתח עבור biotransformation ומכירה של סמים toxicants. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של בדיקות מטבוליות התייחסות להעריך בשלב שאני המטבוליזם בתרביות תאים.
Abstract
אנזימים חילוף חומרים Xenobiotic לשחק תפקיד מפתח biotransformation תרופות toxicants ידי הוספת קבוצות פונקציונליות המגבירים מסיסות ולהקל הפרשת. בהזדמנויות כמה שינויים מבניים אלו להוביל להיווצרות של מוצרים רעילים חדשים. על מנת להפחית ניסויים בבעלי החיים, סיכון כימי ניתן להעריך באמצעות תאים מוסמכים מבחינה מטבולית. הביטוי של אנזימים מטבוליים, לעומת זאת, אינו יציב לאורך זמן ברבות במערכות תרבות העיקרית במבחנה, והוא בדרך כלל חלקית או נעדר בשורות תאים. לכן, במחקר של תרופות, תוספים, וחילוף חומרים מזהמים סביבתיים במבחנה רצויה להתנהל במערכות תא שבו פעילות מטבולית התאפיינה. אנו מסבירים כאן גישה למדידת פעילות של מחלקה של אנזימים מטבוליים (Phase אנוש I) בשורות תאי 2D ותרבויות 3D ראשוני באמצעות בדיקות כימיות ומוצרי מטבולית שלהם לכימות על ידי ספקטרומטריית מסה UPLC וluminometry. השיטה ניתן ליישם על מנת לבחון את הפעילות המטבולית של שורות תאים תאים ראשוניים שמקורם במגוון של רקמות.
Introduction
המטבוליזם Xenobiotic הוא התהליך שבאמצעותו כימיקלים זרים לגוף משתנים על ידי התוספת של קבוצות הידרופילי conjugates כדי להקל ההפרשה שלהם 1. בדרך כלל המטבוליזם של xenobiotics הוא תהליך דו-שלבי עם שלב I המורכב בעיקר של חמצון בתוספת קבוצות הידרוקסיל אחת או מספר 1, 2. בשלב ב ', קבוצות הידרוקסיל משמשים acceptors עבור המצומד הידרופילי כגון glucuronide או מחצית סולפט 1, 2. אם קבוצת acceptor כבר מקיימת על המולקולות, צעד הנטייה יכול לקרות עצמאי של חילוף חומרים שלב I. תגובה לכל מבוצעת על ידי קבוצה ספציפית של אנזימים, למשל, CYPs (ציטוכרום P450s), כי לזרז את hydroxylation (איור 1) ו dealkylation של מצעים כימיים 3. Conjugation מזורזת על ידי sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases (איור 1), גלוטתיון-S-טרנספראז ו- N-acetyltransferases 4. כל רקמה ואיבר יהיה פרופיל ביטוי אנזים ספציפי מטבולית, עם הכבד להביע ביותר של חלבונים אלו.
איור 1: דוגמה שלב I ושלב II ומטבוליזם עבור Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 לזרז את coumarin-hydroxylation 7 של. 7-hydroxycoumarin הוא מצומדות כדי מחצית glucuronide ידי UGTs שלב II אנזימים, עם מראה UGT1A6 ו UGT1A9 הפעילות הגבוהה ביותר.
הבין את חילוף חומרים של xenobiotics הוא קריטי בהערכת בטיחות תרופה ועל הערכת סיכונים כימית משתי סיבות: קינטיקה התגובה תקבע כמה זמן תרופה או כימי תישאר בגוף באופן b טופס פעיל או לא פעילהפרשת efore; יכול להיות משונה במתחם ההורה על מינים, לא יציבים ורעילים תגובתי יותר על ידי אנזימים מטבוליים. תגובות אלו ידועים גם בשם "bioactivation" מונעות בעיקר על ידי שלב I CYP אנזימים אלא גם בהזדמנויות נדירות על ידי נטיית שלב II 5.
בהתבסס על זה, את היכולת של מודל במבחנה לנבא את הסיכון במדויק הקשורים תרופה או חומר כימי תלויה מאוד על מיומנות מטבוליות של מערכת התא. שורות תאים שמקורם לרקמות החולות או טרנספורמציה של תאים נורמליים קרובות מאבדים חלק אם לא את כל נציג פרופיל האנזים המטבולי של רקמת מוצאם 6. התחזוקה של פרופיל האנזים המטבולי הנורמלי נראית טובה יותר בתרביות תאים ראשוניות (לפחות בתרבויות בטווח קצרות), והוא השתפר עוד יותר אם הרקמה היא בתרבית מטריצה שמאפשרת לו לשמור על מבנה 3D שלה 1. לכן, characterization של מיומנות מטבוליות של מערכת תאים במבחנה ב מהווה צעד ראשוני חשוב המנחה את ההחלטה לגבי איזה דגם תא ראוי לערוך הערכות בטיחות כימיות.
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל הפעילות והביטוי של אנזימי CYP שלב I במבחנה עם דוגמאות של היישום שלהם עם שורת תאים בכבד 7 ו תרביות תאי ריאות 3D עיקריות 8. מצעים ספציפיים CYP, המוצרים המטבולית שלהם מעכב השולט מתוארים יחד עם spectrometry- ההמוני ושיטות כימות מבוססות luminogenic. מאחר שחלק CYPs הם מושרה ואחרים אשר מכוננים, דוגמאות גם תינתן לשני תרחישים אלה.
Protocol
הערה: העבודה הכללית עבור assay פעילות מטבולית מתוארת באיור 2. לכל שלב של העבודה הזו הוא בהמשך מפורט בפסקאות הבאות. טבלאות מפורטות של חומרים כימיים וציוד ניתנים בטבלה של חומרים.
איור 2: Workflow עבור assay Probe מטבולית. תאי זרע ו גדל צפיפות נאותה. צעד אינדוקציה CYP ייתכן שתידרש בהתאם לפעילות האנזים assayed. מצע הבדיקה המעכב מתווספים תרבית התאים. לאחר תקופת דגירה, המדיום נאסף לניתוח התאים lysed עבור כימות חלבון. המדיום הוא מעובד לניתוח של המוצר מטבוליות של מצע הבדיקה על ידי ספקטרומטריית מסה או luminometry.מודעה / 55,502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. תרבית תאים
איור 3: אור הילוכים מיקרוגרפיה של תא כבדית קו תרבות. שורת התא תארה בפרוטוקול זה 5 בדרך כלל לבדל עם פיצול 50% בין cholangiocytes ו hepatocytes בתרבות (100x). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- תרבות שורת תאים כבדיה
הערה: שורת תאים בכבד זמינה מסחרי שמשה כדוגמא של תאים מוסמכים מבחינה מטבולית. שורת התא נגזרת hepatocarcinoma הנגרמת על ידי זיהום ויראלי 7. בשעה confluency, קו התא הזה מתבדל תאים cholangiocyte- ו הפטוציט דמוי (איור 3) ופרטים נוספים ניתן למצוא Guillouzo 7. הכללתו של 2% DMSO עד בינוני התרבות תומך בידול של שורת תאים זו וביטוי של מגוון CYPs.- הסר את בקבוקוני קריוגני עם תאים מן החנקן הנוזלי ומניח על קרח יבש לתחבורה. העברת cryovial כדי באמבט מים מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות, לעקר את החלק החיצוני של הבקבוקון עם אתנול 70% לפני הצבת במנדף זרימה למינרית.
- תוך עבודה בתנאים סטריליים, לפתוח בזהירות את הבקבוקון קריוגני לשחרר את כל הלחץ עודף ו פיפטה תכולת הבקבוקון קריוגני לתוך צינור 10 מ"ל מלאים 9 מ"ל של מדיום E מחומם מראש וויליאמס ב 37 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה הפתרון עבור 10 דקות ב 400 XG בטמפרטורת החדר, וזורקים supernatant, מחדש להשעות התאים 5 מ"ל שלמדיום הפשרת קניינית מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, בתוספת גלוטמין או תוספת גלוטמין (2 ריכוז סופי מ"מ) (תוספת E + גלוטמין וויליאמס + תוספי הפשרה).
- ספירת תאי קיימא באמצעות aliquot 500 μL עם דלפק תא או כל טכניקת ספירת תאים מתאימה אחרת.
- זרעי תאי צלחת מצופה קולגן 24-היטב בצפיפות של 0.6 x 10 6 תאי קיימא / היטב בנפח סופי של 0.5 מיליליטר של מדיום הפשרה.
- מניחים את הצלחת (ים) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית 5% / 95% CO 2 / אוויר 100%.
- 24 שעות לאחר זריעת התאים, להחליף בינוני עם 0.5 מ"ל של מדיום עובד מחומם מראש תחזוקה / המטבוליזם (תוספת E + גלוטמין וויליאמס + תוספת המטבוליזם (המדיום הזה כבר מכיל DMSO)). שינוי המדיום כל יומיים.
- אחרי כמה ימים בתרבות התאים ליצור מבנה trabecular תת ומחוברות (איור 3). המטבוליים האופטימליפעילות בדרך כלל הוא ציין בין יום 7 ו 10 ו הוא הנמוך ביותר ב יום 4.
איור 4: חתך של תאי Airway הכחול מוכתם Alcian Grown על ממשק האוויר הנוזלי 8.
ריסים, ייצור ריר ותאי בסיס נראים בבירור. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר.
- תרבויות האפיתל בדרכי הנשימה Differentiated
הערה: הפרוטוקול מוצג עם זמינים מסחריים לחלוטין בדיל עיקרי בדרכי נשימה אפיתל גדל על ממשק האוויר הנוזלי על אינסרט 8 (איור 4). תרבית הרקמה שומרת פנוטיפ mucocilliary ותא קוטביות 8. תאים יכולים להיות של אף או מוצאים סימפונות. הנה, להשתמש בתאי אף אנושיים. התאים מועברים על פורמט צלחת תרבות עם 24מוסיף בממשק-נוזלי אוויר. כדי להקל על תחבורה ולהימנע משפיכה בינונית המחדיר נשלח עם סעיף הבסיס מוטבע מטריצת agarose מעורבבת עם מדיום התרבות.- עם מסירת התאים, לעקר את הצלחות המכילות את 24 מוסיף עם פתרון אתנול 70% לפני הצבת במנדף זרימה למינרית נקיה.
- כן צלחת 24-היטב סטרילי על ידי הוספת בינוני תרבות קניינית מחוממת מראש 700 μL.
- פינצטה סטרילית באמצעות העברת הכנסות התא אל הצלחת החדשה הטעונה מראש בינוני ידי פירוק הכנס בעדינות מן מטריקס agarose.
- מניחים את הצלחת (ים) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית 5% / 95% CO 2 / אוויר 100%.
- כל 2 ימים להעביר את מוסיף לצלחת 24 היטב סטרילי חדשה טעון מראש עם 700 μL בינוני דרך נשימת תא תרבות קניינית חמה.
- להעריך את שלמות הרקמה דרכי הנשימה באמצעות שיטות, כגון התנגדות טרנס-אפיתל (TEER), אוהריסים לנצח תדר (CBF) באמצעות מיקרוסקופ המצויד במערכת הדמיה וידאו חי 9. המדידה של TEER ו CBF מתואר Kuehn 10.
2. כימות פעילות CYP בתרביות תאים
הערה: ככלל, ממיסים כגון DMSO ו מתנול יכול לשמש להכנת פתרונות המניות עבור בדיקות מטבוליות שונות מעכבי המוצג במאמר זה. עם זאת, מומלץ לשמור על ריכוז DMSO הסופי במדיום התרבות למינימום (1% או פחות) מאז ריכוזים גבוהים יכולים לעכב אנזימים מטבוליים. במידת האפשר, מומלץ גם להשתמש פנול אדום חינם ובינוניים בסרום חינם במהלך הדגירה עם בדיקות מטבוליות מאז פנול אדום יכול להפריע CYPs ופעילות האנזים Phase II ו רכיב בסרום כגון אלבומין יכול להקטין את הזמינות החללית. זה לא תמיד אפשרי כדי להקפיד על אלה הנחיות. למשל, תרבית תאים בינוני בדרכי נשימה הוא קניינים מכיל פנול אדום. המטבוליזם קנייניות שורת תאים בכבד בינוני 7 כבר מכיל DMSO מעל 1% כפי שהוא נדרש עבור התאים לאמץ את הפנוטיפ דמוי הפטוציט.
הערה: לבסוף, כאן, המונח המדויק בדיקה / מעכב משמש אך המינוח הזה צריך להיחשב בזהירות. ואכן, זה מאוד נדיר עבור בדיקה מטבולית להיות מצע בלעדי אנזים. הבדיקות שתוארו כאן, לעומת זאת, יש זיקה גבוהה עבור יעד האנזים שלהם ולכן נחשבות כסמנים אמינים של פעילות.
- בדיקות מטבוליות, מעורר, ומעכבים
- בדיקות באמצעות ספקטרומטריית מסה שיטות המבוססות
הערה: הבדיקות והמעכבים המתוארות בסעיף זה מתאימים כדי לבחון את פעילות CYP2As 11, CYP1A2 12,נ"צ "> 13, CYP2B6 7, 14, 15 CYP2F1, 16, ו CYP2E1 17 על ידי ספקטרומטריית UPLC-מסה. הבדיקות, מעכבי המקביל CYP מתוארים בטבלה 1 עם אזכור המקביל. טבלה 1 מפרטת גם את המוצר מטבוליות של CYP פעילות אשר לכמת ידי ספקטרומטריית מסה. כל העבודות שיש בהן רקמה תרבות ופתרונות לשימוש בתרבית רקמה היא להתבצע במנדף בתרבית רקמה סטרילית. ניתן להכין פתרון המניות ב DMSO עבור כל מצעים החללית.- לפני הניסוי להכין שתי סדרות של הוסיף תא או בארות, להשתמש בסדרה אחת לניסוי העיכוב, והשני עבור הבדיקה מטבולית בלבד. כן סדרה שלישית של תאים כביקורת בינונית ריקה. הם יכולים להיות על צלחות נפרדות או באותו צלחות עם מינימום של שלושה משכפל. דוגמא הצלחת להניחמתוך מוצג באיור 5.
- ביום הניסוי, להחליף את תרבית תאים בינוניים עם 450 μL של מדיום חדש.
- הכן במנדף סטרילית בריכוז 10x של הפתרונות הבאים באמצעות תרבית תאים בינוניים. מערבבים החללית CYP 10x, מעכב CYP 10x, ו- מעכב CYP 10x בתוספת 10x החללית.
הערה: פתרונות מניות ריבונו של מעכב בדיקה אפשר להכין 100% DMSO (למשל, 1,000x מניות) ועוד מדוללות בתקשורת כדי להשיג פתרון 10x כדי למנוע ריכוז DMSO סופי העולה על 1% עם תרבית התאים . ריכוזי 1x הסופיים ומיועדים עבור הדגירה עם התאים מוצגים בלוח 1. - סנן פתרון 10x בדיקה השונה עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
- להוסיף 50 μL של מדיום המכיל מעכב CYP 10x לסדרה של תאים שהוכנו לצורך ניסוי העיכוב מראש הדגירה של 30 דק '.
- RePlace המדיום של תאים בסדרת העיכוב עם 450 μL של מדיום חדש ולהוסיף 50 μL של מדיום המכיל גם מעכב CYP 10x ואת המצע החללי 10x.
- הוסף התאים האחרים 50 μL של מדיום עם מצע 10x הבדיקה ולהוסיף כמות שווה של רכב מדולל בינוני (למשל, DMSO) כדי בקרות התא הריקות כמתואר באיור 5.
- דגירת התאים למשך 5 - 0 דקות (זמן 0, מלא ברקע) ו 16 h בחממת התא.
הערה: זמן הדגירה זו שימשה בהצלחה עם תאי דרכי הנשימה ואת שורת תאים בכבד; אולם הטרי hepatocytes הראשוני יש מיומנות מטבולית גבוהה, ועומד על איכות הכנת תא הרכב גנטי של תורם, ומכאן זמנים קצרים יותר (למשל, 2-4 ח) עשוי להיות מתאים. מומלץ תמיד לבצע ניסוי כמובן פעם שבודק שונה שורות תאים או סוגי תאים. - בתום תקופת הדגירה, Collect המדיום צינורות שכותרתו נפרד עבור כימות של המוצר מטבוליות של חלליות. להקפיא את המדיום לעיבוד בעתיד.
- Lyse התאים עבור כימות חלבון.
הערה: כל ערכת פרוטוקול כימות חלבון הסטנדרטי הוא מתאים את הצעד הזה. BCA היא אפשרות אחת מתאימה. שלב זה הוא אופציונלי אם התאים צריכים לשמש assay אחר.
- טיפול בינוני
הערה: הבינוני שנאספו בשלב הדגירה מכיל את כימיקל ההורה חללי וכן מוצרים מטבולית שלה. כדי למדוד פעילות CYP ספציפית רק התוצר של התגובה המזורזת על ידי CYP עניין יש לכמת. מוצרי חילוף החומרים שאני שלב מעובדים לעתים קרובות בד בבד עם שלב II המטבוליזם (נטיה) ולכן לא ניתן לאתר ככזה. לכן על מנת לקבל את הכימות המדויק ביותר של פעילות CYP, צעד deconjugation נדרש כדי להסיר כלשינוי בחילוף החומרים שלב II. מאז נטיה של שלב I מטבוליטים כרוך לעתים קרובות glucuronidation או סולפציה, deconjugation מושגת על ידי טיפול של דגימות ידי glucuronidases ו sulfatases 18. Glucuronidase ופעילות sulfatase היא pH תלוי בפעילות glucuronidase הגבוהה ביותר מושגות ב- pH 4.5-5.0 ו sulfatase פעילות להיות גבוהה ביותר ב- pH 6.0-6.5. לכן, הצעד הזה דורש הסתגלות pH. בשיטה המתוארת כאן, אנו מודדים את ה- pH באמצעות רצועות pH מסיבות מעשיות מכיוון שרוב בדיקות מד pH אינם מתאימים צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. להשיג בחנויות רצועות pH ניתן למצוא עם רזולוציה נמוכה כמו כמו 0.3 כדי 0.2 יחידות pH.- העבר 250 μL של המדיום הדגירה על microtube 1.5 מ"ל ולהוסיף פתרון המניות פנימי 4-methylumbelliferone תקן להגיע לריכוז סופי של 100 ננומטר.
- התאם את ה- pH של המדיום כדי 4.5-5.0 ידי הוספת 1 M HCl. להוסיף 1 μL של HCl בכל פעם ולוודא pHעל ידי pipetting 2 μL של המדיום על רצועת pH. הגעת pH של 5.0 בדרך כלל תדרוש לא יותר מ 5-10 μL של 1 M HCl.
- הוספת 150 יחידות (1.8 μL של מניות 85,000 יחידות / מיליליטר) של β-glucuronidase / arylsulfatase מן השבלול רומי דגירת 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 250 μL של מתנול קר (-20 ° C). אחסן את הדגימות ב -20 ° C או תהליך נוסף.
- לאדות את הממס באמצעות צנטריפוגות ואקום ב 45 מעלות צלזיוס. מחדש את הדגימות עם 500 μL של אצטוניטריל 30%: פתרון מים. הדגימות מוכנות לניתוח ספקטרומטריית מסה ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס צלוחיות זכוכית ענבר.
- כימות מבוסס ספקטרומטריית מסה
הערה: הגדרות כל UPLC ספקטרומטר המסה מפורטות בטבלת המשלימה הייעודית 1. לניתוח כמותי, הקמת עקומת כיול נדרש. קאליעקומת bration מתקבלת על ידי הפעלת מגוון דילול ידוע של המתחם כדי לכמת. במקרה זה, עקומות הכיול נוצרו מעל 10 ריכוזים שונים (לוח 2), לפחות 6 מהם צריך להיות בתוך 20% של הטווח ליניארי 19. רמת זיהוי הנמוכה נקבעת לפי הריכוז הנמוך ביותר אשר נותן אות גדולה יותר, או שווה 3x אות הרקע הממוצע. הרמה הנמוכה ביותר של כימות נקבעת לפי המדגם של הריכוז הנמוך ביותר אשר נותן אות גדולה, או שווה ל 10x אות הרקע הממוצע אשר שניהם נקבעים על לפחות 3 ריצות עצמאיות עם דגימות בשלושה עותקים.- הכין דילול סדרה של מטבוליט סינטטי במדיום בתרבית רקמה על פי לוח 2, כולל התקן הפנימי. נפח סופי של 250 μL לכל דילול סטנדרטי הוא נאות.
- לאדות את דילולים סדרתי של תקן כמתואר stEP 2.1.2.4 ו גלולה בנפח של אצטוניטריל 30%: מים שווה לנפח של אידוי לפני התקשורת (למשל, 250 μL 30% אצטוניטריל: מים אם הפתרון הסטנדרטי מתחיל היה 250 μL של מדיום).
- הוספת 250 μL של תקן זה דילול סדרתי כדי בקבוקון זכוכית ענבר UPLC להזרקה את autosampler UPLC-MS.
- מוסיפים את דגימות הבדיקה (250 μL) לאמבר בקבוקונים UPLC ולמקם אותם autosampler UPLC.
- שנה באקראי כל המבחנות.
הערה: תצורת ספקטרומטר המסה השתמשנו היא ספקטרומטר מסה היברידי משולש quadrupole / לינארי יון מלכודת מצמיד את UPLC מפורט בטבלת משלימת 1. פלטפורמות אחרות תהיינה תוכנה ותצורה שונות אבל היה בצעו את הפעולות דומות לבצע כימות. - הפעל את UPLC-MS תוך שימוש בהגדרות המפורטות בטבלה משלימה 1 תלוי בדיקה ספציפית לכמת.
- להשתמש"לכמת - בניית שיטת כימות" כלי כלי כימות ספקטרומטר מסה (הלוח של חומרים) כדי ליצור את עקומת הכיול מההתקן הסינטטי שנרכש פנימי הסטנדרטי.
- השתמש "אשף כימות" כדי לבחור את המנה מדגם ודוגמאות לכמת ולבצע את "שיטת כימות". תוכנת כימות ספקטרומטר המסה מציגה גיליון אלקטרוני עם הערכים לכמת במתחם היעד בכל מדגם בדיקה.
- בדיקות בשיטות מבוססות הארה
הערה: בדיקות Luminogenic למדוד מגוון של פעילויות CYP זמינה מסחרי; עם זאת, לא כולם מתאימים מבחנים מבוססים תא. כאן, פרוטוקול מוצג למדוד את הפעילות של CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 נבחר כדי להמחיש איך לבחון את הפעילות של CYPs המושרית ולתת דוגמא לאופן בדיקות luminogenic יכול לשמש אלתרתיילידי שיטות ספקטרומטריית מסה מבוססת. טבלה 3 מסכמת את זמן ריכוזי דגירה השתמשנו עבור התאים בדרכי נשימה ואת שורת תאים בכבד; עם זאת, אלה שאולי צריכים להיות מותאמים עבור סוגי תאים אחרים. בדיקות luminogenic אחרות זמינות מסחרי וניתן להשתמש בו כמו מצעים עבור מגוון רחב של CYPs.- כן תא מספיק כדי לכלול שליטה הלא מושרה, בדיקת מושרה, וכן בדיקה מושרה + מעכב. דוגמא פריסת צלחת מוצגת באיור 5 ב.
- כדי לגרום CYP1A1 / 1B1, דגירה התאים עם ריכוז סופי של 10 ננומטר TCDD במדיום לתקופה של 72 שעות (תקופות קצרות של 24 עד 48 h יכול להיות גם מתאים).
זהירות: TCDD הוא קרצינוגן ו teratogen. ללבוש ציוד מגן נאות, עיין בגיליון הספק MSDS ולבצע הערכת סיכונים לפני השימוש. - לאחר תקופה זו, להסיר את המדיום, לשטוף את הבארות עם פעמים 3 PBS, ולהוסיף כמה בינוני טרי.
- יחסי ציבורIOR כדי דוגרי התאים עם חללית כתב luminogenic, טרום דגירת המשנה הייעודית של תאים המושרה על 30 דקות עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר CYP1A1 / 1B1 מעכב, α-naphthoflavone, במדיום.
- מוסיפים את החללית luminogenic לוק-CEE (Luciferin אתר 6'-chloroethyl) בריכוז סופי של 50 מיקרומטר אל הלא המושרה, המושרה, ו המושרה + מעכב תאים.
- דגירה של 4 שעות ב תרבית תאי חממה. בתום זמן הדגירה לאסוף את המדיום עבור כימות של החללית luminogenic.
- העברת 25 μL של המדיום תרבות לצלחת גם לבן 96 אטום ולהוסיף 25 μL של מגיב איתור לוציפרין המסופק על ידי היצרן. דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. קרא את הצלחת מיד באמצעות luminometer.
- שוטפים את התאים עם PBS ו lyse עבור כימות חלבון כוללות.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי אם תאים חיים נשמרים עבור ניסויים בעתיד. אניt חשוב לציין עם זאת כי מעוררים כגון TCDD הם רעילים תגרום נזק לתאים.
- בדיקות באמצעות ספקטרומטריית מסה שיטות המבוססות
טבלה 1: רשימת מטבולית בדיקות, מוצרים, ומעכבי עם Enzyme המקבילים להם. משקל מולקולרי וריכוזי מומלץ להשתמש עם נתיב אוויר ותאי הכבד גם מצוינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: פריסת פלייט 24-היטב מוצע ל בצע Assay CYP. (א) את הפריסה המומלצת עבור CYPs הביע constitutively כוללת שורה של בארות עבור המדיום ריק, חללית מטבוליות, ואת המעכב פלוס בדיקה מטבולית. פריסה זו יכולה להיות מוכפלת במספר נקודות זמן, כי נבדקות. (ב) הפריסה לדוגמה עבור מושרת CYPs כוללת סדרה של היטב תמורת כרטיס בינוני, בדיקת מטבולית מלאה בלבד, תאי מושרה (למשל, עם TCDD) וטופחה עם הבדיקות וטופחו עם הבדיקות ו מעכב.
טבלה 2: דילול של תקנים סינטטיים המשמשים עקומות הכיול ו LODs בהתאמה LOQs. טווח דילול להשתמש יכול להשתנות בהתאם לפלטפורמה ספקטרומטריית מסה ורגישות. הנה, השתמשנו ספקטרומטר מסה היברידי משולש quadrupole / לינארי יון מלכודת קשור UPLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
טבלה 3: Luminogenic Probe, inducer ו מונע עבור CYP1A1 / 1B1 Assay. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Representative Results
דוגמאות של פעילות מטבולית נמדד עבור שני זוגות CYPs (CYP1A1 / 1B1 ו CYP2A6 / 2A13) ב תרביות תאים בדרכי הנשימה משלושה תורמים שונים (דרכי הנשימה M360, M370, M417) ואת שורת תאים בכבד (קו חפ) מוצגות באיור 6 20.
פעילות CYP נמדדת luminometry
איור 6 א מראה את ההארה יחסית המיוצרת על ידי CYP1A1 / 1B1 O-dealkylation הפעילות של לוק-CEE (Luciferin 6'-chloroethyl אתר) בתאים בדרכי נשימה (3 תורמים) ותאי כבד עם ובלי אינדוקצית TCDD. CYP1A1 / 1B1 הם אנזימים מושרים מאוד ובדרך כלל אינם בא לידי ביטוי ברמה מכוננת ברוב הרקמות. כפי שניתן לראות באיור 6A, אין אות luminogenic מזוהית כאשר התאים אינם מושרים. כאשר שני סוגי התאים הם מראש מודגרות עם TCDD, inducer CYP1A1 / 1B1 חזק, סימןאות luminogenic ed מזוהית לעומת השליטה (איור 6 א). הדבר מעיד כי בדיקת לוק-CEE כבר מפורק מובילה לשחרור המחצית לוציפרין כי היא לכמת מכן. בסך הכל פעילות מקו התא הכבד שטופל TCDD נמוכות יותר עבור התאים בדרכי הנשימה, אפילו לאחר נורמליזצית חלבון כוללת. זה אינו חריג, מכיוון שורות תאים נוטים להיות פחות מבחינה מטבולית פעילה מאשר תאים ראשוניים. תוספת של α-naphthoflavone יש השפעה מעכבת ברורה על פעילות CYP1A1 / 1B1 בכל סוגי התאים אשר עוד מאשר את תלות CYP של המטבוליזם לוק-CEE.
כימות של מטבוליטים CYP450 באמצעות UPLC-MS
איור 6 ממחיש את כימות של CYP2A6 / 2A13 פעילות תאים בדרכי הנשימה מ 3 תורמים (Airway M343, M345, M347) ותאי הכבד (קו חפ) לאחר הדגירה עם coumarin של נוכחות והיעדרות של inhibitor 8-methoxypsoralen. הם מנורמל עבור חלבון כולל. בשנת לשלוט הדגירה coumarin 0 דק ', לא 7-hydroxycoumarin מזוהה (6B איור). CYP2A6 / 2A13 בא לידי ביטוי constitutively ברקמות מסוימות ולכן אחרי 16 דגירת h עם היווצרות coumarin של 7-hydroxycoumarin מזוהה סוגי התאים השונים שנבדקו, אפילו בלי אינדוקציה. כאשר 8-methoxypsoralen, מעכב CYP2A מתווסף (איור 6), היווצרות של 7-hydroxycoumarin מצטמצם משמעותית.
יצוין כי בנוכחות המעכבת CYP, זה נורמלי עדיין לזהות כמה פעילות שיורית כמו עיכוב הוא לעתים נדירות שלם מאז CYPs האחר עלול גם להיות מסוגל לזהות את המצע אבל לעבד אותו הרבה פחות יעיל. ניתן לראות גם כי פעילות מטבולית רשמה יכול להיות שונה בין התורמים בעת שימוש תאים ראשוניים כפי שהוא נראה לעין עבור CYP2A6 בתאים בדרכי הנשימה(איור 6 ב). זה צפוי כפעילות CYP עלולה כל גנוטיפ פולימורפיזם של תורם.
איור 6: Assay פעילות תוצאה עבור CYP1A1 / 1B1 פעילות (א) ו- CYP2A6 / 2A13 פעילות (B) ב שורת תאים כבדיה וב שלוש Airway Cell תורם (M360, M370, M417). (א) לוק-CEE פעילות dealkylation מוצג עם ובלי אינדוקציה של CYP1A1 / 1B1 ידי TCDD. α-naphthoflavone שימש מעכב CYP1A1 / 1B1. פעילות מבוטאת ביחידות הארה יחסית (RLU) מתוקנן לפי זמן דגירה בתוך דקות (דקות) וחלבון כולל (מ"ג). (ב) CYP2A6 / 2A13 אינו דורש אינדוקציה כפי שהם באים לידי ביטוי constitutively. Coumarin פעילות 7-hydroxylation בחלבונים pmol / דקות / מ"ג מוצג בנקודות זמן שונות עם ובלי מעכב 8-methoxypsorאלן. כל התוצאות מוצגות כערך ממוצע של שלוש מדידות עצמאיות עם סטיות תקן של הממוצע. דמות זו שונתה מ בקסטר 20.
שולחן משלימה 1: UPLC וספקטרומטר הגדרות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
נכון לעכשיו, מערכות בדיקה טוקסיקולוגית סטנדרטיות רבות להשתמש בחיידקים מהונדסים, שורות תאים, או תאים עובריים כי הם אינם מייצגים את חילוף החומרים האנושיים הרגיל 1. זה יכול להוביל תחזיות מדויקות של הפעילות הרעילה הפוטנציאל של חומר כימי או רפואה. חדשני במודלים חוץ גופייה, כגון תרביות תאי 3D ו איבר על שבב, מפותחים בניסיון לשכפל את המורפולוגיה הנורמלית יותר ופעילות מטבולית של רקמות אנושיות 21, 22, 23. מיומנות מטבולית היא קריטריון אחד שיכול לשמש כדי לפענח איזה דגמים מתאימים ביותר ללימודי הערכה טוקסיקולוגית biotransformation סמים.
פרוטוקול גיבשנו במאמר זה נועד למדוד את הפעילות של אנזימים CYP באמצעות תאים חיים. היא גמישה ויכולה לשמש מערכות תאים שונות ב cultur 2D או 3Des ומציעה את האפשרות להשתמש גם probe- luminogenic או בגישה מבוססת ספקטרומטריית מסה. שני השיטות רגישות מספיק כדי לזהות כמויות ננוגרם של חומרים ורק דורש מספר קטן של תאים שגודלו במתכונת multiwell. הם יכולים להיות מיושמים גם אליפטית או תאים שגודלו מטריצות מורכבות. הבחירה של המצע החללי היא ללא ספק אלמנט קריטי של הפרוטוקול. הספציפיות של assay מסתמך על בדיקה להיות סלקטיבי של האנזים CYP ואת שכבה נוספת של ביטחון ניתן להשיג על ידי שימוש במעכבי CYP סלקטיבית. מצעי המעכבים המפורטים במאמר זה הם רק כמה דוגמאות, אבל אחרים ניתן למצוא בספרות.
חשוב לשקול מספר פעמי דגירה כאשר עובד עם סוג תא חדש כתוצאת מפעילות CYP שלילית יכול להיות בגלל האנזים לידי ביטוי ברמה נמוכה. התוספת של סוג תא שיכול לשמש כביקורת חיובית רצויה להבטיח כיתוצאה שלילית אינה קשורה לבעיה טכנית וכדי לעזור עם כל בעיות. תאי כבד ראשיים הם מוסמך מטבולית ויכולים לשמש מלא, עבור hepatocytes העיקרי למשל השעיה קלה מאוד להשתמש אך הכדאיות שלהם מוגבלת בזמן. שורות תאים כבדית הם חלופות אפשריות אשר קל יחסית להשתמש כמתואר בפרוטוקול זה, אך חלקם טובים יותר מאחרים מבחינת פעילות מטבולית 6, 21.
מאז assay אינה הורסת, אלא אם החלבון הכולל מכמתים, אפשר לעקוב אחר פעילות CYP לאורך זמן במחקרי אורך 20. זוהי נקודה חשובה מאחר שחלק מהתאים יהיו פעילות CYP משתנית לאורך זמן בתרבות. תוצאה שלילית עלולה להיות קשורה לחוסר confluency, התקדמות עם בידול או dedifferentiation במבחנה. במקרה כזה, הגישה היא חצי quantitative מאחר שהנתונים לא מנורמלים לפי כמות החלבון הכולל בכל תרבית תאים. זה לא תמיד אפשרי או מומלץ לעשות שימוש חוזר הרקמה לאחר מדידת פעילות CYP כחשיפת בדיקות, מעכבים או מעוררים יכול להיות השפעה רעילה על הרקמה כמו במקרה של TCDD.
שברים ניידים כגון microsomes יכולים לשמש גם כדי לאפיין את פעילות CYP של סוג תא נתון. גוּפִיפוֹן הכנות, לעומת זאת, דורשות הרבה חומר תא, התוספת של קו-פקטורים נאותים חיץ על מנת להבטיח כי האנזימים להישאר פעילים. שימוש בתאים חיים מבטלת את הצעד הכנה גוּפִיפוֹן מסובך ועבודה אילו מאגרים קו-פקטורים פועלים בצורה הטובה ביותר.
כהמלצה כללית, זהו נוהג טוב ביותר להמשיך לאפיין את פרופיל הביטוי של CYPs בתרביות תאים כדי לוודא שהוא תואם את הפעילות האנזימטית. רמת האימות נוספת זה מומלץ בהתחשב בכך בדיקות מטבוליות אינן entiלהסתמך ספציפי CYP אחת וזה נותן אמון מוגבר כי הפעילות המטבולית הנמדדת השתווה ביטוי האנזים המקביל. מאז CYPs הם חלבוני בממברנה הם קשים יחסית להתכונן כתמים מערביים, ולכן כמוני RT-PCR כבר הגישה המועדפת לפרופיל אנזימים אלה 20.
חשוב לציין כי פרוטוקול זה מתאר שיטה פעילות האנזים CYP assay שרק מייצג משפחה אחת אנזימים מטבוליים, אם כי חשוב אחד. הגמישות של גישה ספקטרומטריית מסה מאפשרת הפיתוח של שיטות רכישה עבור טרנספורמציות מטבוליות אחרות של מצעים חלליים. עם זאת, אלה יש לפתח אותם אחד בכל פעם, יש כיום פחות ידוע בדיקות ספציפיות ומעכבי סלקטיבית למשפחות אנזים מטבוליות אחרות. צריך להתייחס זה פער כדי לאפשר הערכה מקיפה של מיומנות מטבוליות של syste תא במבחנה בגברת.
Disclosures
AB ו EM היו עובדי בריטיש אמריקן טבק בזמנו כתב היד הזה נכתב. העבודה המתוארת כתב היד הזה מומן על ידי בריטיש אמריקן טבק, ודמי פרסום עבור וידאו-במאמר זה שולמו על ידי בריטיש אמריקן טבק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E.
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
