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Biochemistry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री और Luminogenic-आधारित दृष्टिकोण से चित्रित करें करने के लिए प्रथम चरण मेटाबोलिक की योग्यता Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55502
Automatic Translation
1, 1
1Research and Development, British American Tobacco

Summary

इन विट्रो प्रणालियों के मेटाबोलिक योग्यता biotransformation और दवाओं तथा विषाक्तता के स्वभाव के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम चरण मैं कोशिका संवर्धन में चयापचय का आकलन करने के संदर्भ चयापचय जांच के आवेदन का वर्णन।

Abstract

जीनोबायोटिक metabolizing एंजाइमों कार्य समूहों कि घुलनशीलता बढ़ाने के लिए और उत्सर्जन की सुविधा जोड़कर दवाओं तथा विषाक्तता के biotransformation में एक महत्वपूर्ण समारोह खेलते हैं। कुछ अवसरों पर उन संरचनात्मक संशोधनों नई विषाक्त उत्पादों के गठन के लिए ले जाते हैं। आदेश पशु परीक्षण कम करने के लिए, रासायनिक जोखिम पाचन सक्षम कोशिकाओं का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता। चयापचय एंजाइमों की अभिव्यक्ति है, तथापि, नहीं समय के साथ स्थिर विट्रो प्राथमिक संस्कृति प्रणालियों में कई में है और अक्सर आंशिक या सेल लाइनों में अनुपस्थित है। इसलिए, दवाओं, योजक, और इन विट्रो में पर्यावरण प्रदूषण चयापचय के अध्ययन आदर्श सेल सिस्टम जहां चयापचय गतिविधि बताया गया है में आयोजित किया जाना चाहिए। हम यहाँ रासायनिक जांच और उनके चयापचय उत्पादों UPLC मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रात्मक का उपयोग कर 2 डी सेल लाइनों और प्राथमिक 3 डी संस्कृतियों में चयापचय एंजाइमों के एक वर्ग की गतिविधि (मानव पहला चरण) को मापने के लिए एक दृष्टिकोण की व्याख्या औरluminometry। विधि सेल लाइनों और ऊतकों की एक किस्म से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं में चयापचय गतिविधि का परीक्षण करने के लागू किया जा सकता।

Introduction

जीनोबायोटिक चयापचय प्रक्रिया है जिसके माध्यम से शरीर के लिए विदेशी रसायन हाइड्रोफिलिक समूहों और conjugates के अलावा द्वारा संशोधित कर रहे हैं उनके उत्सर्जन 1 की सुविधा के लिए है। आमतौर पर xenobiotics के चयापचय मैं एक या एक से अधिक हाइड्रॉक्सिल समूहों 1, 2 के अलावा के साथ एक ऑक्सीकरण की ज्यादातर मिलकर चरण के साथ एक दो कदम प्रक्रिया है। द्वितीय चरण में, हाइड्रॉक्सिल समूहों के रूप में ऐसी glucuronide या सल्फेट आधा भाग 1, 2 के रूप में एक हाइड्रोफिलिक संयुग्म के लिए स्वीकार किया जाता है। एक स्वीकर्ता समूह पहले से ही अणुओं पर मौजूद न हो, विकार कदम चरण चयापचय की स्वतंत्र रूप से हो सकता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया एंजाइमों के एक विशिष्ट समूह, जैसे, CYPs (साइटोक्रोम P450s), कि hydroxylation को उत्प्रेरित (चित्रा 1) और रासायनिक substrates 3 की dealkylation द्वारा किया जाता है। Conjugation sulfotransferases द्वारा उत्प्रेरित होता है, यूडीपी glucuronosyltransferases (चित्रा 1), ग्लूटेथिओन-S-transferases और एन acetyltransferases 4। प्रत्येक ऊतक और अंग जिगर उन प्रोटीन का सबसे व्यक्त के साथ एक विशिष्ट चयापचय एंजाइम अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल है,।

आकृति 1
चित्र 1: प्रथम चरण और Coumarin के लिए द्वितीय चरण चयापचय का उदाहरण। CYP2A6 / कूमेरिन 7-hydroxylation को उत्प्रेरित CYP2A13। 7-hydroxycoumarin द्वितीय चरण एंजाइमों UGTs द्वारा एक glucuronide आधा भाग को संयुग्मित है, UGT1A6 और UGT1A9 उच्चतम गतिविधि दिखा साथ।

xenobiotics के चयापचय को समझना दवा सुरक्षा के मूल्यांकन में और दो कारणों के लिए रासायनिक जोखिम मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है: प्रतिक्रिया गतिकी का निर्धारण करेगा कब तक एक दवा या रासायनिक एक सक्रिय या निष्क्रिय रूप ख में शरीर में ही रहेगाefore उत्सर्जन; और माता पिता के परिसर चयापचय एंजाइमों से एक है, और अधिक प्रतिक्रियाशील अस्थिर और विषाक्त प्रजातियों के लिए संशोधित किया जा सकता। ऐसी प्रतिक्रियाएं भी रूप में "bioactivation" ज्ञात ज्यादातर चरण मैं एंजाइमों CYP लेकिन यह भी द्वितीय चरण विकार 5 से दुर्लभ अवसरों पर से प्रेरित हैं।

इस के आधार पर, एक इन विट्रो मॉडल की क्षमता सही रूप में एक दवा या एक रासायनिक के साथ जुड़े जोखिम की भविष्यवाणी करने के लिए सेल प्रणाली के चयापचय योग्यता पर बहुत निर्भर है। सेल लाइनों रोगग्रस्त ऊतकों से या सामान्य कोशिकाओं के परिवर्तन से प्राप्त अक्सर हिस्सा मूल 6 के अपने ऊतक के चयापचय एंजाइम प्रोफ़ाइल प्रतिनिधि के सभी नहीं तो खो देते हैं। सामान्य चयापचय एंजाइम प्रोफ़ाइल के रखरखाव के प्राथमिक सेल संस्कृतियों में बेहतर (कम से कम अल्पावधि संस्कृतियों में) प्रकट होता है और अगर ऊतक एक मैट्रिक्स वह अपने 3 डी संरचना 1 बनाए रखने के लिए अनुमति देता है में सुसंस्कृत है आगे सुधार हुआ है। इसलिए, चारएक इन विट्रो सेल प्रणाली के चयापचय योग्यता के acterization के बारे में निर्णय जो सेल मॉडल रासायनिक सुरक्षा मूल्यांकन का संचालन करने के लिए उपयुक्त है मार्गदर्शन में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है।

इस पत्र में हम एक यकृत सेल लाइन 7 और 3 डी प्राथमिक फेफड़ों कोशिका संवर्धन 8 के साथ अपने आवेदन के उदाहरण के साथ गतिविधि और इन विट्रो में प्रथम चरण CYP एंजाइमों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। CYP विशिष्ट substrates, उनके चयापचय उत्पादों और अवरोध करनेवाला नियंत्रण जन spectrometry- और luminogenic आधारित मात्रा तरीकों के साथ साथ वर्णित हैं। के बाद से कुछ CYPs inducible हैं और दूसरों को संघटित कर रहे हैं, उदाहरण भी उन दो स्थितियों के लिए दिया जाएगा।

Protocol

नोट: चयापचय गतिविधि परख के लिए सामान्य कार्यप्रवाह चित्र 2 में उल्लिखित है। इस कार्यप्रवाह के प्रत्येक चरण के बाद अगले पैराग्राफ में विस्तृत है। अभिकर्मकों और उपकरणों की विस्तृत टेबल सामग्री की तालिका में दिए गए हैं।

चित्र 2
चित्र 2: मेटाबोलिक जांच परख के लिए कार्यप्रवाह। कोशिकाओं वरीयता प्राप्त और पर्याप्त घनत्व की वृद्धि हुई है। एक CYP प्रेरण कदम एंजाइम गतिविधि यत्न किया पर निर्भर करता है की आवश्यकता हो सकती। जांच सब्सट्रेट और अवरोध करनेवाला सेल संस्कृति में जोड़ा जाता है। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, मध्यम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जाता है और कोशिकाओं प्रोटीन मात्रा के लिए lysed। मध्यम मास स्पेक्ट्रोमेट्री या luminometry द्वारा जांच सब्सट्रेट के चयापचय उत्पाद के विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है।विज्ञापन / 55,502 / 55502fig2large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. सेल संस्कृति

चित्र तीन
चित्र 3: यकृत सेल लाइन संस्कृति लाइट ट्रांसमिशन Micrography। सेल लाइन इस प्रोटोकॉल 5 में वर्णित आम तौर पर संस्कृति में cholangiocytes और हेपाटोसाइट्स के बीच एक 50% विभाजन (100x) के साथ अंतर। स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. यकृत सेल लाइन संस्कृति
    ध्यान दें: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यकृत सेल लाइन पाचन सक्षम कोशिकाओं का एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सेल लाइन वायरल संक्रमण 7 की वजह से एक हिपेटोकार्सिनोमा से निकाला गया था। Confluency पर, इस सेल लाइन (चित्रा 3) cholangiocyte- और hepatocyte तरह की कोशिकाओं में अलग और अधिक जानकारी के Guillouzo 7 में पाया जा सकता। संस्कृति मध्यम करने के लिए 2% DMSO के शामिल किए जाने के इस सेल लाइन और CYPs की एक किस्म की अभिव्यक्ति के भेदभाव का समर्थन करता है।
    1. तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं के साथ क्रायोजेनिक शीशियों निकालें और परिवहन के लिए सूखी बर्फ पर रखें। 1-2 मिनट के लिए एक जल स्नान पूर्व गरम करने के लिए cryovial स्थानांतरण 37 डिग्री सेल्सियस के लिए, और एक लामिना का प्रवाह हुड में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ शीशी के बाहर नसबंदी।
    2. जबकि बाँझ शर्तों के तहत काम कर रहे, ध्यान से किसी भी अतिरिक्त दबाव जारी है और 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम विलियम्स 'ई माध्यम की 9 एमएल से भरा एक 10 एमएल ट्यूब में क्रायोजेनिक शीशी की सामग्री विंदुक क्रायोजेनिक शीशी खोलें।
    3. कमरे के तापमान पर 400 XG पर 10 मिनट के लिए समाधान अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, और 5 एमएल में कोशिकाओं resuspendमालिकाना पिघलाव मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम, glutamine या glutamine पूरक (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) (विलियम्स 'ई + glutamine पूरक + पिघलाव की आपूर्ति करता है) के साथ पूरक।
    4. एक सेल काउंटर या किसी अन्य उपयुक्त सेल गणना तकनीक के साथ एक 500 μL विभाज्य का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    5. 0.6 x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं की एक घनत्व / में अच्छी तरह से पिघलाव माध्यम की 0.5 एमएल की एक अंतिम मात्रा में एक 24 अच्छी तरह से कोलेजन में लिपटे थाली में कोशिकाओं बीज।
    6. एक 5% / 95% सीओ 2 / हवा और 100% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट (रों) रखें।
    7. 24 घंटे कोशिकाओं बोने के बाद, पूर्व गरम रखरखाव / चयापचय काम कर रहे मध्यम के 0.5 एमएल (विलियम्स 'ई + glutamine पूरक + चयापचय पूरक (इस माध्यम को पहले से ही DMSO शामिल हैं)) के साथ मध्यम बदलें। मध्यम बदले हर दो दिन।
    8. संस्कृति में कुछ दिनों के बाद कोशिकाओं एक उप संगामी घरनदार संरचना (चित्रा 3) के रूप में। इष्टतम चयापचयगतिविधि आम तौर पर दिन के 7 और 10 के बीच मनाया जाता है और 4 दिन में सबसे कम है।

चित्रा 4
चित्र 4: Alcian ब्लू स्टेन्ड Airway एयर तरल इंटरफ़ेस 8 में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के क्रॉस धारा।
रोमक, बलगम निर्माण और बेसल कोशिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। स्केल बार = 250 सुक्ष्ममापी।

  1. विभेदित एयरवे उपकला संस्कृतियों
    नोट: प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरी तरह से अलग-अलग प्राथमिक एयरवे उपकला एक डालने 8 (चित्रा 4) पर एयर तरल इंटरफेस पर बड़े हो के साथ दिखाया गया है। टिशू कल्चर एक mucocilliary फेनोटाइप और सेल polarity 8 बरकरार रखती है। प्रकोष्ठों नाक या ब्रोन्कियल मूल के हो सकता है। इधर, मानव नाक की कोशिकाओं का उपयोग करें। कोशिकाओं 24 के साथ एक संस्कृति थाली प्रारूप पर दिया जाता हैएयर तरल इंटरफेस पर डाल देता है। परिवहन की सुविधा और मध्यम छलकाव आवेषण एक agarose मैट्रिक्स कल्चर माध्यम के साथ मिश्रित में एम्बेडेड बेसल अनुभाग के साथ भेज दिया जाता है से बचने के लिए।
    1. कोशिकाओं के वितरण पर, एक साफ लामिना का प्रवाह हुड में रखने से पहले एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ 24 आवेषण युक्त प्लेटें नसबंदी।
    2. पूर्व गर्म 700 μL मालिकाना कल्चर माध्यम जोड़कर एक बाँझ 24-अच्छी तरह से थाली तैयार करें।
    3. का उपयोग करते हुए बाँझ चिमटी धीरे agarose मैट्रिक्स से डालने dislodging द्वारा नई प्लेट माध्यम के साथ पहले से लोड करने के लिए सेल आवेषण हस्तांतरण।
    4. एक 5% / 95% सीओ 2 / हवा और 100% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट (रों) रखें।
    5. हर 2 दिनों के लिए आवेषण हस्तांतरण एक नया बाँझ 24-अच्छी तरह से थाली प्री-लोडेड 700 μL गर्म मालिकाना एयरवे सेल संस्कृति माध्यम के साथ।
    6. इस तरह के ट्रांस-उपकला प्रतिरोध (तीर), या के रूप में तरीकों, का उपयोग करते हुए वायु-मार्ग ऊतक की अखंडता का आकलन करेंसिलिया आवृत्ति (CBF) हरा एक खुर्दबीन के एक वीडियो लाइव इमेजिंग सिस्टम 9 के साथ लगे इस्तेमाल करते हैं। तीर और CBF की माप KUEHN 10 में वर्णित है।

कोशिका संवर्धन में 2. CYP गतिविधि मात्रा

नोट: एक सामान्य नियम के रूप में, इस तरह के DMSO और मेथनॉल के रूप में सॉल्वैंट्स अलग चयापचय जांच और अवरोधकों इस पत्र में प्रस्तुत के लिए शेयर समाधान तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि, यह एक न्यूनतम (1% या कम) के लिए संस्कृति माध्यम में अंतिम DMSO एकाग्रता रखने के लिए के बाद से उच्च सांद्रता चयापचय एंजाइमों बाधित कर सकते हैं सिफारिश की है। जब संभव हो, यह भी चयापचय जांच से गर्मी के दौरान फिनोल लाल मुक्त और सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करने के बाद से फिनोल लाल CYPs और द्वितीय चरण एंजाइम गतिविधि और सीरम घटक ऐसे एल्बुमिन जांच उपलब्धता कम कर सकते हैं के रूप में हस्तक्षेप कर सकते हैं सिफारिश की है। यह सख्ती से इन का पालन करने के हमेशा संभव नहीं है दिशा निर्देशों। उदाहरण के लिए, वायु-मार्ग सेल संस्कृति मध्यम स्वामित्व की है और फिनोल लाल शामिल हैं। मालिकाना यकृत सेल लाइन चयापचय मध्यम 7 पहले से ही 1% से अधिक DMSO शामिल के रूप में यह कोशिकाओं hepatocyte तरह फेनोटाइप को अपनाने के लिए के लिए आवश्यक है।

नोट: अंत में, यहाँ, अवधि विशिष्ट जांच / अवरोध करनेवाला प्रयोग किया जाता है लेकिन इस शब्दावली सावधानी के साथ विचार किया जाना है। वास्तव में, यह बहुत दुर्लभ है एक चयापचय जांच एक एंजाइम अनन्य सब्सट्रेट होने के लिए। जांच यहाँ वर्णित है, तथापि, उनके एंजाइम लक्ष्य के लिए एक उच्च आकर्षण है और इसलिए गतिविधि के विश्वसनीय मार्कर के रूप में माना जाता है।

  1. मेटाबोलिक जांच, inducers, और अवरोधकों
    1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित तरीकों का उपयोग कर जांच
      नोट: जांच और अवरोधकों इस खंड में वर्णित CYP2As 11 की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त हैं, CYP1A2 12,रेफरी "> 13, CYP2B6 7, 14 CYP2F1 15, 16, और 17 CYP2E1 UPLC-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा। जांच, अवरोधकों और इसी CYP इसी संदर्भ के साथ तालिका 1 में वर्णित हैं। तालिका 1 भी CYP के चयापचय उत्पाद को सूचीबद्ध करता है गतिविधि है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है। टिशू कल्चर में इस्तेमाल के लिए टिशू कल्चर और समाधान से जुड़े सभी काम एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में किया जा रहा है। एक शेयर समाधान सभी जांच substrates के लिए DMSO में तैयार किया जा सकता।
      1. प्रयोग करने से पहले सेल प्रविष्ट करता है या कुओं के दो श्रृंखला, केवल चयापचय जांच के लिए अन्य तैयार, निषेध प्रयोग के लिए एक श्रृंखला का उपयोग करें। एक मध्यम खाली नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं की एक तीसरी श्रृंखला तैयार करें। वे अलग प्लेटों पर या तीन प्रतिकृति की एक न्यूनतम के साथ एक ही प्लेट में हो सकता है। थाली का एक उदाहरण रखनाबाहर चित्रा 5 में प्रस्तुत किया है।
      2. प्रयोग के दिन, ताजा माध्यम के 450 μL के साथ सेल संस्कृति मध्यम बदलें।
      3. एक बाँझ हुड सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग निम्नलिखित समाधान की एक 10x एकाग्रता में तैयार करें। मिक्स 10x CYP जांच, 10x CYP अवरोध करनेवाला, और 10x CYP अवरोध करनेवाला के साथ साथ 10x जांच।
        नोट: अवरोध करनेवाला और जांच के मास्टर स्टॉक समाधान (जैसे, 1,000x शेयरों) और आगे मीडिया में पतला आदेश सेल संस्कृति के साथ 1% से अधिक की एक अंतिम DMSO एकाग्रता से बचने के लिए एक 10x समाधान प्राप्त करने के लिए 100% DMSO में तैयार किया जा सकता । अंतिम 1x सांद्रता कि कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन के लिए उद्देश्य से कर रहे हैं तालिका 1 में दिखाया जाता है।
      4. एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ विभिन्न 10x जांच समाधान फ़िल्टर।
      5. निषेध प्रयोग और 30 मिनट के लिए पूर्व सेते के लिए तैयार कोशिकाओं की श्रृंखला के लिए 10x CYP अवरोध करनेवाला युक्त मध्यम के 50 μL जोड़ें।
      6. आरताजा माध्यम के 450 μL के साथ निषेध श्रृंखला में कोशिकाओं के मध्यम eplace और दोनों 10x CYP अवरोध करनेवाला और 10x जांच सब्सट्रेट युक्त मध्यम के 50 μL जोड़ें।
      7. अन्य कोशिकाओं 10x जांच सब्सट्रेट के साथ मध्यम के 50 μL में जोड़े और जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है (जैसे, DMSO) खाली सेल नियंत्रण के लिए माध्यम में पतला वाहन के बराबर राशि जोड़ें।
      8. 5 मिनट (समय 0, पृष्ठभूमि नियंत्रण) और सेल इनक्यूबेटर में 16 ज - 0 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
        नोट: यह ऊष्मायन समय एयरवे कोशिकाओं और यकृत कोशिका लाइन के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था, हालांकि ताजा प्राथमिक हेपाटोसाइट्स एक उच्च चयापचय योग्यता है, सेल तैयारी की गुणवत्ता और दाता की आनुवंशिक मेकअप, इसलिए कम बार लंबित (जैसे, 2-4 ज) उपयुक्त हो सकता है। यह हमेशा जब विभिन्न सेल लाइनों या प्रकार की कोशिकाओं का परीक्षण एक समय बेशक प्रयोग को करने के लिए सिफारिश की है।
      9. ऊष्मायन अवधि, coll के अंत मेंect जांच के चयापचय उत्पाद की मात्रा के लिए अलग लेबल ट्यूब में मध्यम। भविष्य के प्रसंस्करण के लिए मध्यम फ्रीज।
      10. ल्य्से प्रोटीन मात्रा के लिए कोशिकाओं।
        नोट: किसी भी मानक प्रोटीन मात्रा किट और प्रोटोकॉल इस चरण के लिए उपयुक्त है। बीसीए एक उपयुक्त विकल्प है। कोशिकाओं एक और परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए है, तो यह चरण वैकल्पिक है।
    2. मध्यम उपचार
      ध्यान दें: मध्यम ऊष्मायन मंच से एकत्र माता पिता जांच रासायनिक और साथ ही अपनी चयापचय उत्पादों में शामिल है। एक विशिष्ट CYP गतिविधि को मापने के लिए केवल प्रतिक्रिया ब्याज की CYP द्वारा उत्प्रेरित की उत्पाद मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रथम चरण चयापचय उत्पादों अक्सर द्वितीय चरण चयापचय (विकार) के साथ मिलकर कार्रवाई की जाती है और इसलिए इस तरह के रूप में पता लगाया नहीं जा सकता। इस प्रकार के लिए एक CYP गतिविधि के लिए सबसे सही मात्रा प्राप्त करने के लिए, एक deconjugation कदम किसी भी दूर करने के लिए आवश्यक हैद्वितीय चरण चयापचय संशोधन। जब से मैं चयापचयों चरण के संयोजन अक्सर glucuronidation या सल्फेशन शामिल है, deconjugation glucuronidases द्वारा नमूनों की उपचार के द्वारा प्राप्त किया और 18 sulfatases है। Glucuronidase और sulfatase गतिविधि पीएच उच्चतम glucuronidase गतिविधि के साथ निर्भर पीएच 4.5-5.0 और sulfatase गतिविधि जा रहा है पीएच 6.0-6.5 पर उच्चतम पर प्राप्त किया जा रहा है। इसलिए, इस चरण पीएच समायोजन की आवश्यकता है। में विधि यहाँ वर्णित है, हम व्यावहारिक कारणों के बाद से सबसे पीएच मीटर जांच एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में फिट नहीं है के लिए पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग कर पीएच को मापने। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएच स्ट्रिप्स 0.3 0.2 पीएच इकाइयों के रूप में के रूप में कम एक संकल्प के साथ पाया जा सकता है।
      1. एक 1.5 एमएल microtube के लिए ऊष्मायन माध्यम के 250 μL स्थानांतरण और 4-methylumbelliferone आंतरिक मानक स्टॉक समाधान जोड़ने के 100 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए।
      2. 1 एम एचसीएल जोड़कर 4.5-5.0 करने के लिए माध्यम के पीएच को समायोजित करें। एक समय में एचसीएल के 1 μL जोड़ें और पीएच की पुष्टिपीएच पट्टी पर माध्यम की 2 μL pipetting द्वारा। आम तौर पर 5.0 की एक पीएच होगा पहुँचना 5-10 1 एम एचसीएल की μL से अधिक नहीं की आवश्यकता है।
      3. Β-glucuronidase / हेलिक्स pomatia से arylsulfatase की 150 इकाइयों (एक 85,000 इकाई / एमएल स्टॉक के 1.8 μL) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। ठंड मेथनॉल के 250 μL जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो (-20 डिग्री सेल्सियस)। -20 डिग्री सेल्सियस या प्रक्रिया आगे पर नमूने संग्रहित करें।
      4. 45 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र का उपयोग कर विलायक लुप्त हो। पानी समाधान: एक 30% acetonitrile के 500 μL के साथ नमूने Reconstitute। नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार कर रहे हैं और अंबर ग्‍लास की शीशियों में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रा
      नोट: सभी UPLC और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स समर्पित पूरक तालिका 1 में विस्तृत कर रहे हैं। एक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, एक अंशांकन वक्र स्थापित करने की आवश्यकता है। कैलीbration वक्र परिसर के एक ज्ञात कमजोर पड़ने रेंज चल मात्रा निर्धारित किया जा करने के द्वारा प्राप्त की है। इस मामले में, अंशांकन घटता 10 विभिन्न सांद्रता (तालिका 2), जिनमें से कम से कम 6 रैखिक सीमा 19 से 20% के भीतर होना चाहिए से अधिक उत्पन्न किया गया। पता लगाने के निम्नतम स्तर सबसे कम एकाग्रता जो एक संकेत से अधिक है, या औसत पृष्ठभूमि संकेत 3 गुना के बराबर देता है के रूप में निर्धारित किया जाता है। मात्रा के निम्नतम स्तर सबसे कम एकाग्रता का नमूना है जो एक संकेत अधिक से अधिक, या 10x औसत पृष्ठभूमि संकेत जो दोनों के तीन प्रतियों के नमूने के साथ कम से कम 3 स्वतंत्र रन से अधिक निर्धारित कर रहे हैं के बराबर देता है के रूप में निर्धारित किया जाता है।
      1. आंतरिक मानक सहित तालिका 2 के अनुसार टिशू कल्चर माध्यम में एक कृत्रिम मेटाबोलाइट का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करें। मानक कमजोर पड़ने प्रति 250 μL के अंतिम मात्रा पर्याप्त है।
      2. सेंट में वर्णित के रूप मानक के सीरियल dilutions लुप्तईपी 2.1.2.4 और resuspend 30% acetonitrile की एक मात्रा में: मीडिया पहले वाष्पीकरण की मात्रा के पानी बराबर (जैसे, 250 μL 30% acetonitrile: पानी अगर शुरू कर मानक समाधान माध्यम के 250 μL) था।
      3. UPLC-एमएस autosampler में इंजेक्शन के लिए एक एम्बर UPLC गिलास शीशी के लिए प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने मानक के 250 μL जोड़ें।
      4. परीक्षण के नमूने (250 μL) UPLC शीशियों एम्बर और उन्हें UPLC autosampler में जोड़ने के लिए जोड़ें।
      5. सभी शीशियों अनियमित करें।
        नोट: जन स्पेक्ट्रोमीटर विन्यास हम इस्तेमाल किया एक UPLC पूरक तालिका 1 में विस्तृत करने के लिए मिलकर एक संकर ट्रिपल quadrupole / रैखिक आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर है। अन्य प्लेटफार्मों विभिन्न सॉफ्टवेयर और विन्यास के लिए होता है लेकिन मात्रा प्रदर्शन करने के लिए इसी तरह के कदम का अनुसरण करेगी।
      6. UPLC-एमएस सेटिंग्स पूरक तालिका 1 अंदाजा लगाना विशिष्ट जांच पर निर्भर करता है में दिए गए विवरण का उपयोग कर चलाएँ।
      7. उपयोग"quantitate - Quantitation विधि का निर्माण" बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर मात्रा उपकरणों में उपकरण (सामग्री की तालिका) का अधिग्रहण किया सिंथेटिक मानक और आंतरिक मानक से अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए।
      8. नमूना बैच और नमूने यों और निष्पादित "Quantitation विधि" करने के लिए चुनने के लिए "Quantitation जादूगर" का प्रयोग करें। जन स्पेक्ट्रोमीटर मात्रा सॉफ्टवेयर प्रत्येक परीक्षा नमूने में लक्ष्य यौगिक के quantitation मूल्यों के साथ एक स्प्रेडशीट प्रदर्शित करता है।
    4. Luminescence आधारित तरीकों का उपयोग कर जांच
      नोट: Luminogenic जांच CYP गतिविधियों की एक श्रृंखला को मापने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, हालांकि, नहीं सभी सेल आधारित assays के लिए उपयुक्त हैं। इधर, एक प्रोटोकॉल CYP1A1 / CYP1B1 की गतिविधि को मापने के लिए प्रस्तुत किया है। CYP1A1 / 1B1 कैसे inducible CYPs की गतिविधि परख करने के लिए और कैसे luminogenic जांच एक बदलने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण देने के लिए वर्णन करने के लिए चयनित किया गया थामास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विधियों के मूल निवासी। तालिका 3 सांद्रता और ऊष्मायन समय हम एयरवे कोशिकाओं और यकृत सेल लाइन के लिए इस्तेमाल का सारांश दिया; हालांकि, उन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाना हो सकता है। अन्य luminogenic जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और CYPs की एक किस्म के लिए substrates के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता।
      1. एक गैर प्रेरित नियंत्रण, एक प्रेरित परीक्षण, और एक प्रेरित + अवरोध करनेवाला परीक्षण शामिल करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं तैयार करें। एक थाली लेआउट का एक उदाहरण चित्रा 5 ब में दिखाया गया है।
      2. CYP1A1 / 1B1 को प्रेरित करने के लिए एक अंतिम 72 घंटे की अवधि के लिए माध्यम में 10 एनएम TCDD की एकाग्रता के साथ कोशिकाओं सेते (24 से 48 घंटे की छोटी अवधि के भी उपयुक्त हो सकता है)।
        चेतावनी: TCDD एक कैसरजन और अपरूपजनन है। पर्याप्त सुरक्षा उपकरण पहनें, सप्लायर एमएसडीएस शीट की समीक्षा करने और उपयोग करने से पहले एक जोखिम मूल्यांकन प्रदर्शन करते हैं।
      3. इस अवधि के बाद, मध्यम हटाने पीबीएस 3 बार के साथ कुओं कुल्ला, और कुछ ताजा मध्यम जोड़ें।
      4. पीआरआईओआर luminogenic रिपोर्टर जांच के साथ कोशिकाओं विकासशील करने के लिए, प्रेरित कोशिकाओं के नामित सबसेट 30 मिनट के लिए 10 माइक्रोन CYP1A1 / 1B1 अवरोध करनेवाला, α-naphthoflavone की एक अंतिम एकाग्रता के साथ पहले से सेते हैं, माध्यम में।
      5. गैर प्रेरित, प्रेरित, और प्रेरित + अवरोध करनेवाला कोशिकाओं को 50 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता पर luminogenic जांच ल्यूक-CEE (Luciferin 6'-chloroethyl ईथर) जोड़ें।
      6. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं। ऊष्मायन समय के अंत में luminogenic जांच के मात्रा निर्धारण के लिए मध्यम इकट्ठा।
      7. स्थानांतरण एक सफेद अपारदर्शी 96 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति के माध्यम के 25 μL और luciferin पता लगाने अभिकर्मक निर्माता द्वारा आपूर्ति का 25 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। तुरंत एक luminometer का उपयोग कर प्लेट पढ़ें।
      8. पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला और कुल प्रोटीन मात्रा के लिए lyse।
        ध्यान दें: यह चरण वैकल्पिक है यदि जीवित कोशिकाओं भविष्य प्रयोगों के लिए रखे जाते हैं। मैंटी हालांकि ध्यान दें कि इस तरह के TCDD रूप inducers विषाक्त कर रहे हैं और कोशिकाओं को नुकसान महत्वपूर्ण है।

तालिका एक
तालिका 1: उनकी संगत एनजाइम साथ मेटाबोलिक जांच, उत्पाद, और इनहिबिटर्स की सूची। आणविक भार और वायु-मार्ग और यकृत कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया सिफारिश की सांद्रता भी दर्शाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: सुझाए गए 24-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट एक CYP परख प्रदर्शन करने के। (ए) CYPs constitutively व्यक्त के लिए सिफारिश की लेआउट खाली माध्यम के लिए कुओं की एक श्रृंखला शामिल, चयापचय जांच, और चयापचय जांच के साथ साथ अवरोध करनेवाला। यह लेआउट समय बिंदुओं की संख्या है कि परीक्षण किया जा रहा से गुणा किया जा सकता है। (बी) inducible CYPs के लिए उदाहरण के लेआउट एक माध्यम खाली के लिए अच्छी तरह से की एक श्रृंखला, एक चयापचय जांच केवल नियंत्रण, प्रेरित कोशिकाओं (जैसे, TCDD के साथ) जांच से इनक्यूबेट और जांच और एक अवरोध करनेवाला के साथ इनक्यूबेट भी शामिल है।

सारणी 2
तालिका 2: सिंथेटिक अंशांकन वक्र और संबंधित LODs और LOQs के लिए इस्तेमाल किया मानकों के कमजोर पड़ने। उपयोग करने के लिए कमजोर पड़ने रेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच और संवेदनशीलता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यहाँ, हम एक संकर ट्रिपल quadrupole / रैखिक आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर एक UPLC से जुड़ा हुआ करते थे। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

टेबल तीन
तालिका 3: Luminogenic जांच, प्रेरक और CYP1A1 के लिए एफडीए / 1B1 परख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

चयापचय गतिविधि के उदाहरण दो CYPs की (CYP1A1 / 1B1 / 2A13 और CYP2A6) तीन अलग अलग दाताओं (एयरवे M360, M370, M417) और यकृत सेल लाइन (हेप लाइन) से एयरवे कोशिका संवर्धन में जोड़े के लिए मापा जाता चित्रा 6 में दिखाया जाता है 20।

CYP गतिविधि luminometry द्वारा मापा
चित्रा 6A रिश्तेदार चमक एयरवे कोशिकाओं में ल्यूक-CEE (Luciferin 6'-chloroethyl ईथर) (3 दाताओं) और के साथ और TCDD प्रेरण बिना यकृत कोशिकाओं की CYP1A1 / 1B1 O-dealkylation गतिविधि द्वारा उत्पादित को दर्शाता है। CYP1A1 / 1B1 अत्यधिक inducible एंजाइमों होते हैं और आमतौर पर सबसे ऊतकों में एक संघटित स्तर पर व्यक्त नहीं कर रहे हैं। जैसा कि चित्र 6A में देखा जा सकता है, कोई luminogenic संकेत जब कोशिकाओं प्रेरित नहीं कर रहे हैं का पता चला है। दोनों प्रकार की कोशिकाओं TCDD, एक मजबूत CYP1A1 / 1B1 प्रेरक, एक निशान के साथ पहले से इनक्यूबेट कर रहे हैंएड luminogenic संकेत नियंत्रण (चित्रा 6A) की तुलना में पता चला है। यह बताता है कि ल्यूक-CEE जांच luciferin आधा भाग जो बाद में मात्रा निर्धारित है की रिहाई के लिए अग्रणी metabolized किया गया है। कुल मिलाकर TCDD इलाज किया यकृत सेल लाइन से गतिविधि कुल प्रोटीन सामान्यीकरण के बाद भी वायु-मार्ग की कोशिकाओं के लिए की तुलना में कम है। यह असामान्य के बाद से सेल लाइनों कम प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में पाचन सक्रिय हो जाते हैं नहीं है। α-naphthoflavone के अलावा सभी प्रकार की कोशिकाओं जो आगे ल्यूक-CEE चयापचय की CYP-निर्भरता की पुष्टि करता है में CYP1A1 / 1B1 गतिविधि पर एक स्पष्ट निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है।

UPLC-एमएस का उपयोग कर CYP450 चयापचयों के मात्रा
चित्रा 6B inhi की उपस्थिति में कूमेरिन और अभाव के साथ ऊष्मायन के बाद 3 दाताओं (एयरवे M343, M345, M347) और यकृत कोशिकाओं (हेप लाइन) से एयरवे कोशिकाओं में CYP2A6 / 2A13 गतिविधि की मात्रा को दिखाता हैbitor 8 Methoxypsoralen। डेटा कुल प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत है। 0 मिनट कूमेरिन ऊष्मायन नियंत्रण में, कोई 7-hydroxycoumarin (चित्रा 6B) का पता चला है। CYP2A6 / 2A13 कुछ ऊतकों में constitutively व्यक्त कर रहे हैं और 7-hydroxycoumarin की कूमेरिन गठन के साथ 16 इसलिए बाद ज ऊष्मायन, परीक्षण किया विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में पाया जाता है और भी प्रेरण के बिना। जब 8 Methoxypsoralen, एक CYP2A अवरोध करनेवाला जोड़ा जाता है (चित्रा 6B), 7-hydroxycoumarin के गठन काफी कम हो जाता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि CYP अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में, यह अभी भी कुछ अवशिष्ट गतिविधि का पता लगाने के लिए सामान्य है निषेध शायद ही कभी पूरा हो गया है और के बाद से अन्य CYPs भी सब्सट्रेट पहचान लेकिन अब तक कम कुशलतापूर्वक इसे संसाधित करने में सक्षम हो सकता है के रूप में। यह भी देखा जा सकता है कि दर्ज की चयापचय गतिविधि दाताओं के बीच अलग है जब प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग कर के रूप में यह एयरवे कोशिकाओं में CYP2A6 के लिए दिख रहा है हो सकता है(चित्रा 6B)। यह आशा की जाती है के रूप में CYP गतिविधि प्रत्येक दाता के जीनोटाइप और बहुरूपताओं के लिए उत्तरदायी है।

चित्रा 6
चित्र 6: गतिविधि परख CYP1A1 के लिए परिणाम / 1B1 गतिविधि (ए) और यकृत सेल लाइन में और तीन Airway सेल दाताओं (M360, M370, M417) में CYP2A6 / 2A13 गतिविधि (बी)। (ए) ल्यूक-CEE dealkylation गतिविधि के साथ और TCDD द्वारा CYP1A1 / 1B1 के शामिल होने के बिना दिखाया गया है। α-naphthoflavone CYP1A1 / 1B1 अवरोध करनेवाला के रूप में इस्तेमाल किया गया था। गतिविधि रिश्तेदार चमक इकाइयों (RLU) के मिनट (न्यूनतम) में ऊष्मायन समय द्वारा सामान्यीकृत और कुल प्रोटीन (मिलीग्राम) के रूप में व्यक्त किया जाता है। (बी) CYP2A6 / 2A13 प्रेरण की आवश्यकता नहीं है क्योंकि वे constitutively व्यक्त कर रहे हैं है। pmol / मिनट / मिलीग्राम प्रोटीन में Coumarin 7-hydroxylation गतिविधि के साथ और अवरोध करनेवाला 8 methoxypsor बिना अलग समय बिंदुओं पर दिखाया गया हैएलेन। सभी परिणाम मतलब की मानक विचलन के साथ तीन स्वतंत्र माप का मतलब है एक मूल्य के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा बैक्सटर 20 से संशोधित किया गया था।

पूरक तालिका 1: UPLC और जन स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान में, कई मानकीकृत जहर परीक्षण सिस्टम इंजीनियर बैक्टीरिया, सेल लाइनों, या भ्रूण कोशिकाओं कि सामान्य मानव चयापचय 1 के प्रतिनिधि नहीं हैं का उपयोग करें। यह एक रासायनिक या दवा के संभावित विषाक्त गतिविधि का गलत भविष्यवाणियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस तरह 3 डी सेल संस्कृतियों और एक चिप पर अंग के रूप में इन विट्रो मॉडल, में अभिनव, बेहतर सामान्य आकृति विज्ञान और मानव ऊतकों 21, 22, 23 की चयापचय गतिविधि को दोहराने के प्रयास में विकसित किया जा रहा। मेटाबोलिक योग्यता एक कसौटी यह है कि समझने के लिए जो मॉडल सबसे अच्छा जहर मूल्यांकन और दवा biotransformation के अध्ययन के लिए अनुकूल हैं इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल हम इस पत्र में रेखांकित किया है जीवित कोशिकाओं का उपयोग कर CYP एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए बनाया गया है। यह लचीला है और 2 डी या 3 डी संस्कृतियों में अलग सेल प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जा सकताes और या तो एक luminogenic probe- या एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करें विकल्प प्रदान करता है। दोनों ही तरीकों से काफी संवेदनशील सामग्री की nanogram मात्रा का पता लगाने के लिए और केवल एक multiwell प्रारूप में उगाई जाने वाली कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है। उन्होंने यह भी उपगोल करने के लिए या लागू किया जा सकता कोशिकाओं जटिल मैट्रिक्स में वृद्धि हुई। जांच सब्सट्रेट के चयन स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण तत्व है। परख की विशिष्टता जांच CYP एंजाइम और आश्वासन की एक और परत के चुनिंदा जा रहा है एक चयनात्मक CYP अवरोध करनेवाला के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता पर निर्भर करता है। substrates और इस पत्र में सूचीबद्ध अवरोधकों सिर्फ कुछ उदाहरण हैं, लेकिन दूसरों के साहित्य में पाया जा सकता है।

यह जब एक नकारात्मक CYP गतिविधि परिणाम के रूप में एक नया सेल प्रकार के साथ काम करने के कारण हो सकता करने के लिए एंजाइम एक निम्न स्तर पर व्यक्त की जा रही कई ऊष्मायन बार विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक सेल प्रकार है कि एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता के अलावा है कि एक सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती हैनकारात्मक परिणाम किसी तकनीकी समस्या के और किसी भी समस्या का निवारण करने जुड़ा हुआ नहीं है। प्राथमिक यकृत कोशिकाओं पाचन सक्षम हैं और निलंबन में उदाहरण प्राथमिक हेपाटोसाइट्स के लिए, नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता उपयोग बहुत ही आसान कर रहे हैं लेकिन उनकी व्यवहार्यता समय में सीमित है। यकृत सेल लाइनों संभव विकल्पों जो अपेक्षाकृत रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन कुछ चयापचय गतिविधि 6, 21 के मामले में दूसरों से बेहतर हैं।

के बाद से परख गैर विनाशकारी, जब तक कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित किया जाता है, यह अनुदैर्ध्य अध्ययन 20 में समय के साथ CYP गतिविधि का पालन करना संभव है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है क्योंकि कुछ कोशिकाओं संस्कृति में समय के साथ चर CYP गतिविधि होगा। एक नकारात्मक परिणाम भेदभाव या इन विट्रो में dedifferentiation साथ confluency की कमी, प्रगति के साथ जुड़ा हो सकता है। उस मामले में, दृष्टिकोण अर्द्ध quantitati हैve के बाद से डेटा प्रत्येक सेल संस्कृति में प्रोटीन की कुल राशि के आधार पर सामान्यीकृत नहीं है। यह जांच, inhibitors या inducers के लिए जोखिम के रूप में CYP गतिविधि को मापने के ऊतक पर एक जहरीले प्रभाव हो सकता है के रूप में TCDD के लिए मामला है के बाद ऊतक का पुन: उपयोग करने के लिए संभव है या सिफारिश की हमेशा नहीं है।

इस तरह के microsomes के रूप में सेल अंशों भी जब किसी सेल प्रकार के CYP गतिविधि चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Microsome तैयारी, हालांकि, सेल सामग्री, पर्याप्त सहकारकों के अलावा के एक बहुत आवश्यकता होती है और यह सुनिश्चित करें कि एंजाइमों सक्रिय रहते हैं बफ़र। जीवित कोशिकाओं का उपयोग करना मुश्किल microsome तैयारी चरण निकल और बाहर काम कर रहा है जो बफ़र्स और सहकारकों सबसे अच्छा काम करते हैं।

एक सामान्य सिफारिश के रूप में, यह एक सबसे अच्छा अभ्यास आगे कोशिका संवर्धन में CYPs की अभिव्यक्ति प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए है कि यह एंजाइमी गतिविधि से मिलान सत्यापित करने के लिए है। सत्यापन के इस अतिरिक्त स्तर को देखते हुए अनुशंसित है कि चयापचय जांच Enti नहीं कर रहे हैंएक भी CYP के लिए विशिष्ट भरोसा करते हैं और यह बढ़ विश्वास है कि मापा चयापचय गतिविधि इसी एंजाइम अभिव्यक्ति के अनुरूप है देता है। चूंकि CYPs झिल्ली प्रोटीन हैं वे पश्चिमी दाग के लिए तैयार करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल हो जाता है, इसलिए मात्रात्मक आरटी-पीसीआर पसंदीदा दृष्टिकोण इन एंजाइमों 20 प्रोफ़ाइल किया गया है।

यह नोट करना इस प्रोटोकॉल परख CYP एंजाइम गतिविधि है कि केवल चयापचय एंजाइमों के एक परिवार का प्रतिनिधित्व करता है, एक महत्वपूर्ण यद्यपि के लिए एक विधि का वर्णन करता है कि महत्वपूर्ण है। एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के लचीलेपन जांच substrates के अन्य चयापचय परिवर्तनों के लिए अधिग्रहण विधियों के विकास की अनुमति देता है। हालांकि, उन एक समय में एक से विकसित किया जाना है और वहाँ वर्तमान में कम जाना जाता विशिष्ट जांच और अन्य चयापचय एंजाइम परिवारों के लिए चयनात्मक inhibitors हैं। इस अंतर को इन विट्रो सेल syste के चयापचय योग्यता के लिए एक व्यापक मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए संबोधित किया जाना चाहिएसुश्री।

Disclosures

अटल बिहारी और ईएम समय इस पांडुलिपि लिखा गया था पर ब्रिटिश अमेरिकन टोबैको के कर्मचारी थे। इस पांडुलिपि में वर्णित काम ब्रिटिश अमेरिकन टोबैको द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और इस वीडियो-लेख के प्रकाशन फीस ब्रिटिश अमेरिकन टोबैको द्वारा भुगतान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent & Cells
2 μm syringe filter Whatman UN203NPEORG
24 well plate Corning 3524
4-methylumbelliferone Sigma Aldrich M1381
5-phenyl pentyne Sigma Aldrich CD5001437
6-hydroxybupropion Sigma Aldrich H3167
6-hydroxychlorzoxazone Sigma Aldrich UC148
7-ethoxycoumarin Sigma Aldrich 195642
7-hydroxycoumarin Sigma Aldrich H24003
8-methoxypsoralen Sigma Aldrich M3501
acetic acid Sigma Aldrich 695092
acetonitrile Fisher A/0626/17
α-naphthoflavone Sigma Aldrich N5757
BCA kit Thermo Scientific 23227
b-glucuronidase/arylsulfatase Sigma Aldrich G0876
Bupropion Sigma Aldrich B102
Carbamazepine Sigma Aldrich C4024
chlorzoxasone Sigma Aldrich C4397
collagen Cell Systems 5005-B
coumarin Sigma Aldrich C4261
disulfiram Sigma Aldrich 86720
fluvoxamine Sigma Aldrich F2802
Glutamax (Glutamine supplement) Fisher 35050061
HepaRG metabolism supplement Merck MMAD621
HepaRG thaw media supplement Merck MMADD671
HepaRG Merck MMHPR116
Luciferin-CEE Promega V8751
methanol Fisher M/4056/17
MucilAir airway cells Epithelix EP01
MucilAir airway cells maintenance media Epithelix EP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A Phenomenex 00B-4477-AN
TCDD Sigma Aldrich 48599
thioTEPA Sigma Aldrich T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm Waters 86003538
Williams’ E media Fisher 17704-024
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
UPLC Waters Acquity
QTRAP MS Sciex  ABI Sciex 4000
QTRAP MS software Sciex  Analyst 1.4.2
luminometer Molecular Devices SpectraMax M3
spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax M3
cell counter Beckman Coulter Vi-Cell XR
rotary evaporator Eppendorf Eppendorf-5301

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References

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जैव रसायन अंक 121 Bioactivation चयापचय, विष विज्ञान CYP
मास स्पेक्ट्रोमेट्री और Luminogenic-आधारित दृष्टिकोण से चित्रित करें करने के लिए प्रथम चरण मेटाबोलिक की योग्यता<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सेल संस्कृतियों
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Baxter, A., Minet, E. Mass… More

Baxter, A., Minet, E. Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures. J. Vis. Exp. (121), e55502, doi:10.3791/55502 (2017).

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