Summary
Metabolsk kompetansen av in vitro-systemer er en viktig forutsetning for biotransformasjonen og disponering av narkotika og giftstoffer. I denne protokollen beskriver vi anvendelse av referanse metabolske prober for å vurdere fase I metabolisme i cellekulturer.
Abstract
Xenobiotiske metaboliserende enzymer spiller en nøkkelfunksjon i biotransformasjonen av medisiner og giftstoffer ved tilsetning av funksjonelle grupper som øker oppløseligheten og letter utskillelsen. I noen tilfeller er disse strukturelle endringer føre til dannelse av nye giftige produkter. For å redusere dyreforsøk, kan kjemisk risiko vurderes ved hjelp av metabolsk kompetente celler. Ekspresjon av metabolske enzymer, men er ikke stabil over tid i mange in vitro-primærkultursystemer og er ofte delvis eller fraværende i cellelinjer. Derfor bør studiet av legemidler, additiver, og miljøgifter metabolisme in vitro ideelt sett være utført i cellesystemer hvor stoffskifteaktivitet er blitt karakterisert. Vi forklarer her en metode for å måle aktiviteten til en klasse av metabolske enzymer (human fase I) i 2D-cellelinjer og primære 3D-kulturer ved anvendelse av kjemiske sonder og deres metabolske produkter kvantifiserbare ved UPLC massespektrometri ogluminometry. Fremgangsmåten kan implementeres for å teste den metabolske aktiviteten i cellelinjer og primære celler avledet fra en rekke forskjellige vev.
Introduction
Xenobiotisk metabolisme er den prosessen som kjemikalier som er fremmede for legemet blir modifisert ved tilsetning av hydrofile grupper og konjugater for å lette deres utskillelse 1. Typisk metabolismen av xenobiotika er en to-trinns prosess med fase I som består hovedsakelig av en oksydasjon med tillegg av en eller flere hydroksylgrupper 1, 2. I fase II, blir hydroksylgruppene brukt som akseptorer for en hydrofil konjugat slik som glukuronid eller en sulfatgruppe 1, 2. Dersom en akseptor-gruppen allerede er tilstede i molekylene, kan det konjugeringstrinn skje uavhengig av fase I metabolisme. Hver reaksjon blir utført ved hjelp av en spesifikk gruppe enzymer, for eksempel, CYPs (cytokrom P450'er), som katalyserer hydroksylering (figur 1) og dealkylering av kjemiske substrater 3. Conjugation blir katalysert av sulfotransferaser, UDP-glukuronosyltransferaser (figur 1), glutation-S-transferaser og N-acetyltransferases 4. Hvert vev og organ vil ha en bestemt metabolsk enzym ekspresjonsprofilen, med leveren for å uttrykke de fleste av disse proteiner.
Figur 1: Eksempel på fase I og fase II Metabolism til Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysere 7-hydroksylering av kumarin. 7-hydroxykumarin er konjugert til en glukuronid resten ved fase II-enzymer UGTs, med UGT1A6 og UGT1A9 som viser den høyeste aktivitet.
Forståelse metabolismen av xenobiotika er kritisk i evalueringen av narkotika sikkerhet og for kjemisk risikovurdering av to grunner: reaksjonskinetikkene vil bestemme hvor lenge et medikament eller kjemiske vil forbli i kroppen i en aktiv eller inaktiv form before utskillelse; og stamforbindelsen kan modifiseres til en mer reaktiv, ustabil og toksiske art av metabolske enzymer. Slike reaksjoner også kjent som "bioaktivering" er for det meste drevet av fase I-CYP-enzymer, men også på mer sjeldne anledninger av fase II konjugering 5.
Basert på dette ble evnen til en in vitro modell for å forutsi risikoen forbundet med et medikament eller et kjemisk er svært avhengig av den metabolske kompetansen av cellesystemet. Cellelinjer avledet fra syke vev eller fra transformasjonen av normale celler ofte miste en del om ikke alle av de metabolske enzym profilen er representative for deres vev opprinnelses 6. Opprettholdelsen av den normale metabolske enzym profil vises bedre i primære cellekulturer (i det minste i korte tidskulturer) og blir ytterligere forbedret dersom vevet er dyrket i en matrise slik at den beholder sin 3D-struktur en. Derfor røyeacterization av metabolsk kompetansen av et in vitro cellesystem er et viktig innledende trinn i styring av beslutningen om hvilken cellemodell er hensiktsmessig å gjennomføre kjemiske sikkerhetsvurderinger.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å profilere aktivitet og ekspresjon av fase I CYP-enzymer in vitro med eksempler på deres anvendelse med en levercellelinje 7 og 3D primær lungecellekulturer 8. CYP spesifikke substrater, deres metabolske produkter og inhibitor kontroll er beskrevet sammen med massen spectrometry- og luminogenic-baserte kvantifisering metoder. Siden noen CYPs er induserbar og andre er konstituerende, vil eksempler også bli gitt for de to scenariene.
Protocol
NB: Den generelle arbeidsflyt for den metabolske aktiviteten analysen er vist i figur 2. Hvert trinn i denne arbeidsflyten er senere beskrevet i de neste avsnittene. Detaljerte tabeller av reagenser og utstyr er gitt i tabellen for materialteknologi.
Figur 2: Arbeidsflyt for det metabolske Probe-analysen. Cellene er seeded og vokst til tilstrekkelig tetthet. En CYP induksjonstrinn kan være nødvendig, avhengig av enzymaktiviteten bedømt. Sonden substrat og inhibitor blir tilsatt til cellekulturen. Etter en inkubasjonsperiode, blir mediet samlet opp for analyse og cellene lyseres for protein kvantifisering. Mediet blir behandlet for analyse av metabolsk produkt av sonden substratet ved massespektrometri eller luminometry.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. Cell Culture
Figur 3: lysgjennomgang Micrography av en levercellelinje Culture. Cellelinjen som er beskrevet i denne protokollen 5 typisk differensiere med en 50% delt mellom cholangiocytes og hepatocytter i kultur (100x). Skala bar = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Nedsatt levercellelinje kultur
MERK: En kommersielt tilgjengelig levercellelinje ble anvendt som et eksempel på metabolsk kompetente celler. Den cellelinjen var avledet fra en leverkreft forårsaket av virusinfeksjon 7. Ved sammenflytning, skiller denne cellelinjen inn i cholangiocyte- og hepatocytter-lignende celler (figur 3), og ytterligere detaljer kan finnes i Guillouzo 7. Inkluderingen av 2% DMSO i kulturmediet støtter differensiering av denne cellelinje og ekspresjon av en rekke CYPs.- Fjern de kryogene ampuller med celler fra den flytende nitrogen og plasserer på tørris for transport. Overfør kryoampulle til et vannbad på forhånd oppvarmet til 37 ° C i 1-2 min, og sterilisere utsiden av ampullen med 70% etanol før de legges i en laminær strømningshette.
- Mens arbeider under sterile betingelser, åpner nøye den kryogene ampullen for å slippe ut overtrykk og pipettere innholdet i den kryogene ampullen inn i et 10 ml rør fylt med 9 ml forvarmet Williams' E-medium ved 37 ° C.
- Sentrifuger løsningen i 10 minutter ved 400 x g ved romtemperatur, kast supernatant og resuspender cellene i 5 mLproprietære tine-medium forvarmet ved 37 ° C, supplert med glutamin eller en glutamin-supplement (2 mM sluttkonsentrasjon) (Williams' E + glutamin supplement + tine-bilag).
- Antall levedyktige celler ved hjelp av en 500 pl prøve med en celleteller, eller en hvilken som helst annen egnet celletelling teknikk.
- Seed cellene i en 24-brønn kollagen-belagt plate ved en tetthet på 0,6 x 10 6 levedyktige celler / brønn i et sluttvolum på 0,5 ml tinemedium.
- Sett platen (e) i en inkubator ved 37 ° C med en 5% / 95% CO2 / luft og 100% relativ fuktighet.
- 24 timer etter utsåing av cellene, erstatte mediet med 0,5 ml forvarmet vedlikehold / metabolisme arbeidsmedium (Williams' E + glutamin supplement + metabolisme supplement (dette mediet inneholder allerede DMSO)). Endre medium annenhver dag.
- Etter noen få dager i kultur ble cellene danner en sub-konfluent trabeklære struktur (figur 3). Den optimale metabolskeaktivitet observeres typisk mellom dag 7 og 10, og er lavest ved dag 4.
Figur 4: Tverrsnitt av Alcian blå Stained Airway celler dyrket på Air-væske Interface 8.
Ciliated, slim produsere og basalceller er klart synlig. Skala bar = 250 pm.
- Differensierte luftveisepitel kulturer
MERK: Protokollen er vist med en kommersielt tilgjengelig fullt differensiert primære luftveisepitel dyrket ved luft-væske-grenseflaten på en innsats 8 (figur 4). Vevskultur beholder en mucocilliary fenotype og celle polaritet 8. Celler kan være av nasal eller bronkial opprinnelse. Her bruker menneskelige nese celler. Cellene blir levert på en kulturplate med 24 formatsetter inn ved luft-væske-grenseflaten. For å lette transport og unngå søl medium innsatsene leveres med det basale Delen som er innleiret i en agarosematriks blandet med kulturmedium.- Ved levering av cellene, sterilisere skåler inneholdende de 24 innsatser med en 70% etanoloppløsning før de legges i en rent laminær strømningshette.
- Fremstill en steril 24-brønners plate ved å tilsette forvarmet 700 ul proprietære kulturmedium.
- Ved hjelp av sterile pinsetter overføre celleinnsatser til den nye plate forhåndslastet med medium ved forsiktig løsner innsatsen av agarosematriks.
- Sett platen (e) i en inkubator ved 37 ° C med en 5% / 95% CO2 / luft og 100% relativ fuktighet.
- Hver 2 dager overføre innsatsene til en ny steril 24-brønners plate forhåndslastet med 700 ul varm proprietære luftvei cellekulturmedium.
- Vurdere integriteten til luftveiene vev ved hjelp av metoder, slik som trans-epitelial motstand (teer), ellercilia slagfrekvens (CBF) ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en direkte videoavbildningssystem 9. Målingen av teer og CBF er beskrevet i Kuehn 10.
2. CYP Aktivitet Kvantifisering i cellekulturer
MERK: Som en generell regel, kan løsningsmidler slik som DMSO og metanol anvendes for å fremstille stamløsninger for de ulike metaboliske prober og inhibitorer presenteres i denne artikkelen. Imidlertid anbefales det å holde den endelige DMSO-konsentrasjonen i dyrkningsmediet til et minimum (1% eller lavere), siden høye konsentrasjoner kan hemme metabolske enzymer. Når det er mulig, er det også anbefalt å bruke fenol rød fri og serumfritt medium i løpet av inkubasjon med metabolske prober siden fenolrødt kan forstyrre CYPs og fase II-enzym-aktivitet og serumkomponent slik som albumin kan redusere sonden tilgjengelighet. Det er ikke alltid mulig å strengt overholde disse retningslinjer. For eksempel er luftveiscellekulturmedium proprietære og inneholder fenolrødt. Proprietære levercellelinje metabolisme medium 7 inneholder allerede DMSO over 1%, som det er nødvendig for at cellene skal ta i hepatocytt-lignende fenotype.
MERK: Endelig her, er uttrykket spesifikk probe / inhibitor anvendes, men denne terminologien må betraktes med forsiktighet. Faktisk er det meget sjelden at en metabolsk sonde for å være et enzym eksklusiv substrat. Probene som er beskrevet her, men har en høy affinitet for deres enzym mål og derfor regnes til pålitelig markering av aktivitet.
- Metabolske prober, induktorer, og inhibitorer
- Sonder bruker massespektrometri baserte metoder
MERK: Probene og inhibitorer som er beskrevet i dette avsnittet er egnet til å teste aktiviteten av CYP2As 11, CYP1A2 12,ref "> 13, CYP2B6 7, 14, CYP2F1 15, 16, og CYP2E1 17 ved UPLC-massespektrometri. Probene, inhibitorer, og tilsvarende CYP er beskrevet i tabell 1 med tilsvarende referanser. Tabell 1 viser også metabolsk produkt av CYP aktivitet som er kvantifisert ved hjelp av massespektrometri. Alt arbeid med vevskultur og løsninger for bruk i tissue dyrkningen skal utføres i en steril vevskultur hette. en lagerløsning fremstilles i DMSO for alle prøvesubstrater.- Før eksperimentet fremstille to serier av celleinnsatser eller brønner ved å bruke en serie for inhibering eksperiment, den andre for den metabolske sonde eneste. Fremstill en tredje serie av celler som et medium blank kontroll. De kan være på separate plater eller i de samme plater med et minimum av tre replikater. Et eksempel på plate låut er presentert i figur 5.
- På dagen for eksperimentet, erstatte celledyrkingsmediet med 450 ul friskt medium.
- Fremstill i en steril hette en 10x konsentrasjon av de følgende løsninger ved hjelp av cellekulturmediet. Bland 10x CYP sonde, 10x CYP-inhibitor, og 10x CYP hemmer og 10x sonde.
MERK: Master stamløsninger av inhibitor og sonde kan fremstilles i 100% DMSO (for eksempel 1.000 X stocks) og videre fortynnet i media for å oppnå en 10x løsning for å unngå en endelig DMSO-konsentrasjon på mer enn 1% med cellekultur . Den endelige 1x konsentrasjoner som er innrettet for inkubasjon med cellene er vist i tabell 1. - Filtrer den annen 10x sonde oppløsning med en 0,2 um sprøytefilter.
- Tilsett 50 ul av medium som inneholdt 10 x CYP inhibitoren til serien av celler fremstilt for inhibering eksperimentet, og pre-inkubert i 30 min.
- Replace mediet av celler ved inhibering serie med 450 ul friskt medium og tilsett 50 ul medium inneholdende både 10x CYP inhibitoren og 10x sonde substratet.
- Legg til de andre celler 50 ul av medium med 10x undersøkt substrat og tilsett en ekvivalent mengde av kjøretøyet fortynnet i medium (f.eks, DMSO) til den tomme cellekontrollene som vist i figur 5.
- Inkuber cellene til 0 - 5 minutter (tid 0, bakgrunnskontroll) og 16 timer i celleinkubator.
MERK: Denne inkubasjonstiden ble brukt med hell med luftveisceller og levercellelinje; imidlertid friske primære hepatocytter har en høy metabolsk kompetanse, i påvente av kvaliteten av cellepreparat og genetiske sammensetningen av donor, derav kortere tider (f.eks, 2-4 h) kan være passende. Det er alltid anbefalt å utføre en tidsforløp eksperiment ved testing av forskjellige cellelinjer eller celletyper. - Ved slutten av inkubasjonsperioden, collect mediet i separate merkede rør for kvantifisering av metabolsk produkt av sondene. Fryse medium for fremtidig behandling.
- Lysere cellene for protein kvantifisering.
MERK: Enhver standard protein kvantifisering kit og protokoll er egnet for dette trinnet. BCA er en egnet alternativ. Dette trinnet er valgfritt dersom cellene har til å bli brukt i en annen analyse.
- medium behandling
BEMERK: oppsamlet fra inkubasjonstrinnet medium inneholder det overordnede sonde kjemisk så vel som dets metabolske produkter. For å måle en spesifikk aktivitet CYP bare produktet av den reaksjon som katalyseres av CYP av interesse skal kvantifiseres. Fase I metabolismeprodukter er ofte behandlet i tandem med fase II metabolisme (konjugering) og kan derfor ikke bli gjenkjent som sådan. Således, for å oppnå mest mulig nøyaktig kvantifisering av en CYP-aktivitet, er en Dekonjugering trinnet som er nødvendig for å fjerne eventuelleFase II metabolisme modifikasjon. Etter konjugering av fase I metabolitter ofte involverer glukuronidering eller sulfatering, blir Dekonjugering oppnås ved behandling av prøvene med glucuronidases og sulfataser 18. Glukuronidase og sulfatase-aktivitet er pH-avhengig med høyest glukuronidase-aktivitet blir oppnådd ved pH 4,5-5,0 og sulfatase-aktivitet er størst ved pH 6,0-6,5. Derfor krever dette trinnet pH-justering. I fremgangsmåten som er beskrevet her, kan vi måle pH-verdien ved hjelp av pH-strimler av praktiske grunner da de fleste pH-meter probene ikke passer inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Kommersielt tilgjengelige pH-strimler kan finnes med en oppløsning så lavt som 0,3 til 0,2 pH-enheter.- Overfør 250 ul av inkubasjon medium til en 1,5 ml mikrorør og tilsett 4-metylumbelliferon intern standard lageroppløsning til oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 100 nM.
- Juster pH i blandingen til 4,5 til 5,0 ved tilsetning av 1 M HCl. Tilsett 1 pl av HCl i en tid og kontrollere pH-ved å pipettere 2 ul av medium til en pH-strimmel. Nådde en pH på 5,0 vil vanligvis ikke kreve mer enn 5 til 10 ul av 1 M HCI.
- Legg 150 enheter (1,8 pl av en 85 000 enheter / ml stam) av β-glukuronidase / arylsulfatase fra Helix pomatia og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Stopp reaksjonen ved å tilsette 250 ul kald metanol (-20 ° C). Oppbevar prøvene ved -20 ° C eller prosessen ytterligere.
- Fordamp løsningsmidlet ved hjelp av en vakuum-sentrifuge ved 45 ° C. Rekonstituer prøvene med 500 ul av en 30% acetonitril: vann-oppløsning. Prøvene er klare for massespektrometrianalyse og kan lagres ved -20 ° C i amber glass ampuller.
- Massespektrometri basert kvantifisering
MERK: All UPLC og massespektrometer innstillingene er detaljert i den dedikerte Supplemental tabell 1. For en kvantitativ analyse, å etablere en kalibreringskurve er nødvendig. Calitil kalibrerings kurve oppnås ved å kjøre et kjent fortynning utvalg av forbindelsen som skal kvantifiseres. I dette tilfellet ble de kalibreringskurver ble generert i løpet av 10 forskjellige konsentrasjoner (tabell 2), i det minste seks av disse bør være innenfor 20% av den lineære område 19. Laveste nivå for påvisning blir bestemt som den laveste konsentrasjon som gir et signal som er større enn, eller lik 3 x gjennomsnittsbakgrunnssignalet. Det laveste nivå for mengdebestemmelse, bestemmes som den prøve av laveste konsentrasjon som gir et signal som er større eller lik 10 ganger det gjennomsnittlige bakgrunnssignal som begge er bestemt i løpet av minst 3 uavhengige forsøk med tre parallellprøver.- Tilbered en seriefortynning av en syntetisk metabolitt i vevskultur medium i henhold til tabell 2, inkludert den indre standard. Et sluttvolum på 250 mL per standard fortynning er tilstrekkelig.
- Fordampe serielle fortynninger av standard som beskrevet i step 2.1.2.4 og resuspendert i et volum av 30% acetonitril: vann ekvivalent med volumet av mediet før fordamping (f.eks, 250 ul 30% acetonitril: vann dersom standardUtgangsOppløsningen var 250 ul medium).
- Tilsett 250 ul av hver seriefortynning standard til en ravgul UPLC glassflaske for injeksjon i UPLC-MS automatisk prøvetaker.
- Tilsett prøvene (250 mL) til gult UPLC ampuller og plassere dem i den UPLC autosampler.
- Tilfeldig alle flaskene.
MERK: massespektrometer konfigurasjon vi brukte er en hybrid trippel kvadrupol / lineær ionefelle massespektrometer koblet til et UPLC detaljert i Supplemental tabell 1. Andre plattformer vil ha ulik programvare og konfigurasjon, men ville følge tilsvarende trinn for å utføre kvantifisering. - Kjør UPLC-MS med innstillingene beskrevet i Supplemental tabell 1 avhengig av den spesifikke probe å kvantifisere.
- Brukden "kvantifisere - Bygg Kvantitering metoden" verktøy i massespektrometeret kvantifisering verktøy (Table of Materials) for å generere kalibreringskurve fra det kjøpte syntetiske standard og intern standard.
- Bruk "Kvantitering Wizard" for å velge den satsvis og prøver å kvantifisere og utføre "Kvantitering Method". Massespektrometeret kvantifiseringen Programvaren viser et regneark med kvantiteringsstandarder verdier av den ønskede forbindelsen i hver testprøve.
- Prober som bruker Luminescence baserte fremgangsmåter
MERK: Luminogenic sonder for å måle et område av CYP-aktiviteter er kommersielt tilgjengelige; imidlertid, ikke alle er egnet for cellebaserte analyser. Her blir en protokoll presentert for å måle aktiviteten til CYP1A1 / CYP1B1. CYP1A1 / 1B1 ble valgt for å illustrere hvordan man skal undersøke aktiviteten av induserbare CYPs og for å gi et eksempel på hvordan luminogenic prober kan anvendes som et alterinnfødt massespektrometri-baserte metoder. Tabell 3 oppsummerer konsentrasjonene og inkubasjonstiden vi brukt til luftveisceller og levercellelinje; Men de må kanskje tilpasses for andre celletyper. Andre luminogenic prober er kommersielt tilgjengelige og kan bli anvendt som substrater for en rekke CYPs.- Klargjør egnede celler for å inkludere et ikke-induserte kontroll, en indusert test, og en indusert + inhibitor test. Et eksempel på en plate layout er vist i Figur 5B.
- For å indusere CYP1A1 / 1B1, inkubere cellene med en sluttkonsentrasjon på 10 nM TCDD i medium i et tidsrom på 72 timer (kortere perioder på 24 til 48 timer kan også være egnet).
FORSIKTIG: TCDD er kreftfremkallende og teratogen. Bruk egnet verneutstyr, gjennomgå leverandør HMS ark og utføre en risikovurdering før bruk. - Etter denne perioden, fjerner det medium, skylling av brønnene med PBS 3 ganger, og legge til noen friskt medium.
- Prior å inkubere cellene med luminogenic reporter-proben, preinkubere det angitte undergruppe av induserte celler i 30 minutter med en sluttkonsentrasjon på 10 uM CYP1A1 / 1B1-inhibitor, α-naphthoflavone, i medium.
- Tilsett luminogenic sonde LUC-CEE (Luciferin 6'-kloretyl-eter) ved en sluttkonsentrasjon på 50 pM til de ikke-induserte, induserte og induserte celler + inhibitor.
- Inkuber i 4 timer i en cellekulturinkubator. Ved slutten av inkubasjonstiden samle mediet for kvantifisering av luminogenic sonde.
- Overføring 25 ul kulturmedium til en hvit ugjennomsiktig plate med 96 brønner og legge til 25 ul av luciferin deteksjonsreagens som leveres av produsenten. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Les platen umiddelbart med en luminometer.
- Rens cellene med PBS og lyserer for totalt protein kvantifisering.
MERK: Dette trinnet er valgfritt om levende celler beholdes for fremtidige eksperimenter. Jegt er viktig å merke seg imidlertid at induktorer som TCDD er giftige og kan skade cellene.
- Sonder bruker massespektrometri baserte metoder
Tabell 1: Liste over Metabolsk prober, produkter og hemmere med tilhørende enzym. Molekylvekt og anbefalte konsentrasjoner som benyttes sammen med luftveien og leverceller er også indikert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Forslag til 24-brønns plate Layout Utførelse av CYP analysen. (A) Den anbefalte layout for CYPs egenekspresjon omfatter en serie av brønner for blind mediet, Den metabolske proben, og den metabolske probe pluss inhibitor. Dette oppsettet kan multipliseres med antall tidspunkter som blir testet. (B) Et eksempel på plassering av induserbare CYPs omfatter en rekke godt for en middels blank, et metabolsk sonde bare kontroll, induserte celler (f.eks, med TCDD) inkubert med prober og inkubert med prober og en inhibitor.
Tabell 2: Fortynning av syntetiske standarder som brukes for kalibreringskurvene og Respektive Lods og LOQs. Fortynningsområdet å anvende kan variere, avhengig av massespektrometri plattformen og følsomhet. Her har vi brukt et hybrid trippel kvadrupol / lineær ionefelle massespektrometer koblet til et UPLC. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
Tabell 3: Luminogenic Probe, inducer og Inhibitor for CYP1A1 / 1B1-analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Eksempler på metabolsk aktivitet som er målt for to par CYPs (CYP1A1 / 1B1 og CYP2A6 / 2A13) i luftveiene cellekulturer fra tre forskjellige donorer (luftveis M360, M370, M417) og hepatisk cellelinje (Hep linje) er vist i figur 6 20.
CYP-aktivitet målt ved luminometry
Figur 6A viser den relative luminescens som frembringes av CYP1A1 / 1B1 O-dealkylering aktiviteten til Luc-CEE (Luciferin 6'-kloretyleter) i luftveisceller (3 donorer) og hepatiske celler med og uten TCDD induksjon. CYP1A1 / 1B1 er meget induserbare enzymer, og er vanligvis ikke uttrykkes på et nivå konstitutivt i de fleste vev. Som det kan ses i figur 6A, er ingen luminogenic signal som detekteres når cellene ikke blir indusert. Ved begge celletyper er pre-inkubert med TCDD, en sterk CYP1A1 / 1B1 inducer, et merkeed luminogenic signal blir detektert sammenlignet med kontroll (figur 6A). Dette indikerer at den Luc-CEE-probe er blitt metabolisert som fører til frigivelse av luciferin-gruppen som er kvantifisert etterfølgende. Samlet aktivitet fra TCDD-behandlede levercellelinje som er lavere enn for luftveisceller, selv etter at totalt protein normalisering. Det er ikke uvanlig ettersom cellelinjer har en tendens til å være mindre metabolsk aktiv enn primære celler. Tilsetning av α-naphthoflavone har en klar hemmende virkning på CYP1A1 / 1B1-aktivitet i alle celletyper som ytterligere bekrefter den CYP-avhengighet av Luc-CEE metabolisme.
Kvantifisering av CYP450 metabolitter ved hjelp av UPLC-MS
Figur 6B illustrerer kvantifisering av CYP2A6 / 2A13 aktivitet i luftveisceller fra 3 donorer (Airway M343, M345, M347) og leverceller (Hep linje) etter inkubering med kumarin i nærvær og fravær av inhibitor 8-metoksypsoralen. Dataene er normalisert til total-protein. I 0 min kumarin inkubering kontroll, ingen 7-hydroxykumarin detektert (Figur 6B). CYP2A6 / 2A13 er uttrykt konstitutivt i visse vev, og derfor etter 16 timers inkubering med kumarin dannelse av 7-hydroxykumarin påvises i de forskjellige celletypene som ble testet, selv uten induksjon. Når 8-metoksypsoralen, er en CYP2A tilsatt inhibitor (figur 6B), er dannelse av 7-hydroxykumarin betydelig redusert.
Det skal bemerkes at i nærvær av CYP-inhibitor, er det vanlig å detektere fremdeles en viss restaktivitet som hemning er sjelden fullstendig og siden andre CYPs kan også være i stand til å gjenkjenne den substratet, men behandle den langt mindre effektivt. Det kan også observeres at den registrerte metabolsk aktivitet kan være forskjellig mellom givere ved bruk av primære celler som det er synlig for CYP2A6 i luftveisceller(Figur 6B). Dette er forventet som CYP aktivitet er ansvarlig for hver donor genotype og polymorfismer.
Figur 6: Aktivitet assay-resultatet for CYP1A1 / 1B1 aktivitet (A) og CYP2A6 / 2A13 aktivitet (B) i den levercellelinje og i tre Airway Cell donorer (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkylering aktivitet er vist med og uten induksjon av CYP1A1 / 1B1 av TCDD. α-naphthoflavone ble anvendt som CYP1A1 / 1B1-inhibitor. Aktiviteten er uttrykt som relative luminescens-enheter (RLU) normalisert ved inkubering tiden i minutter (min) og samlet protein (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ikke krever induksjon som de er uttrykt konstitutivt. Kumarin-7-hydroksylering aktivitet i pmol / min / mg protein, er vist ved forskjellige tidspunkter med og uten inhibitor 8-methoxypsorAlen. Alle resultater er presentert som middelverdi av tre uavhengige målinger med standardavvik av gjennomsnittet. Dette tallet ble endret fra Baxter 20.
Supplerende Tabell 1: UPLC og massespektrometer Innstillinger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For tiden er mange standardiserte toksikologiske testsystemer som bruker konstruerte bakterier, cellelinjer, eller embryonale celler som ikke er representative for den normale humane metabolisme 1. Dette kan føre til unøyaktige prediksjonene av den potensielle toksiske aktivitet av en kjemisk eller medisin. In vitro-modeller, slik som 3D-cellekulturer og organ på en brikke, blir utviklet i et forsøk på å bedre gjenskape normal morfologi og metabolsk aktivitet i humant vev 21, 22, 23. Metabolsk kompetanse er et kriterium som kan brukes til å dechiffrere hvilke modeller som er best egnet for toksikologiske vurdering og narkotika biotransformasjonsprodukter studier.
Protokollen har vi beskrevet i denne artikkelen er konstruert for å måle aktiviteten til CYP-enzymer ved hjelp av levende celler. Den er fleksibel og kan brukes til forskjellige cellesystemer i 2D eller 3D cultures og tilbyr muligheten til å bruke enten en luminogenic sonde og eller massespektrometri basert tilnærming. Begge metodene er følsom nok til å detektere nanogram-mengder av stoffer, og bare krever et lite antall celler dyrket i et multibrønnformat. De kan også bli brukt for å, sfæroide eller cellene dyrkes i komplekse matriser. Utvelgelsen av sonden substratet er åpenbart en viktig del av protokollen. Spesifisiteten av analysen er avhengig av proben er selektivt av CYP-enzym og et annet lag av sikkerhet kan oppnås ved anvendelse av en selektiv CYP inhibitor. De substrater og inhibitorer som er oppført i dette papir er bare noen få eksempler, men andre kan bli funnet i litteraturen.
Det er viktig å vurdere flere inkubasjonstider når man arbeider med en ny celletype som et negativt resultat CYP aktivitet kan skyldes enzymet som uttrykkes på et lavt nivå. Tilsetningen av en celletype som kan benyttes som en positiv kontroll er tilrådelig for å sikre at ennegativt resultat er ikke knyttet til et teknisk problem, og for å hjelpe med eventuelle feilsøking. Primære leverceller er metabolsk kompetent og kan brukes som kontroll, for eksempel primære hepatocytter i suspensjonen er meget enkelt å bruke, men deres levedyktighet er begrenset i tid. Levercellelinjer er mulige alternativer som er forholdsvis enkle å bruke som er beskrevet i denne protokollen, men noen er bedre enn andre i form av metabolsk aktivitet til 6, 21.
Siden analysen er ikke-destruktiv, med mindre total-protein kvantifiseres, er det mulig å følge CYP-aktivitet over tid i longitudinelle studier 20. Dette er et viktig poeng fordi noen celler vil ha variabel CYP aktivitet over tid i kultur. Et negativt resultat kan være forbundet med mangel på konfluens fremskritt med differensiering eller dedifferensiering in vitro. I så fall, er problemstillingen semi-quantitative siden dataene ikke normaliseres av den totale mengden av protein i hver cellekultur. Det er ikke alltid mulig eller anbefalt å gjenbruke vev etter måling av CYP aktivitet som eksponering til prober, hemmere eller induktorer kan ha en toksisk virkning på vev som er tilfellet for TCDD.
Cellefraksjoner slik som mikrosomer kan også benyttes for å karakterisere CYP aktiviteten til en gitt celletype. Mikrosomekstrakter preparater krever imidlertid mye av cellemateriale, tilsetning av tilstrekkelig kofaktorer og buffer for å sikre at enzymene som forblir aktiv. Ved hjelp av levende celler eliminerer vanskelig micro forberedelse trinn og arbeider ut hvilke buffere og kofaktorer fungerer best.
Som en generell anbefaling, er det en god fremgangsmåte for å karakterisere videre ekspresjonsprofilen av CYPs i cellekulturer for å bekrefte at det samsvarer med enzymatisk aktivitet. Denne ekstra nivå av verifiserings anbefales gitt at de metabolske probene ikke er entiavhengige spesifikke for en enkelt CYP og det gir større tillit til at den målte metabolske aktiviteten er avstemt med det tilsvarende enzym uttrykk. Siden CYPs er membranproteiner de er forholdsvis vanskelig å fremstille for Western blot, derfor kvantitativ RT-PCR har vært den foretrukne metode for å profilere disse enzymer 20.
Det er viktig å merke seg at denne protokollen beskriver en metode for å analysere med CYP-enzymaktiviteten som bare representerer en familie av metabolske enzymer, selv om den er viktig. Fleksibiliteten av en massespektrometri løsning tillater utvikling av innsamlingsmetode for andre metabolske transformasjoner av prøvesubstrater. Men de har til å bli utviklet en om gangen, og det er for tiden færre kjente spesifikke prober og selektive inhibitorer for andre metabolske enzymfamilier. Dette gap bør tas opp for å tillate en fullstendig vurdering av den metabolske kompetansen av in vitro celle systems.
Disclosures
AB og EM var ansatte i British American Tobacco på den tiden dette manuskriptet ble skrevet. Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet ble finansiert av British American Tobacco, og publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av British American Tobacco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent & Cells | |||
| 2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
| 6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
| 6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
| 7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
| 7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
| 8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
| acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
| α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
| BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
| Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
| Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
| chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
| collagen | Cell Systems | 5005-B | |
| coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
| disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
| fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
| Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
| HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
| HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
| HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
| Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
| methanol | Fisher | M/4056/17 | |
| MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
| MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
| Phenomenex Kinetex 2.6 μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
| TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
| thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
| Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mm | Waters | 86003538 | |
| Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UPLC | Waters | Acquity | |
| QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
| QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
| luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
| cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
| rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |
References
- Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
- Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
- Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
- Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
- Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
- Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
- Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
- Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
- Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
- Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
- Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
- Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
- Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
- Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
- Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
- Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
- Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
- Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
- Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
- Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).
