Summary
פרוטוקול זה מתאר זיהוי מיקרוסקופיה confocal של G הקולטן חלבון בשילוב (GPCR) ההפנמה בתאי יונקים. הוא כולל את התרבות התא הבסיסי, transfection, ואת הליך מיקרוסקופיה confocal מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את לוקליזציה subcellular והפנמה של GPCR פיוז'ן-הביעו.
Introduction
תאים בעלי מכונות סחר משא להובלת תאי חומרים כגון הליגנדים, מיקרואורגניזמים, מזינים, וחלבונים-אל transmembrane התא לקבלת מידע, אנרגיה, ולמטרות אחרות 1, 2. זה קריטי עבור הומאוסטזיס הסלולר, רקמות פונקציה, והישרדות תא כללית. הביטוי מבוסס תאים של חלבונים היתוך פלורסנט הינה דרך ללמוד את לוקליזציה והפנמה של קולטנים transmembrane, כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCR), ב מסלולי איתות 3.
הביטוי של חלבוני היתוך מתויגים עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מ ויקטוריה Aequorea המדוזה, בשילוב עם טכניקות גילוי קרינה ישירה, צבר הסכמה רחבה לגבי מיקוד חלבון מחקר 4, 5, 6. detecti GFP המבוססיש על היתרון של מתן אפשרות הדמיה בזמן אמת של תאים חיים, תוך הימנעות חפצים קיבוע 7. סדרת וקטורי שיבוט תכליתיים נבנתה כדי להקל על הביטוי בשילובי חלבון ה- GFP בתאים שונים 8, 9. וקטור pEGFP-N1 הוא וקטור הפלסמיד בשימוש נרחב ממוסחר קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), אשר עבר אופטימיזציה מן GFP מהסוג פרא על קרינה בהירה ביטוי גבוה בתאי יונקים. כדי לבחון את אות הניאון של EGFP לידי ביטוי בתאי יונקים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי צריך להתנהל עם עירור ב 488 ננומטר ואת פליטת ב 507 ננומטר, רצוי עם מיקרוסקופיה confocal.
ניטור לוקליזציה subcellular והפנמה בתיווך ליגנד של קולטנים היא טכניקה נפוצה לחקור את האות התמרה והתפקוד של GPCRs 10 עד>, 11. ברוב המקרים, הפנמה מובילה הקהיה של GPCRs (ההנחתה של תגובת הגירוי למרות הנוכחות של אגוניסטים) 12, 13. הקולטנים הפנימו ניתן לשלב לתוך הליזוזום והשפילו, או שהם יכולים להיות ממוחזרים חזרה אל פני התא, בהתאם לאופי של קולטנים ואת שורות תאים המשמשים בניסויים.
הקולטנים להורמון משחרר גונדוטרופין (GnRHRs) שייכים למשפחת GPCR ויש לי מבנה החלבון GPCR טיפוסית, עם מסוף אמינו-תאי, מסוף -COOH תאיים, ושבעה transmembrane (TM) תחומים 14. Transfection של Sj פלסמיד רקומביננטי GnRHR-EGFP (עם הגן GnRHR מן japonica Sepiella) ואת זיהוי מיקרוסקופיה confocal של GnRHR SJ-tagged EGFP (שבאה לידי ביטוי HEK293 תאים) נמסר לשנים הקודמותערמומי, ואת הקרינה GFP הוקמה ככתבת עבור מבחני לוקליזציה חלבון טראנסממברנלי 15. עכשיו, הפנמת Sj GnRHR, מופעל על ידי הורמון גונדוטרופין-שחרור japonica ס (Sj GnRH), הודגמה נימוסים הזמן- ו תלוי מינון על ידי מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא הכנה
- התאוששות Cell
- העברת כליות 293 העובריים האנושיים cryopreserved (HEK293) התאים מטנק חנקן נוזלי כדי באמבט מי C 37 ° ולנער ברציפות 1 - דקה 2.
- להוסיף 10 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), ו 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין) לצלחת התרבות תא 10 ס"מ. בעדינות להוסיף את התאים המופשרים למדיום גידול equilibrated.
- דגירה התאים בתוך חממה CO 2 במים במעיל C 37 ° עם אווירה humidified המכיל% באוויר 95% ו 5 CO 2 עבור 2 - h 4.
- לאחר 2 - 4 h, לבדוק כי התאים מחוברים. החלף את מדיום הגידול equilibrated ותרבות עבור 24 אחר - 48 h.
הערה: שינוי המדיום צמיחה equilibrated שימושי משום שהוא מסיר sulfoxide דימתיל (DMSO) ומגן מפני נזק לתאים.
- <מעבר strong> סלולרי
- אחרי 24 - 48 h, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב, להשליך את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). מערבולת את המנה בעדינות.
- בטל PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (מלוחים, 0.25% טריפסין, ו 0.02% EDTA). כדי לגמרי לעכל את התאים, לערבל את המנה בזהירות לשאוב את הפתרון טריפסין- EDTA. שים את צלחת בחממה CO 2 במים במעיל C 37 ° עבור 3 דקות.
הערה: במהלך תקופה זו, להכין שלוש מנות תרבית תאים חדשים 10 ס"מ ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated לכל. - באמצעות מיקרוסקופ אור, לקבוע אם התאים נוקפים מהעומק של המנה. להוסיף 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated עד המנה. מערבבים על ידי pipetting ומיד pipet 0.6 מ"ל של ההשעיה תא לכל אחד את הכלים החדשים. לערבב בעדינות על ידי pipetting ולאפשר לתאים כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
2. זריעת תאים
- אחרי 24 - 48 h, כאשר התאים passaged גדלו ל המפגש הקרוב, להשליך את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS. מערבולת את המנה בעדינות.
- בטל PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA. כדי לגמרי לעכל את התאים, לערבל את המנה בזהירות לשאוב את טריפסין-EDTA. שים את צלחת בחממה CO 2 במים במעיל C 37 ° עבור 3 דקות.
הערה: במהלך תקופה זו, להכין צלחת 6-היטב על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated היטב כל אחד. - להוסיף 1 מיליליטר של מדיום גידול equilibrated כדי בצלחת, אם, תחת השגחה מיקרוסקופית, לתאים נוקפים מלמטה המנה. מערבבים על ידי pipetting ומיד pipet 0.1 מ"ל של תרחיף תאים (נפח מותאם לפי צפיפות צמיחת תאים) היטב בכל צלחת 6-מוכן היטב (תא-פחות צלחת 6-היטב עם 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated). לערבב בעדינות על ידי pipetting ולאפשר לתאיםכדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
3. Transfection התא
- שיטת Transfection 1, עם ניסוחים ליפוזום
הערה: אנא ראה טבלה של חומרים עבור transfection מגיב 1.- למחרת, להבטיח כי תאים חייבים להיות 85 - 95% ומחוברות.
- להוסיף 3 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (500 ng / μL) ו 100 μL של התקשורת סרום מופחת צינור microcentrifuge סטרילי, ומערבבים בעדינות. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- כן 9 μL של מגיב 1 ו 100 μL של תקשורת סרום המופחתת ב צינור אחר microcentrifuge, ומערבבים בעדינות. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מערבבים את תערובת פלסמיד מדולל עם בדילול מגיב 1 (הנפח הכולל = 215 μL). מערבבים בעדינות דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב בינוני מהצלחת תאים בתרבית, ולהוסיף 1.5 מ"ל DMEM טריים ללא FBS.
- הוספת 215 μL של DNA-transfשיקוף תערובת מגיב לכל dropwise היטב, ומערבבים בעדינות על ידי מתערבל את הצלחת.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 עבור 4 - h 8. החלף עם DMEM טרי עם 10% FBS.
- דגירת תאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 24 אחר - 48 שעות לפני הפעלת ניסויים כלשהם.
- שיטת Transfection 2, עם ניסוחים ליפוזום
הערה: אנא ראה טבלה של חומרים עבור transfection מגיב 2.- להוסיף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (500 ng / μL), 4 μL של מגיב 2, ו 100 μL התקשורת סרום מופחת לתוך צינור microcentrifuge סטרילית. מערבבים בעדינות דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את תערובת transfection לתאים באופן dropwise.
- לאחר transfection, דגירה תאים עבור 24 - 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2, לפני הפעלת ניסויים כלשהם.
4. תרבית תאים על מכסה מחליק
- מִחָדָשׁלהזיז את מדיום הגידול מהצלחת 6-גם תרבות.
- לשטוף monolayer התא עם 1 מ"ל של PBS ללא סידן ומגנזיום.
- להוסיף 0.5 מ"ל טריפסין- EDTA. מערבולת את המנה בזהירות לשאוב את טריפסין-EDTA. דגירה את צלחת התרבות עבור 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2. זמן הדגירה בפועל משתנה עם שורת תאים המשמשים.
הערה: במהלך תקופה זו, להכין צלחת 12-היטב חדשה ולהוסיף 15 מ"מ קוטר כיסוי סטרילי מחליק היטב כל אחד. מכסה מחליק מצופה ליזין, laminin, או קולגן עשוי לשפר מצורף תא לתאים HEK293 כי לנתק בקלות. - כאשר תאים מנותקים, להוסיף מיליליטר 1 מחומם מראש בינוני צמיחה מלא בכל טוב. מערבבים על ידי pipetting ומיד להעביר את המספר הדרוש של תאים הצלחת 12-היטב עם מכסה מחליק. הוסף בינוני צמיחה שלם טרי היטב כל להתאים את הנפח הכולל של 1 מ"ל
- דגירת התאים במשך 16 - 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
הערה: לאחר 30 -60 דקות, רוב התאים יהיה דבקו תלושי כיסוי סטרילי.
5. איתור מיקרוסקופי Confocal
- לוקליזציה הסלולר
- אחרי 16 - 24 שעות, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב על מכסה מחליק סטרילי בצלחת 12-היטב, להוסיף את החללית קרום, DiI, זה טוב, נותן ריכוז סופי של 5 מיקרומטר. אפשר התאים כדי לדגור על 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
- אחרי 30 דקות, להסיר את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים פעמיים PBS קר (2 - 8 ° C).
- תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) זה טוב. בעדינות להתסיס במשך 15 דקות.
זהירות: Paraformaldehyde רעיל בינוני ידי עור במגע או שאיפה, ויועד קרצינוגן אדם סביר. כימיקלים מקטרים ברדסים, מתחמי איזון פרקו או אמצעים אחרים יש להשתמש במהלך במשקל וטיפול paraformaldehyde. </ Li> - לשטוף את התאים הקבועים פעמים PBS. להוסיף 200-300 μL של DAPI (4' , 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) לכל היטב דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את התאים פעמיים עם PBS. מוציאים בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת של הרכבה בינונית (50% v / v גליצרול / מים). הסר בינוני הרכבה עודף השקופיות.
- הפנמה ניידת
- אחרי 16 - 24 שעות, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב על מכסה מחליק סטרילי בצלחת 12-היטב, להסיר את מדיום הגידול equilibrated ולהוסיף טרי, מחומם DMEM בינוני (37 מעלות צלזיוס). דגירה התאים עבור 1 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- פנקו את התאים עם ריכוזים שונים (0, 10 -12, 10 -9, ו 10 -6 M) של ליגנד עבור 30 דקות ולהתייחס אליהם 10 ליגנד -6 M לזמנים שונים (0,10, 30, ו 60 דק ').
- פעמיים לשטוף התאים קר PBS (2 - 8 ° C). תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) זה טוב. בעדינות להתסיס במשך 15 דקות.
- שוטפים את התאים פעמיים PBS. מוציאים בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת של הרכבה בינונית (50% v / v גליצרול / מים). הסר בינוני הרכבה עודף השקופיות.
- מיקרוסקופיה
- הפעילו את החומרה של מיקרוסקופ confocal, כולל כוח מנורת כספית, מיקרוסקופ PC, סורק, לייזר. היכנסו לערוץ מערכת ההפעלה, להפעיל את התוכנה, לבדוק את התצורה ובחר לייזר. הפעל את היחידות השונות של מערכת מיקרוסקופיה confocal בצו על פי הוראות.
- מניח את השקופיות שהוכנו על במת מיקרוסקופ. מקם את המדגם על העדשה האובייקטיבית שימוש בבקר הבמה. להוסיף טיפה אחת של שמן ארז עלכדי coverslip כאשר נבחרה עדשת טבילת שמן. מניחים את מכסה מחליק על מגלשות מול העדשה.
- מצא את התאים של עניין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- החלף לסרוק במצב. בחר את כוח לייזר בטווח הספקטרום של fluorophore פליטה. צלמו את התמונות confocal באיכות גבוהה על ידי עוצמת הלייזר כוונון ופרמטרים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג דוגמה של מערכת מיקרוסקופ confocal. איור 2 מציג את הביטוי של pEGFP-N1 בתאי HEK293. אות GFP זוהתה הציטופלסמה לבין הגרעין. איור 3 מראה את לוקליזציה subcellular של GnRHR מן japonica ס בתאי HEK293, עולה בקנה אחד עם התוצאות שלנו שפורסמו בעבר 15. החלבון היתוך עם תג EGFP ב C- הסופית של Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) הופיע ירוק בניסוי זה כאשר תחת CLSM. הגרעין מגואלות DAPI נחשף בכחול. מכתים DiI הדגיש את קרום התא באדום. האות הצהוב על פני התא בתמונה הממוזגת הצביע על המקרה של אדום וירוק, הוכחת לוקליזציה קרום פלזמה של GnRHR ש"י.
דמויות תצוגה 4 ו 5תוצאות מבחני הפנמת Sj GnRHR בתאי HEK293. כדי להמחיש את הפנמת Sj GnRHR, התאים טופלו שחרור הורמון גונדוטרופין (Sj GnRH) 15 בריכוזים שונים עבור 30 דק '(איור 4), או שהם טופלו ריכוז יחיד (10 - 6 מליון) לתקופות שונות ( איור 5). בהעדר GnRH ש"י, שליטת היתוך קולטן (CTL) היה לוקליזציה קרום פלזמה. כפי שניתן לראות בתרשים 4, בריכוזים שונים ליגנד, ההפנמה של ש"י GnRHR התנהלה באופן תלוי מינון, לבין הקולטן הופנם לחלוטין מתא השטח ל 10 - 6 מיליון ליגנד. כפי שניתן לראות בתרשים 5, את התוצאות של הניתוח כמובן הזמן של הפנמה הקולטן עם 10 - 6 ליגנד M הוכיחו כי הפנימוSj GnRHR לא הורגש 10 דקות לאחר גירוי אגוניסט, והפנמה קיצונית שהתרחשה ב -60 דק '. תצפית עם מיקרוסקופיה confocal מנתונים אלה שני גילה כי חלבון היתוך Sj GnRHR-EGFP פלורסנט היה מקומי בעיקר בקרום פלזמה והיה דרמטי במהירות הפנימו לתוך התא בתגובה פפטיד GnRH ש"י HEK293 תאים.
איור 1. דוגמה של מערכת Confocal מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מיקרוסקופית Confocal של חלבון ה- GFP בבקרה pEGFP-N1-טרנספקציה HEK293 תאים . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
לוקליזציה איור 3. ש"י GnRHR-EGFP חלבון פיוז'ן HEK293 תאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. הגרעין מגואלות DAPI מוצג בכחול. מכתים DiI, באדום, מדגיש את קרום התא. חלבון Sj היתוך GnRHR-EGFP מוצג בירוק. בתמונה הממוזגת, צהוב מצביע על המקרה של האותות האדומים וירוקים. כל התמונות לייצג לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
ig4.jpg"/>
ההפנמה איור 4. ש"י GnRHR-EGFP חלבון היתוך בתאי HEK293 בקורס זמן על ידי מיקרוסקופית Confocal. HEK293 תאים טרנספקציה עם פלסמיד Sj GnRHR-EGFP הופעלו על ידי טיפול עם ריכוזים שונים של GnRH למשך 30 דקות. המקרה המלא היה ללא גירוי GnRH (CTL). כל התמונות לייצג לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
ההפנמה איור 5. ש"י GnRHR-EGFP חלבון פיוז'ן HEK293 תאים באופן תלוי מינון על ידי מיקרוסקופית Confocal. HEK293 תאי טרנספקציה עם פלסמיד Sj GnRHR-EGFP הופעלו על ידי טיפול עם 10 - 6 מיליון ליגנד עבור ד שונהurations. המקרה המלא היה ללא גירוי GnRH (CTL). כל התמונות לייצג לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את הלוקליזציה והפנמה התת-תאי של חלבון היתוך GPCR לידי ביטוי HEK293 תאים. הטכניקה ניתן להתאים בקלות עבור גנים רבים ושונים סוגי תאים, כגון עבור לוקליזציה הסלולר והפנמה של הקולטן corazonin מן Bombyx מורי בתאים HEK293 ו BmN 16.
היישום המוצלח של assay עצמה זו מסתמך על כמה גורמים מרכזיים. בראש ובראשונה הוא על בריאות טובה של תאים, אשר חיונית transfection יעיל ואיכותי נתונים. זמן דגירת transfection, המרווח בין transfection וניסויים אחרים, ואת המעבר של תאי טרנספקציה לכסות תלושים לפני ההדמיה, הם כל הצעדים בם הפגיעה בתאים בתרבית אפשרית. לכן, שמירה על הבריאות הטובה של התא הוא תנאי חשוב בכל הצעדים בניסוי זה. יתר על כן, הימנעות תאים דחוסים היטב בתרבויות צפופות חיוני כדי לרכוש תמונות באיכות גבוהה עם מיקרוסקופ confocal. כדי למזער את ההשפעה של תג פלורסנט על הלוקליזציה של GPCRs, יצרנו קולטנים עם EGFP קבעו את הסופית- C התאי. Transfection המוצלח והיעיל של הגן לתוך התאים חשוב גם. יעילות transfection עשויה להשתנות במידה ניכרת בשורות תאים שונות. לכן, אופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול עשוי להיות נחוץ, תלוי בסוג התא מסוים בשימוש. לדוגמה, שיטת transfection 1, משך הדגירה של תאים transfected ב DMEM ללא FBS יכול להיות מותאם לפי מצב התא. בנוסף המינון של פלסמיד דנ"א, המינון של מגיב ליפוזום ומדיה סרום מופחת צריך להיות מותאם לפי שורות תאים ספציפיים. אחרת, את הטכניקה electrotransfection יכול להתנהל במקום F transfection בתיווך ריאגנט ליפוזוםאו יעילות transfection מקובלת שורת תאים ספציפית. עם זאת, חומרה נוספת נדרשת, ואת התאים בתרחיף ו בנפח קטן קשים transfect ידי electrotransfection. כוחו האמיתי של assay הנוכחי, לעומת זאת, טמון ההשוואה בין שינויים אותם התאים בתנאי תרבות זהים לאחר מניפולציות חריפות, כגון הפנמת Sj GnRHR בתגובה ליגנד GnRH ש"י.
הפנמה היא אחד המנגנונים השולט השליטה GPCR איתות כדי להבטיח את התגובות הסלולר המתאימות לגירויי 11. אנו יכולים לצפות לשינויי הפנמה באמצעות הדמיה בקלות עם מיקרוסקופיה confocal. הפנמת GnRHR Sj בתוך dose- ואופן תלוי זמן מתגלה בבירור באיור 4.
פרוטוקול שתיארנו ניתן להתאים בקלות את העקיבה התת-תאי של יחסי ציבור איקריוטיים אחריםoteins, כגון קולטן אסטרוגן הגרעיני 17. עם זאת, אופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול תהיה צורך, בהתאם לסוגי תאים המסוימים בשימוש, אשר ידרשו חקירה ותרגול נוספים. עם זאת, בהתחשב בכך מיקום subcellular של חלבונים יש השפעה רבה על זיהוי של גנים, שינויי חלבון, ו מסלולי איתות, פרוטוקול זה, המבוסס על המחקר שפורסם, יכול לספק נתונים ומידע אמינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
