Summary
このプロトコルは、哺乳動物細胞におけるGタンパク質共役受容体（GPCR）内在化の共焦点顕微鏡検出を記載します。これは、基本的な細胞培養、トランスフェクション、および共焦点顕微鏡手順を含み、融合発現GPCRの細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。
Introduction
細胞は、情報、エネルギー、及び他の目的の1、2についての細胞内タンパク質、細胞外物質、例えばリガンド、微生物、栄養素、および膜貫通などを輸送する貨物輸送の機構を有します。それは、細胞の恒常性、組織機能、および全体的な細胞の生存に重要です。蛍光融合タンパク質の細胞ベースの発現は、経路3シグナリングに、そのようなGタンパク質共役受容体（GPCR）のような膜貫通受容体の局在化および内在化を研究するための強力な方法です。
直接蛍光検出技術と組み合わせクラゲオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けされた融合タンパク質の発現は、タンパク質-ターゲティング研究4、5、6で広く受け入れられています。 GFPベースdetecti固定アーティファクト7を回避しながら、生細胞のリアルタイムイメージングを可能にするという利点を有します。汎用性のクローニングベクター一連の種々の細胞8,9にGFPにタンパク質融合物の発現を促進するように構成されています。 pEGFP-N1ベクターは、哺乳動物細胞におけるより明るい蛍光およびより高い発現のために、野生型GFPから最適化された増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードして広く使用され、市販されているプラスミドベクターです。 EGFPの蛍光シグナルは、哺乳動物細胞において発現を観察するために、蛍光顕微鏡は、好ましくは、共焦点顕微鏡では、488 nmでの励起および507 nmでの発光を用いて行われるべきです。
受容体の細胞内局在、およびリガンド媒介性内在化を監視することのGPCR 10のシグナル伝達および機能を調査する一般的な技術であります11、>アップ。ほとんどの場合、内在化は、GPCRの脱感作（アゴニストの存在にもかかわらず、刺激応答の減衰）12、13を導きます。内在化受容体は、リソソームおよび劣化に組み込むことができ、またはそれらは、受容体との実験で使用した細胞株の性質に応じて、細胞表面に再循環させることができます。
ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（GnRHRs）はGPCRファミリーに属し、細胞外アミノ末端を有する典型的なGPCRタンパク質構造、細胞内-COOH端子、7つの膜貫通（TM）14ドメインを有します。 （SepiellaジャポニカからGnRHR遺伝子を有する）組換えプラスミドのSJ GnRHR-EGFPのトランスフェクションおよび（HEK293細胞に発現）EGFPタグのSJ GnRHRの共焦点顕微鏡検出をpreviouを報告しました。SLY、そしてGFP蛍光は、膜貫通タンパク質の局在化アッセイ15のためのレポーターとして設立されました。今、S.ジャポニカゴナドトロピン放出ホルモン（SjとのGnRH）によって活性化さSjの GnRHRの内部移行は、共焦点顕微鏡によって時間および用量依存的様式で実証されました。
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Protocol
1.細胞の調製
- 細胞の回収
- 37℃の水浴に液体窒素タンクから凍結保存ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞を移し、1連続振盪 - 2分。
- 10cmの細胞培養皿に平衡成長培地10ml（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）、および1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液）を加えます。静かに平衡化した増殖培地に解凍された細胞を追加します。
- 4時間- 2、95％空気および5％CO 2を含有する加湿雰囲気で37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。
- 2後 - 4時間、細胞が付着していることを確認してください。 48時間 - 別の24のための平衡化増殖培地及び培養を置き換えます。
注：ジメチルスルホキシド（DMSO）を除去し、細胞損傷から保護するために平衡化し、増殖培地を変更しても有用です。
- <強い>セル通路
- 24後 - 細胞がほぼコンフルエントまで増殖させた場合、48時間、平衡化した増殖培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の2mLで細胞を洗浄します。優しく料理を旋回。
- PBSを捨て、トリプシン-EDTA（生理食塩水、0.25％トリプシンおよび0.02％EDTA）を1ml加えます。細胞を完全に消化するために、皿を慎重に旋回し、トリプシン-EDTA溶液をオフに吸引します。 3分間37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター内で皿を置きます。
注：この期間中、3新しい10-cmの細胞培養皿を用意し、それぞれに平衡化増殖培地の10 mLを加え。 - 細胞は、皿の底から持ち上げられている場合は光学顕微鏡を用いて、決定します。皿に平衡化した増殖培地の2ミリリットルを追加します。ピペッティングにより混合し、直ちに新しい皿の各細胞懸濁液の0.6mLのをピペット。穏やかにピペッティングすることによって混合し、細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートすることを可能にします。
2.細胞播種
- 24後 - 継代細胞がほぼコンフルエントまで増殖させた48時間、平衡化した増殖培地を廃棄し、2mlのPBSで細胞を洗浄します。優しく料理を旋回。
- PBSを捨て、トリプシン-EDTAを1mLを加えます。細胞を完全に消化するために、皿を慎重に旋回し、トリプシン-EDTAをオフ吸引。 3分間37℃の水ジャケットCO 2インキュベーター内で皿を置きます。
注：この期間中に、各ウェルに平衡化した増殖培地2mlを添加することにより、6ウェルプレートを準備します。 - 、顕微鏡観察下で、細胞をディッシュ底部から持ち上げられたとすれば、皿に平衡化増殖培地1mlを加えます。ピペッティングにより混合し、直ちに調製6ウェルプレート（平衡化増殖培地2mLで細胞レス6ウェルプレート）の各ウェルに細胞懸濁液0.1ml（体積は細胞増殖密度に応じて調整されている）をピペット。静かにピペッティングにより混合した細胞を許可します37℃でインキュベートし、5％CO 2です。
3.細胞トランスフェクション
- リポソーム配合物のトランスフェクション方法1、
注：トランスフェクション試薬1 のための材料の表をご参照ください。- 翌日、細胞が85であることを確認してください - 95％コンフルエント。
- 滅菌マイクロチューブにプラスミドDNA（500 ng /μLで）および還元血清培地100μLの3μgのを追加し、穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。
- 別のマイクロチューブに試薬1の9μLと減少した血清培地の100μLを用意し、穏やかに混合。室温で5分間インキュベートします。
- 希釈試薬1（総容積= 215μL）で希釈し、プラスミド混合物を組み合わせます。穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。
- 吸引細胞培養プレートから培地、およびFBSを含まない1.5mLの新鮮なDMEMを加えます。
- DNA-TRANSFの215μLを追加ection試薬を各ウェルに滴下して混合し、プレートを回転させることによって穏やかに混合します。
- 8時間- 4 37℃でインキュベートし、5％CO 2。 10％FBSを含む新鮮なDMEMと交換してください。
- 任意の実験を実行する前に、48時間-別の24 CO 2、37℃で、5％の細胞をインキュベートします。
- リポソーム配合物のトランスフェクション法2、
注：トランスフェクション試薬2 のための材料の表をご参照ください。- 滅菌マイクロチューブにプラスミドDNA2μgの（500 ng /μLで）、試薬2の4μL、100μLを低減血清培地を加えます。穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。
- 滴下様式で細胞にトランスフェクション混合物を加えます。
- 任意の実験を実行する前に、37℃で48時間、5％CO 2 -トランスフェクション後、24細胞をインキュベートします。
カバースリップ4.細胞培養
- 再培養6ウェルプレートからの増殖培地を移動させます。
- カルシウムとマグネシウムを含まないPBS 1mlで細胞単層を洗浄します。
- 0.5 mLのトリプシン-EDTAを加えます。慎重に料理を旋回し、トリプシンEDTAを吸引します。 37℃で3分間、5％CO 2培養プレートをインキュベートします。実際のインキュベーション時間は、使用される細胞株によって変化します。
注：この期間中、新たな12ウェルプレートを調製し、各ウェルに直径15mmの滅菌カバースリップを追加します。リジン、ラミニン、またはコラーゲンで被覆したカバースリップを容易に取り外すHEK293細胞のための細胞接着を改善することができます。 - 細胞が剥離した場合には、各ウェルに1mLの予め温めた完全増殖培地を加えます。ピペッティングにより混合し、直ちにカバースリップで12ウェルプレートに細胞の必要な数を転送します。 1 mLの総ボリュームを調整するために、各ウェルに新鮮な完全増殖培地を追加
- 37℃で24時間、5％CO 2から 16のための細胞をインキュベートします。
注：30の後に -60分間、細胞の大部分は、滅菌カバースリップに付着しているであろう。
5.共焦点顕微鏡検出
- 細胞局在
- 16後 - 細胞を12ウェルプレート中の滅菌カバースリップ上でほぼコンフルエントまで増殖させた24時間、5μMの最終濃度を与え、各ウェルに、膜プローブのDiIを加えます。細胞を37℃、5％CO 2で30分間インキュベートすることを可能にします。
- 30分後、平衡化した増殖培地を除去し、冷PBSで2回細胞を洗浄（2 - 8°C）。
- 各ウェルに（PBS中の）4％パラホルムアルデヒド溶液1mLを添加することによって細胞を固定。ゆっくり15分間攪拌します。
注意：パラホルムアルデヒドは皮膚接触や吸入によって適度に有毒である、と考えられる人間の発癌物質として指定されました。化学物質は、パラホルムアルデヒドの計量及び取り扱い中に使用されるべきであるフード、通気バランスエンクロージャまたは他の保護対策をヒューム。</ LI> - PBSで2回固定した細胞を洗浄します。各ウェルに200〜300 DAPIのμL（4' 、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）溶液（0.5μgの/ ml）を添加し、室温で10分間インキュベートします。
- PBSで細胞を2回洗浄します。注意深くプレートからカバースリップを除去し、過剰のPBSをオフ芯。マウンティング培地（50％（v / v）のグリセロール/水）の一滴を装填した顕微鏡スライド上に反転します。スライドから余分なマウンティング培地を除去。
- 細胞内在
- 16後 - 細胞を12ウェルプレート中の滅菌カバースリップ上でほぼコンフルエントまで増殖させた24時間、平衡化した増殖培地を除去し、新鮮な追加、DMEM培地（37℃）に温めました。 37℃で1時間、5％CO 2のための細胞をインキュベートします。
- 、30分間、リガンドの異なる濃度の細胞（0、10 -12、10 -9、および10 -6 M）で処理し、異なる時間、10 -6 Mのリガンドとそれらを扱う（010、30、および60分）。
- （ - 8℃2）冷PBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに（PBS中の）4％パラホルムアルデヒド溶液1mLを添加することによって細胞を固定。ゆっくり15分間攪拌します。
- PBSで細胞を2回洗浄します。注意深くプレートからカバースリップを除去し、過剰のPBSをオフ芯。マウンティング培地（50％（v / v）のグリセロール/水）の一滴を装填した顕微鏡スライド上に反転します。スライドから余分なマウンティング培地を除去。
- 共焦点顕微鏡
- 水銀ランプ電力、PC顕微鏡、スキャナー、及びレーザを含む、共焦点顕微鏡のハードウェアの電源をオン。 、ソフトウェアを起動し、オペレーティングシステムアカウントにログイン設定をチェックし、レーザーを選択します。指示に従って順番に共焦点顕微鏡システムの異なるユニットをオンにします。
- 顕微鏡ステージ上に調製されたスライドを配置します。ステージコントローラを用いて対物レンズの上にサンプルを置き。杉の油の一滴に追加油浸レンズが選択されたときにカバースリップします。レンズに直面してスライドにカバースリップを置きます。
- 蛍光顕微鏡下で目的の細胞を探します。
- スキャンモードに切り替えます。レーザパワーと発光蛍光体のスペクトル範囲を選択してください。レーザー強度と他のパラメータを調整することにより、高品質の共焦点画像をキャプチャします。
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Representative Results
図1は、共焦点顕微鏡システムの一例を示しています。 図2は、HEK293細胞内のpEGFP-N1の発現を示しています。 GFPシグナルは、細胞質および核において検出されました。 図3は、我々の以前に公表された結果15と一致し、HEK293細胞におけるS.ジャポニカからGnRHRの細胞内局在を示します。場合CLSM下Sjに GnRHR（Sjに GnRHR-EGFP）のC末端にEGFPタグを有する融合タンパク質は、この実験では緑色に見えました。 DAPIで染色した核が青色で明らかになりました。 DiI染色は赤で、細胞膜を強調しました。マージされた画像中の細胞表面上の黄色信号Sjの GnRHRの原形質膜局在を示す、赤と緑の一致を示しました。
図4および図 5ディスプレイHEK293細胞におけるSjに GnRHR内在アッセイの結果。 Sjに GnRHRの内在化を可視化するために、細胞を30分間、異なる濃度の性腺刺激ホルモン放出ホルモン（SjとのGnRH）15（ 図4）で処理し、またはそれらは、単一の濃度で処理した-異なる持続時間（10 -6 M）（ 図5）。 Sjの GnRHの非存在下で、対照（CTL）レセプター融合は、原形質膜局在でした。 図4に示すように、異なるリガンド濃度で、Sjの GnRHRの内在化は、用量依存的に進行し、そして受容体は完全に10と、細胞表面から内在した- 6 Mリガンド。 図5に示すように、10と、受容体内在化の時間経過解析の結果- 6 Mリガンドが内在することを実証しましたSJ GnRHRは、アゴニスト刺激後10分で検出可能であった、と極端な内在化は、60分で発生しました。これら二つの図から、共焦点顕微鏡で観察し、蛍光のSJ GnRHR-EGFP融合タンパク質は主に原形質膜に局在し、劇的かつ迅速にHEK293細胞中のSJのGnRHペプチドに応答して細胞内に内在化したことを明らかにしました。
図1の共焦点顕微鏡システムの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コントロールのpEGFP-N1でトランスフェクトHEK293細胞におけるGFPタンパク質の2共焦点顕微鏡図 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
共焦点顕微鏡によりHEK293細胞におけるSjに GnRHR-EGFP融合タンパク質の局在図3。 DAPIで染色された核は青色で示されています。赤で示されたDiI染色は、細胞膜を強調しています。 SJ GnRHR-EGFP融合タンパク質は緑色で示されています。マージされた画像では、黄色は赤と緑の信号の一致を示しています。すべての画像は、少なくとも3つの独立した実験を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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共焦点顕微鏡により時間経過にHEK293細胞におけるSjに GnRHR-EGFP融合タンパク質の図4内在。 Sjと GnRHR-EGFPプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞を、30分間のGnRHの異なる濃度で処理することによって活性化しました。制御ケースはのGnRH刺激（CTL）なしでした。すべての画像は、少なくとも3つの独立した実験を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
共焦点顕微鏡により用量依存的にHEK293細胞におけるSjに GnRHR-EGFP融合タンパク質の図5内在。異なるD 6 Mリガンド- Sjに GnRHR-EGFPプラスミドをトランスフェクトしたHEK293細胞を10で処理することによって活性化しましたurations。制御ケースはのGnRH刺激（CTL）なしでした。すべての画像は、少なくとも3つの独立した実験を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示されたプロトコルは、HEK293細胞で発現GPCR融合タンパク質の細胞内局在および内在化を検出するための効率的かつ容易に解釈可能な方法を提供します。技術は容易にそのようなHEK293及びBMNセル16におけるカイコからcorazonin受容体の細胞局在及び内在化用として、多数の異なる遺伝子および細胞タイプに適合させることができます。
この強力なアッセイの成功のアプリケーションは、いくつかの重要な要因に依存しています。何よりも効率的なトランスフェクションとデータ品質のために不可欠である、細胞の健康です。トランスフェクションインキュベーション時間、トランスフェクションおよび他の実験との間の間隔、及びイメージング前スリップをカバーするためにトランスフェクトされた細胞の継代は、培養細胞への損傷が可能であるすべてのステップです。したがって、細胞の健康を維持することが、この実験ではすべてのステップのための重要な前提条件であります。また、密集培養できつく圧縮された細胞を回避することは共焦点顕微鏡を用いて高品質の画像を取得するために不可欠です。 GPCRのローカライズ上の蛍光タグの影響を最小限に抑えるために、我々は、細胞内C末端に融合したEGFPとの受容体を生成しました。細胞への遺伝子の成功と効率的なトランスフェクションも重要です。トランスフェクション効率は、異なる細胞株で大きく変化してもよいです。したがって、プロトコルにおける特定の工程の最適化は、使用される特定の細胞型に応じて、必要であってもよいです。例えば、トランスフェクション法1において、FBSを含まないDMEM中にトランスフェクトされた細胞のインキュベーション時間は、細胞の状態に応じて最適化することができます。 DNAプラスミドの投与に加えて、リポソーム試薬および還元血清培地の投与量は、特定の細胞株に応じて調整されるべきです。それ以外の場合は、electrotransfection技術は、リポソーム媒介トランスフェクション試薬Fの代わりに行うことができまたは特定の細胞株に許容されるトランスフェクション効率。しかし、追加のハードウェアが必要であり、懸濁液中及び小体積中の細胞をelectrotransfectionによってトランスフェクトすることが困難であるています。現在のアッセイの真の強さは、しかし、そのようなのSJのGnRHリガンドに応答したSJ GnRHRの内在急性操作、後に同一の培養条件下で同じ細胞の変化との間の比較です。
内在化は、11を刺激するために適切な細胞応答を確実にするためにシグナリングGPCRを制御する主要な機構の1つです。私たちは、簡単に、共焦点顕微鏡で撮像して、内在の変化を観察することができます。用量および時間依存的にSjに GnRHRの内在化は明らかに図4で明らかにされています。
我々が説明したプロトコルは、簡単に他の真核生物の細胞内PRトレースに適合させることができます例えば核エストロゲン受容体17としてoteins、。しかし、プロトコルに特定のステップの最適化は、さらなる調査と実践を必要とするであろう使用される特定の細胞型に応じて、必要であろう。それにもかかわらず、タンパク質の細胞内位置は遺伝子、タンパク質修飾の同定に大きな影響を与えることを考慮し、シグナル伝達経路、発表された研究に基づいて、このプロトコルは、信頼性の高いデータや情報を提供することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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