Summary
Ce protocole décrit la détection de la microscopie confocale de l'internalisation du récepteur (GPCR) couplé à la protéine G dans les cellules de mammifères. Il comprend la culture de cellules de base, la transfection et la procédure de microscopie confocale et fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation des GPCR de fusion exprimée.
Introduction
Les cellules possèdent la machinerie de trafic de fret pour le transport extracellulaire matériaux tels que des ligands, des micro - organismes, des substances nutritives et des protéines transmembranaires dans la cellule pour obtenir des informations, de l' énergie, et d' autres buts 1, 2. Il est essentiel pour l'homéostasie cellulaire, la fonction des tissus, et la survie globale des cellules. L'expression à base de cellules de protéines de fusion fluorescentes est un moyen puissant pour étudier la localisation et l' internalisation des récepteurs transmembranaires, telles que G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), dans les voies de signalisation 3.
L'expression des protéines de fusion composées de la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria, combinée avec des techniques de détection de fluorescence directe, a acquis une large acceptation dans la recherche de ciblage de protéine 4, 5, 6. detecti à base de GFPle a l'avantage de permettre l'imagerie en temps réel des cellules vivantes tout en évitant les artefacts de fixation 7. Une série de vecteurs de clonage polyvalents a été construit pour faciliter l'expression des fusions de protéines de la GFP dans les diverses cellules 8, 9. Le vecteur pEGFP-N1 est un vecteur plasmidique commercialisé largement utilisé et codant pour une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), qui a été optimisée de la GFP de type sauvage pour la fluorescence plus brillante et une expression plus élevée dans les cellules de mammifères. Pour observer le signal fluorescent de l'EGFP exprimée dans des cellules de mammifères, la microscopie de fluorescence doit être effectuée avec l'excitation à 488 nm et l'émission à 507 nm, de préférence avec la microscopie confocale.
Le suivi de la localisation subcellulaire et l' internalisation à médiation par un ligand de récepteurs est une technique courante pour étudier la transduction du signal et la fonction des GPCR 10 up>, 11. Dans la plupart des cas, l' internalisation conduit à une désensibilisation des GPCR (l'atténuation de la réponse du stimulus , en dépit de la présence d'agonistes) 12, 13. Les récepteurs intériorisées peuvent être incorporés dans les lysosomes et dégradés, ou ils peuvent être recyclés à la surface cellulaire, en fonction de la nature des récepteurs et des lignées cellulaires utilisées dans les expériences.
Les récepteurs de l' hormone de libération des gonadotrophines (GnRHRs) appartiennent à la famille GPCR et ont une structure de protéine de GPCR typique, avec un amino - terminale extracellulaire, un terminal -COOH intracellulaire, et sept transmembranaire (TM) 14 domaines. La transfection du plasmide recombinant Sj GnRHR-EGFP (avec le gène GnRHR de Sepiella japonica) et la détection de la microscopie confocale de Sj EGFP-tagged GnRHR (exprimée dans des cellules HEK293) ont été signalés Previously, et la fluorescence de la GFP a été établi en tant que rapporteur pour les tests de localisation de la protéine transmembranaire 15. Maintenant, l'intériorisation de Sj GnRHR, activé par S. japonica hormone de libération de gonadotrophine (GnRH Sj), a été démontrée dans les manières fonction du temps et de la dose par microscopie confocale.
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Protocol
1. Préparation des cellules
- La récupération des cellules
- Transférer le rein embryonnaire humain 293 cryoconservés cellules (HEK293) à partir d'un réservoir d'azote liquide dans un bain d'eau à 37 ° C et agiter en continu pendant 1 - 2 min.
- Ajouter 10 mL de milieu de croissance Equilibrated (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution de pénicilline-streptomycine) à une boîte de culture cellulaire de 10 cm. Incorporer délicatement les cellules décongelées au milieu de croissance équilibrée.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO à chemise d' eau 2 avec une atmosphère humidifiée contenant 95% d' air et 5% de CO2 pendant 2-4 h.
- Au bout de 2 - 4 h, vérifier que les cellules sont fixées. Remplacez le milieu de croissance et de la culture pour équilibrée autre 24 - 48 h.
REMARQUE: Changer le milieu de croissance est utile car équilibrée il élimine le diméthylsulfoxyde (DMSO) et protège contre les dommages cellulaires.
- <strong> passage cellulaire
- Au bout de 24 - 48 h, lorsque les cellules sont cultivées jusqu'à confluence, éliminer le milieu de croissance équilibrée et laver les cellules avec 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Tourbillonner le plat doucement.
- Jeter le PBS et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (solution saline, 0,25% de trypsine et 0,02% d'EDTA). Pour digérer complètement les cellules, tourbillonner le plat avec soin et Aspirer la solution trypsine-EDTA. Mettre le plat dans l'incubateur à 37 ° C CO 2 à chemise d' eau pendant 3 min.
NOTE: Au cours de cette période, préparer trois nouvelles boîtes de culture cellulaire et ajouter 10 cm 10 ml de milieu de croissance équilibrée à chacun. - L'utilisation d'un microscope optique, déterminer si les cellules ont soulevé du fond de la boîte. Ajouter 2 ml de milieu de croissance équilibrée au plat. Mélanger pipetage et immédiatement pipeter 0,6 ml de la suspension cellulaire à chacun des nouveaux plats. Mélanger doucement par pipetage et laisser les cellules incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
2. Ensemencement cellulaire
- Après 24 - 48 h, lorsque les cellules ont grandi à à des passages près du confluent, jeter le milieu de croissance et équilibrée laver les cellules avec 2 ml de PBS. Tourbillonner le plat doucement.
- Jeter le PBS et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA. Pour digérer complètement les cellules, tourbillonner le plat avec soin et Aspirer la trypsine-EDTA. Mettre le plat dans l'incubateur à 37 ° C CO 2 à chemise d' eau pendant 3 min.
NOTE: Au cours de cette période, préparer une plaque à 6 puits en ajoutant 2 ml de milieu de croissance équilibrée à chaque puits. - Ajouter 1 ml de milieu de croissance équilibrée à l'antenne, si, sous observation microscopique, les cellules ont levé à partir du fond plat. Mélanger par pipetage et immédiatement pipeter 0,1 ml de suspension cellulaire (le volume est ajusté en fonction de la densité de la croissance des cellules) à chaque puits de la préparée à 6 puits plaque (plaque de cellule inférieure à 6 puits avec 2 ml de milieu de croissance équilibrée). Mélanger délicatement par pipetage et permettre aux cellulesà incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Cellule Transfection
- Procédé de transfection 1, avec des formulations de liposomes
REMARQUE: S'il vous plaît voir le tableau des matériaux pour le réactif de transfection 1.- Le lendemain, veiller à ce que les cellules doivent être de 85 - 95% confluentes.
- Ajouter 3 pg d'ADN plasmidique (500 ng / pl) et 100 ul de milieu de sérum réduit à un tube de microcentrifugation stérile et mélanger doucement. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Préparer 9 uL de réactif 1 et 100 ul de milieu sérique réduit dans un autre tube de microcentrifugeuse, et mélanger doucement. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Combiner le mélange de plasmide dilué avec le réactif dilué à 1 (volume total = 215 ul). Mélanger doucement et incuber pendant 20 min à température ambiante.
- moyen Aspirer plaque cellules cultivées, et ajouter 1,5 ml DMEM sans FBS.
- Ajouter 215 pi d'ADN-transfection mélange de réactifs à chaque goutte à goutte de puits et mélanger doucement par tourbillonnement la plaque.
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4-8 h. Remplacer par DMEM avec 10% de FBS.
- Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 - 48 h avant d' exécuter toutes les expériences.
- Procédé de transfection 2, avec des formulations de liposomes
REMARQUE: S'il vous plaît voir le tableau des matériaux pour le réactif de transfection 2.- Ajouter 2 ug d'ADN plasmidique (500 ng / pl), 4 pl de réactif 2, et 100 ul de sérum réduit support dans un tube de microcentrifugation stérile. Mélanger doucement et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de transfection aux cellules d'une manière goutte à goutte.
- Après transfection, les cellules incuber pendant 24 - 48 h à 37 ° C et 5% de CO 2, avant d' exécuter toutes les expériences.
4. Culture cellulaire sur Glissades couverture
- Rédéplacer le milieu de croissance de la culture plaque à 6 puits.
- Laver la monocouche de cellules avec 1 ml de PBS sans calcium et magnésium.
- Ajouter 0,5 ml de trypsine-EDTA. Tourbillonner le plat avec soin et Aspirer trypsine-EDTA. Incuber la plaque de culture pendant 3 min à 37 ° C et 5% de CO 2. Le temps d'incubation réelle varie avec la lignée cellulaire utilisée.
NOTE: Au cours de cette période, préparer une nouvelle plaque de 12 puits et ajouter 15 mm de diamètre couverture stérile glisse à chaque puits. Les lamelles recouvertes de lysine, la laminine ou le collagène peut améliorer la fixation des cellules pour les cellules HEK293 qui se détachent facilement. - Lorsque les cellules se détachent, ajouter 1 ml de milieu de croissance complet préchauffée à chaque puits. Mélanger par pipetage et transférer immédiatement le nombre requis de cellules à la plaque de 12 puits avec des lamelles couvre-objet. Ajouter un milieu de croissance complet frais à chaque puits pour régler le volume total à 1 ml
- Incuber les cellules pendant 16 - 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: Après 30 -60 min, la majorité des cellules aura adhéré aux lamelles stériles.
5. Détection confocale Microscopie
- localisation cellulaire
- Au bout de 16 - 24 h, lorsque les cellules sont cultivées à confluence sur des lamelles couvre-objet stérile dans la plaque à 12 puits, ajouter la sonde à membrane, Dil, à chaque puits, donnant une concentration finale de 5 uM. Laisser les cellules à incuber pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après 30 minutes, retirer le milieu de croissance équilibrée et laver les cellules deux fois dans du PBS froid (2-8 ° C).
- Fixer les cellules en ajoutant 1 ml d'une solution de paraformaldehyde à 4% (dans du PBS) dans chaque puits. Agitez doucement pendant 15 min.
Attention: paraformaldéhyde est modérément toxique par contact avec la peau ou par inhalation, et désigné comme cancérogène probable pour l'homme. Produits chimiques, les hottes de boîtiers d'équilibre ou d'autres mesures aérées de protection doivent être utilisés lors de la pesée et la manipulation de paraformaldéhyde. </ Li> - Laver deux fois les cellules fixées dans du PBS. Ajouter 200-300 ul de DAPI (4' , 6-diamidino-2-phénylindole) solution (0,5 ug / mL) à chaque puits et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS. Retirer délicatement les lamelles de la plaque et évacuer l'excès de PBS. Inverser sur des lames de microscope chargées avec une goutte de milieu de montage (50% v / v de glycérol / eau). Retirer l'excès de montage moyen des glissières.
- intériorisation cellulaire
- Au bout de 16 - 24 h, lorsque les cellules sont cultivées à confluence sur des lamelles couvre-objet stérile dans la plaque à 12 puits, enlever le milieu de croissance équilibrée et ajouter frais, réchauffé milieu DMEM (37 ° C). Incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Traiter les cellules avec différentes concentrations (0, 10 -12, 10 -9 et 10 -6 M) de ligand pendant 30 min et les traiter avec 10 -6 M ligand pour différents temps (0,10, 30 et 60 min).
- Laver les cellules deux fois dans du PBS froid (2-8 ° C). Fixer les cellules en ajoutant 1 ml d'une solution de paraformaldehyde à 4% (dans du PBS) dans chaque puits. Agitez doucement pendant 15 min.
- Laver les cellules deux fois dans du PBS. Retirer délicatement les lamelles de la plaque et évacuer l'excès de PBS. Inverser sur des lames de microscope chargées avec une goutte de milieu de montage (50% v / v de glycérol / eau). Retirer l'excès de montage moyen des glissières.
- Microscopie confocale
- Allumez le matériel du microscope confocal, y compris la puissance de la lampe au mercure, microscope PC, scanner et laser. Connectez-vous pour compte du système d'exploitation, lancez le logiciel, vérifiez la configuration et sélectionnez laser. Allumez les différentes unités du système de microscopie confocale dans l'ordre suivant les instructions.
- Placez les lames préparées sur la scène du microscope. Placez l'échantillon sur l'objectif à l'aide du contrôleur de scène. Ajouter une goutte d'huile de cèdreà lamelle lorsque la lentille à immersion d'huile est sélectionnée. Placez les lamelles de couverture sur des lames face à la lentille.
- Trouver les cellules d'intérêt sous la microscopie à fluorescence.
- Passer en mode balayage. Choisir la puissance du laser et la plage spectrale du fluorophore d'émission. Capturez les images confocale de haute qualité par l'intensité du laser d'accord et d'autres paramètres.
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Representative Results
La figure 1 montre un exemple d'un système de microscope confocal. La figure 2 présente l'expression de pEGFP-N1 dans les cellules HEK293. Le signal de la GFP a été détectée dans le cytoplasme et le noyau. La figure 3 montre la localisation subcellulaire de GnRHR de S. japonica dans les cellules HEK293, conformément à nos résultats publiés précédemment 15. La protéine de fusion avec l'étiquette EGFP à l'extrémité C-terminale de Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) est apparu vert dans cette expérience quand sous CLSM. Le noyau coloré au DAPI a été révélé en bleu. coloration DII a mis en évidence la membrane cellulaire en rouge. Le signal jaune sur la surface des cellules dans l'image fusionnée indique la coïncidence de rouge et de vert, montrant la localisation de la membrane plasmatique de Sj GnRHR.
Les figures 4 et 5 d' affichageles résultats des analyses de l' intériorisation de GNRHR Sj dans les cellules HEK293. Pour visualiser l'intériorisation de Sj GnRHR, les cellules ont été traitées avec l' hormone de libération des gonadotrophines (GnRH Sj) 15 à différentes concentrations pendant 30 minutes (Figure 4), ou ils ont été traités avec une seule concentration (10-6 M) pendant des durées différentes ( Figure 5). En l'absence de GnRH Sj, la fusion du récepteur de contrôle (CTL) a eu la localisation de la membrane plasmatique. Comme le montre la figure 4, à différentes concentrations de ligand, l'internalisation du Sj GnRHR procède d'une manière dépendante de la dose, et le récepteur a été complètement internalisé à partir de la surface de la cellule avec le 10 - 6 M de ligand. Comme le montre la figure 5, les résultats de l'analyse de l' évolution dans le temps de l' internalisation du récepteur avec 10-6 M ligand démontré que internaliséSj GnRHR était détectable 10 minutes après stimulation par l'agoniste, et l' internalisation extrême est produite par 60 min. Observation en microscopie confocale à partir de ces deux figures ont révélé que la protéine fluorescente de fusion GnRHR-EGFP Sj est principalement localisée dans la membrane du plasma et était considérablement et rapidement internalisé dans la cellule en réponse au peptide GnRH Sj dans des cellules HEK293.
Figure 1. Un exemple d'un système de microscope confocal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Microscopie confocale de protéine GFP dans le contrôle pEGFP-N1-transfecté des cellules HEK293 . S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Localisation des Sj GnRHR-EGFP protéine de fusion dans les cellules HEK293 par microscopie confocale. Le noyau coloré avec DAPI est en bleu. coloration DII, en rouge, met en évidence la membrane cellulaire. Sj GnRHR-EGFP protéine de fusion est représenté en vert. Dans l'image fusionnée, jaune indique la coïncidence des signaux rouges et verts. Toutes les images représentent au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 4. Internalisation de Sj GnRHR-EGFP protéine de fusion dans les cellules HEK293 dans un cours temps par Microscopie confocale. Des cellules HEK293 transfectées avec le plasmide Sj GnRHR-EGFP ont été activés par traitement avec différentes concentrations de GnRH pendant 30 min. Le boîtier de contrôle a été sans stimulation GnRH (CTL). Toutes les images représentent au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Internalisation de Sj GnRHR-EGFP protéine de fusion dans les cellules HEK293 dans une façon dose dépendante par Microscopie confocale. Des cellules HEK293 transfectées avec le plasmide GnRHR-EGFP Sj ont été activés par traitement avec 10-6 M de ligand différent dgurations. Le boîtier de contrôle a été sans stimulation GnRH (CTL). Toutes les images représentent au moins trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté ici fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et intériorisation de protéines de fusion GPCR exprimé dans les cellules HEK293. La technique peut être facilement adapté pour de nombreux gènes différents et types de cellules, par exemple pour la localisation cellulaire et de l' internalisation du récepteur corazonin de Bombyx mori dans des cellules HEK293 et BMN 16.
L'application réussie de cet essai puissant repose sur quelques facteurs clés. est avant tout la bonne santé des cellules, ce qui est essentiel pour la transfection efficace et la qualité des données. Le temps d'incubation de transfection, l'intervalle entre la transfection et d'autres expériences, et le passage de cellules transfectées pour couvrir les feuillets avant l'imagerie, sont toutes les étapes où les dommages aux cellules cultivées est possible. Par conséquent, le maintien de la bonne santé des cellules est une condition importante pour toutes les étapes de cette expérience. De plus, en évitant les cellules étroitement comprimées dans les cultures denses est indispensable afin d'acquérir des images de haute qualité avec la microscopie confocale. Afin de minimiser l'influence du marqueur fluorescent sur la localisation des RCPG, nous avons généré des récepteurs avec EGFP fusionné à l'extrémité C-terminale intracellulaire. La transfection réussie et efficace du gène dans les cellules est également important. l'efficacité peut varier considérablement Transfection dans différentes lignées cellulaires. Par conséquent, l'optimisation de certaines étapes du protocole peut être nécessaire, en fonction du type cellulaire particulier utilisé. Par exemple, dans une méthode de transfection, la durée d'incubation des cellules transfectées dans du DMEM sans FBS pourrait être optimisée en fonction de l'état de la cellule. En plus de la dose de plasmide d'ADN, le dosage du réactif de liposomes et la réduction des médias de sérum doivent être ajustées en fonction des lignées cellulaires spécifiques. Dans le cas contraire, la technique de électrotransfection pourrait être effectuée au lieu d'une transfection médiée par liposome réactif de fou l'efficacité de transfection acceptable dans une lignée cellulaire spécifique. Cependant, le matériel supplémentaire est nécessaire, et les cellules en suspension et dans un petit volume sont difficiles à transfecter par électrotransfection. La véritable force de l'essai en cours, cependant, réside dans la comparaison entre les changements dans les mêmes cellules dans des conditions de culture identiques après des manipulations de courte durée, telles que l'internalisation des Sj GnRHR en réponse au ligand de la GnRH de Sj.
L' internalisation est l' un des mécanismes prédominants de commande GPCR de signalisation pour garantir des réponses cellulaires à des stimuli appropriés 11. Nous pouvons facilement observer les changements de intériorisation grâce à l'imagerie par microscopie confocale. L'internalisation de Sj GnRHR dans une dose et dépendante du temps est clairement révélé dans la figure 4.
Le protocole que nous avons décrit peut être facilement adaptée au tracé subcellulaire d'autres pr eucaryotesoteins, tels que le récepteur d'oestrogène nucléaire 17. Cependant, l'optimisation de certaines étapes du protocole sera nécessaire, en fonction des types cellulaires particuliers utilisés, ce qui nécessitera une exploration plus poussée et la pratique. Néanmoins, étant donné que la localisation subcellulaire des protéines a une grande influence sur l'identification des gènes, des modifications de protéines, et les voies de signalisation, ce protocole, sur la base des recherches publiées, peut fournir des données fiables et des informations.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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