Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लिगेंड सक्रिय जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर internalization की जांच

Published: April 9, 2017 doi: 10.3791/55514
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

Summary

यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिकाओं में जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (GPCR) internalization की कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का पता लगाने का वर्णन है। यह बुनियादी सेल संस्कृति, अभिकर्मक, और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी प्रक्रिया भी शामिल है और subcellular स्थानीयकरण और संलयन-व्यक्त GPCR के internalization पता लगाने के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है।

Introduction

कोशिकाओं के परिवहन के लिए माल की तस्करी मशीनरी के अधिकारी बाह्य सामग्री-जैसे लाइगैंडों, सूक्ष्मजीवों, पोषक तत्वों, और transmembrane प्रोटीन-में जानकारी, ऊर्जा, और अन्य प्रयोजनों के 1, 2 के लिए सेल। यह सेलुलर homeostasis, ऊतक समारोह, और कुल मिलाकर सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की कोशिका आधारित अभिव्यक्ति रास्ते 3 संकेत में स्थानीयकरण और इस तरह जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCR) के रूप में transmembrane रिसेप्टर्स,, के internalization का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है।

जेलीफ़िश Aequorea विक्टोरिया से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति, प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति पता लगाने की तकनीक के साथ संयुक्त, में व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है प्रोटीन को लक्षित अनुसंधान 4, 5, 6। GFP आधारित detectiपर कोशिकाओं रहते हुए निर्धारण कलाकृतियों 7 से बचने के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देता का लाभ दिया है। बहुमुखी प्रतिरूपण वेक्टर्स की एक श्रृंखला, 9 विभिन्न कोशिकाओं 8 में GFP के लिए प्रोटीन fusions की अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए निर्माण किया गया है। pEGFP-N1 वेक्टर एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और वाणिज्यीकरण प्लाज्मिड एक बेहतर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) है, जो उज्जवल प्रतिदीप्ति और स्तनधारी कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति के लिए जंगली प्रकार GFP से अनुकूलित किया गया है एन्कोडिंग वेक्टर है। EGFP के फ्लोरोसेंट संकेत स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त निरीक्षण करने के लिए, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 488 एनएम पर उत्तेजना और 507 एनएम पर उत्सर्जन, अधिमानतः कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ साथ आयोजित किया जाना चाहिए।

Subcellular स्थानीयकरण और रिसेप्टर्स की ligand की मध्यस्थता internalization निगरानी एक आम तकनीक संकेत पारगमन और GPCRs 10 के समारोह की जांच के लिए है 11 अप,। ज्यादातर मामलों में, internalization GPCRs के विसुग्राहीकरण (एगोनिस्ट की उपस्थिति के बावजूद प्रोत्साहन प्रतिक्रिया के क्षीणन) 12, 13 की ओर जाता है। भाँति रिसेप्टर्स लाइसोसोम में शामिल किया जा सकता है और अपमानित, या वे वापस कोशिका की सतह को रिसेप्टर्स और सेल प्रयोगों में इस्तेमाल किया लाइनों की प्रकृति के आधार पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता।

गोनॉडोट्रॉफिन- रिलीजिंग हार्मोन रिसेप्टर्स (GnRHRs) GPCR परिवार के हैं और एक बाह्य अमीनो टर्मिनल, एक intracellular -COOH टर्मिनल के साथ, एक ठेठ GPCR प्रोटीन संरचना है, और सात transmembrane (टीएम) डोमेन 14। पुनः संयोजक प्लाज्मिड Sj GnRHR-EGFP के अभिकर्मक (Sepiella जापोनिका से GnRHR जीन के साथ) और EGFP-टैग Sj GnRHR (HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त) की कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का पता लगाने Previou सूचना मिली थीधूर्त, और GFP प्रतिदीप्ति transmembrane प्रोटीन स्थानीयकरण assays 15 के लिए एक पत्रकार के रूप में स्थापित किया गया था। अब, Sj GnRHR के internalization, द्वारा एस जापोनिका गोनॉडोट्रॉफिन- रिलीजिंग हार्मोन (Sj GnRH) सक्रिय, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा समय- और खुराक पर निर्भर शिष्टाचार में प्रदर्शित किया गया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल तैयारी

  1. सेल वसूली
    1. एक 37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान करने के लिए एक तरल नाइट्रोजन टैंक से cryopreserved मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं स्थानांतरण और 1 के लिए लगातार हिला - 2 मिनट।
    2. संतुलित विकास का माध्यम के 10 एमएल (Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान) एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में जोड़े। धीरे संतुलित विकास का माध्यम, thawed कोशिकाओं जोड़ें।
    3. 4 घंटे - 2 के लिए 95% हवा और 5% सीओ 2 से युक्त एक humidified वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी जैकेट सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं सेते हैं।
    4. 2 के बाद - 4 घंटे, जाँच करें कि कोशिकाओं जुड़े होते हैं। 48 h - एक और 24 के लिए संतुलित विकास का माध्यम और संस्कृति बदलें।
      नोट: संतुलित विकास का माध्यम बदलने उपयोगी है क्योंकि यह डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) दूर करता है और कोशिका क्षति के खिलाफ सुरक्षा करता है।
  2. <strong> सेल बीतने
    1. 24 के बाद - 48 घंटे, जब कोशिकाओं के पास संगम गए हैं, संतुलित विकास का माध्यम त्यागने और फॉस्फेट बफर खारा के 2 एमएल (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोने। पकवान भंवर धीरे।
    2. पीबीएस त्यागें और ट्रिप्सिन- EDTA के 1 एमएल (खारा, 0.25% ट्रिप्सिन, और 0.02% EDTA) जोड़ें। पूरी तरह से कोशिकाओं को पचाने के लिए, पकवान ध्यान से चक्कर आने और ट्रिप्सिन- EDTA समाधान बंद aspirate। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी जैकेट सीओ 2 इनक्यूबेटर में पकवान रखो।
      नोट: इस अवधि के दौरान तीन नए 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन तैयार करने और प्रत्येक के लिए संतुलित विकास का माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
    3. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करना, यह निर्धारित करता है, तो कोशिकाओं पकवान के नीचे से उठा लिया है। संतुलित विकास का माध्यम के 2 एमएल पकवान में जोड़े। pipetting द्वारा मिक्स और तुरंत नए व्यंजनों से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन की 0.6 एमएल pipet। धीरे pipetting द्वारा मिश्रण और कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में सेते हैं करने के लिए अनुमति देते हैं।

    2. सेल सीडिंग

    1. 24 के बाद - 48 घंटे, जब passaged कोशिकाओं के पास संगम गए हैं, संतुलित विकास का माध्यम त्यागने और पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने। पकवान भंवर धीरे।
    2. पीबीएस त्यागें और ट्रिप्सिन- EDTA के 1 एमएल जोड़ें। पूरी तरह से कोशिकाओं को पचाने के लिए, पकवान ध्यान से चक्कर आने और ट्रिप्सिन- EDTA बंद aspirate। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी जैकेट सीओ 2 इनक्यूबेटर में पकवान रखो।
      नोट: इस अवधि के दौरान अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए संतुलित विकास का माध्यम के 2 एमएल जोड़कर एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं।
    3. संतुलित विकास का माध्यम के 1 एमएल पकवान में जोड़े, अगर, सूक्ष्म निगरानी में, कोशिकाओं पकवान नीचे से उठा लिया गया है। pipetting द्वारा मिक्स और तुरंत तैयार 6 अच्छी तरह से थाली (संतुलित विकास का माध्यम के 2 एमएल के साथ सेल-कम 6-अच्छी तरह से थाली) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन की 0.1 एमएल (मात्रा कोशिकाओं की वृद्धि घनत्व के अनुसार समायोजित किया जाता है) pipet। धीरे pipetting द्वारा मिश्रण और कोशिकाओं की अनुमति देते हैं37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2 के लिए।

    3. सेल अभिकर्मक

    1. अभिकर्मक विधि 1, लाइपोसोम योगों के साथ
      नोट: कृपया अभिकर्मक अभिकर्मक 1 के लिए सामग्री की तालिका देखें।
      1. अगले दिन, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं 85 होना चाहिए - 95% संगामी।
      2. प्लाज्मिड डीएनए (500 एनजी / μL) और कम सीरम मीडिया के 100 μL के 3 माइक्रोग्राम एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जोड़े, और धीरे मिश्रण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. अभिकर्मक 1 और एक अन्य microcentrifuge ट्यूब में कम सीरम मीडिया के 100 μL के 9 μL तैयार है, और धीरे मिश्रण। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      4. पतला अभिकर्मक 1 (कुल मात्रा = 215 μL) से पतला प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ें। धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
      5. बंद कोशिकाओं-सुसंस्कृत थाली मध्यम महाप्राण, और एफबीएस बिना 1.5 एमएल ताजा DMEM जोड़ें।
      6. डीएनए स्ि्न्ंतरर के 215 μL जोड़ेंप्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए dropwise ection अभिकर्मक मिश्रण है, और थाली घूमता द्वारा धीरे मिश्रण।
      7. 8 घंटे - 4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2। 10% एफबीएस के साथ ताजा DMEM के साथ बदलें।
      8. किसी भी प्रयोग को चलाने से पहले 48 घंटे - एक और 24 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. अभिकर्मक विधि 2, लाइपोसोम योगों के साथ
      नोट: कृपया अभिकर्मक अभिकर्मक 2 के लिए सामग्री की तालिका देखें।
      1. प्लाज्मिड डीएनए के 2 माइक्रोग्राम (500 एनजी / μL), अभिकर्मक 2 के 4 μL, और 100 μL कम सीरम मीडिया एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें। धीरे मिश्रण और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      2. एक dropwise ढंग से कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे और 5% सीओ 2 कोई भी प्रयोग चलाने से पहले - अभिकर्मक के बाद, 24 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।

    4. कवर पर्ची पर सेल संस्कृति

    1. फिर सेसंस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली से विकास का माध्यम चलते हैं।
    2. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के 1 एमएल के साथ सेल monolayer धो लें।
    3. 0.5 एमएल ट्रिप्सिन- EDTA जोड़ें। पकवान ध्यान से भंवर और ट्रिप्सिन- EDTA बंद aspirate। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए संस्कृति थाली सेते हैं। वास्तविक ऊष्मायन समय सेल का इस्तेमाल किया लाइन के साथ बदलता रहता है।
      नोट: इस अवधि के दौरान एक नया 12-अच्छी तरह से थाली तैयार करने और 15 मिमी व्यास बाँझ कवर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए निकल जाता है जोड़ें। कवर लाइसिन, laminin, या कोलेजन के साथ लेपित फिसल जाता है HEK293 कोशिकाओं है कि आसानी से अलग के लिए सेल लगाव सुधार हो सकता है।
    4. जब कोशिकाओं अलग कर रहे हैं, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 एमएल पूर्व गर्म पूरा विकास माध्यम जोड़ें। pipetting द्वारा मिक्स और तुरंत कवर फिसल जाता है के साथ 12-अच्छी तरह से थाली करने के लिए कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या को हस्तांतरण। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सिरे से पूरा विकास माध्यम जोड़ें 1 एमएल के लिए कुल मात्रा समायोजित करने के लिए
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे और 5% सीओ 2 - 16 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: 30 के बाद -60 मिनट, कोशिकाओं के बहुमत बाँझ कवर फिसल जाता है का पालन किया गया होगा।

    5. Confocal माइक्रोस्कोपी जांच

    1. सेलुलर स्थानीयकरण
      1. 16 के बाद - 24 घंटे, जब कोशिकाओं 12 अच्छी तरह से थाली में बाँझ कवर फिसल जाता है पर पास संगम गए हैं, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, झिल्ली जांच, DiI जोड़ने के लिए, 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता दे रही है। कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते की अनुमति दें।
      2. 30 मिनट के बाद, संतुलित विकास का माध्यम हटाने और कोशिकाओं ठंड पीबीएस में दो बार धोना (2 - 8 डिग्री सेल्सियस)।
      3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान (पीबीएस में) के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। धीरे 15 मिनट के लिए आंदोलन।
        सावधानी: Paraformaldehyde मामूली त्वचा से संपर्क या साँस लेना द्वारा विषाक्त है, और एक संभावित मानव कैसरजन के रूप में नामित। रसायन फन, निकाल संतुलन बाड़ों या अन्य सुरक्षा उपायों धूआं paraformaldehyde के वजन और हैंडलिंग के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए। </ Li>
      4. तय कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धोएं। 200-300 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) समाधान (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल) की μL प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      5. कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोएं। ध्यान से थाली से कवर फिसल जाता है को हटाने और अतिरिक्त पीबीएस बाती। खुर्दबीन स्लाइड बढ़ते मध्यम (50% v / v ग्लिसरॉल / पानी) की एक बूंद के साथ भरी हुई पर उल्टें। स्लाइड से अतिरिक्त बढ़ते मध्यम निकालें।
    2. सेलुलर internalization
      1. 16 के बाद - 24 घंटे, जब कोशिकाओं 12 अच्छी तरह से थाली में बाँझ कवर फिसल जाता है पर पास संगम गए हैं, संतुलित विकास का माध्यम को हटाने और नए सिरे से जोड़ने के लिए, DMEM मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) गरम। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      2. 30 मिनट के लिए (, 0 से 10 -12, 10 -9, और 10 -6 एम) विभिन्न सांद्रता के साथ कोशिकाओं के इलाज ligand की और उन्हें अलग अलग समय के लिए 10 -6 एम ligand (0 के साथ व्यवहार करते हैं,10, 30, और 60 मिनट)।
      3. (- 8 डिग्री सेल्सियस 2) कोशिकाओं ठंड पीबीएस में दो बार धोएं। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान (पीबीएस में) के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। धीरे 15 मिनट के लिए आंदोलन।
      4. कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धोएं। ध्यान से थाली से कवर फिसल जाता है को हटाने और अतिरिक्त पीबीएस बाती। खुर्दबीन स्लाइड बढ़ते मध्यम (50% v / v ग्लिसरॉल / पानी) की एक बूंद के साथ भरी हुई पर उल्टें। स्लाइड से अतिरिक्त बढ़ते मध्यम निकालें।
    3. संनाभि माइक्रोस्कोपी
      1. कोंफोकल माइक्रोस्कोप के हार्डवेयर को चालू करें, पारा दीपक बिजली, पीसी माइक्रोस्कोप, स्कैनर, और लेजर सहित। ऑपरेटिंग सिस्टम खाते में लॉगिन करें, सॉफ्टवेयर लांच, विन्यास की जाँच करें और लेजर का चयन करें। निर्देशों के अनुसार क्रम में कोंफोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली के विभिन्न इकाइयों को चालू करें।
      2. खुर्दबीन मंच पर तैयार स्लाइड रखें। चरण नियंत्रक का उपयोग ऑब्जेक्टिव लेंस से अधिक नमूना रखें। पर देवदार तेल की एक बूंद जोड़ेंजब तेल विसर्जन लेंस का चयन किया जाता coverslip करने के लिए। लेंस का सामना करना पड़ स्लाइड पर कवर फिसल जाता है रखें।
      3. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाएं।
      4. मोड स्कैन करने के लिए स्विच करें। लेजर शक्ति और उत्सर्जन फ्लोरोफोरे के वर्णक्रम सीमा का चयन करें। लेजर ट्यूनिंग तीव्रता और अन्य पैरामीटर द्वारा उच्च गुणवत्ता कोंफोकल छवियों कैप्चर करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली का एक उदाहरण दिखाता है। चित्र 2 HEK293 कोशिकाओं में pEGFP-N1 की अभिव्यक्ति प्रस्तुत करता है। GFP संकेत कोशिका द्रव्य और नाभिक में खोजा गया था। 3 चित्र subcellular HEK293 कोशिकाओं में एस जापोनिका से GnRHR का स्थानीयकरण, हमारे पहले प्रकाशित परिणाम 15 के साथ संगत को दर्शाता है। Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) के सी टर्मिनस पर EGFP टैग के साथ संलयन प्रोटीन इस प्रयोग में हरे रंग की दिखाई दिया जब CLSM के तहत। नाभिक DAPI के साथ दाग नीले रंग में पता चला था। DiI धुंधला लाल रंग में कोशिका झिल्ली पर प्रकाश डाला। मर्ज किए गए छवि में कोशिका की सतह पर पीले सिग्नल लाल और हरे रंग का संयोग संकेत दिया, एसजे GnRHR के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण का प्रदर्शन है।

आंकड़े 4 और 5 प्रदर्शनHEK293 कोशिकाओं में Sj GnRHR internalization assays का परिणाम है। Sj GnRHR के internalization कल्पना करने के लिए, कोशिकाओं 30 मिनट (चित्रा 4) के लिए गोनॉडोट्रॉफिन- रिलीजिंग हार्मोन (Sj GnRH) 15 विभिन्न सांद्रता में साथ इलाज किया गया, या वे एक ही एकाग्रता के साथ इलाज किया गया - विभिन्न अवधियों के लिए (10 6 एम) ( चित्रा 5)। Sj GnRH के अभाव में, नियंत्रण (सीटीएल) रिसेप्टर संलयन प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण था। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, अलग ligand सांद्रता में, एसजे GnRHR के internalization एक खुराक पर निर्भर ढंग से रवाना हुए, और रिसेप्टर पूरी तरह से 10 के साथ कोशिका की सतह से भली भाँति था - 6 एम ligand। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 5, 10 के साथ रिसेप्टर internalization के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण के परिणाम - 6 एम ligand प्रदर्शन किया है कि भली भाँतिSj GnRHR एगोनिस्ट उत्तेजना के बाद 10 मिनट के पता लगाने योग्य था, और चरम internalization 60 मिनट से हुई। इन दोनों आंकड़ों से कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ अवलोकन से पता चला कि फ्लोरोसेंट Sj GnRHR-EGFP संलयन प्रोटीन मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीय किया गया था और था नाटकीय रूप से और तेजी से HEK293 कोशिकाओं में Sj GnRH पेप्टाइड के जवाब में सेल में भली भाँति।

आकृति 1
चित्र 1 एक confocal खुर्दबीन प्रणाली का एक उदाहरण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. नियंत्रण में GFP प्रोटीन की confocal माइक्रोस्कोपी pEGFP-N1-ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं । यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा HEK293 कोशिकाओं में Sj GnRHR-EGFP संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण। नाभिक DAPI के साथ दाग नीले रंग में दिखाया गया है। DiI धुंधला, लाल रंग में दिखाया, कोशिका झिल्ली पर प्रकाश डाला गया। Sj GnRHR-EGFP संलयन प्रोटीन हरे रंग में दिखाया गया है। मर्ज किए गए छवि में, पीले, लाल और हरे रंग संकेतों के संयोग इंगित करता है। सभी छवियों कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ig4.jpg "/>
चित्रा 4. एक समय पाठ्यक्रम Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा में HEK293 कोशिकाओं में Sj GnRHR-EGFP संलयन प्रोटीन की Internalization। HEK293 कोशिकाओं Sj GnRHR-EGFP प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 30 मिनट के लिए GnRH के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज से सक्रिय थे। नियंत्रण मामले GnRH उत्तेजना (सीटीएल) के बिना किया गया था। सभी छवियों कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एक खुराक निर्भर तरीके से HEK293 कोशिकाओं में Sj GnRHR-EGFP संलयन प्रोटीन की Internalization। विभिन्न घ के लिए 6 एम ligand - HEK293 कोशिकाओं Sj GnRHR-EGFP प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 10 के साथ इलाज के द्वारा सक्रिय किया गयाurations। नियंत्रण मामले GnRH उत्तेजना (सीटीएल) के बिना किया गया था। सभी छवियों कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल subcellular स्थानीयकरण और HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त GPCR संलयन प्रोटीन के internalization पता लगाने के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्या तरीका प्रदान करता है। तकनीक आसानी से सेलुलर स्थानीयकरण और HEK293 और BMN कोशिकाओं 16 में बॉम्बिक्स मोरी से corazonin रिसेप्टर का internalization के लिए के रूप में कई अलग अलग जीन और प्रकार की कोशिकाओं, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस शक्तिशाली परख के सफल आवेदन में कुछ महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करता है। सबसे महत्वपूर्ण कोशिकाओं के अच्छे स्वास्थ्य, जो कुशल अभिकर्मक और डेटा की गुणवत्ता के लिए आवश्यक है। अभिकर्मक ऊष्मायन समय, अभिकर्मक और अन्य प्रयोगों, और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के पारित होने से पहले इमेजिंग फिसल जाता है कवर करने के लिए के बीच अंतराल, सभी कदम जहां संवर्धित कोशिकाओं को नुकसान संभव है कर रहे हैं। इसलिए, कोशिकाओं की अच्छा स्वास्थ्य बनाए रखने इस प्रयोग में सभी चरणों के लिए बेहद आवश्यक होता है। इसके अलावा, घने संस्कृतियों में कसकर संकुचित कोशिकाओं से परहेज उच्च गुणवत्ता छवियों कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त करने के क्रम में महत्वपूर्ण है। GPCRs के स्थानीयकरण पर फ्लोरोसेंट टैग के प्रभाव को कम करने के लिए, हम intracellular सी टर्मिनस के लिए जुड़े हुए EGFP साथ रिसेप्टर्स उत्पन्न। कोशिकाओं में जीन की सफल और कुशल अभिकर्मक भी महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक दक्षता अलग सेल लाइनों में काफी भिन्नता हो सकती है। इसलिए, प्रोटोकॉल में कुछ कदम की अनुकूलन, आवश्यक हो सकता है इस्तेमाल किया विशेष कक्ष प्रकार के आधार पर। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक विधि 1 में, एफबीएस बिना DMEM में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के ऊष्मायन अवधि सेल स्थिति के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। डी एन ए प्लास्मिड की खुराक के अलावा, लाइपोसोम अभिकर्मक की खुराक और कम सीरम मीडिया विशिष्ट सेल लाइनों के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। अन्यथा, electrotransfection तकनीक के बजाय लाइपोसोम अभिकर्मक मध्यस्थता अभिकर्मक च आयोजित किया जा सकता हैया एक विशिष्ट सेल लाइन में स्वीकार्य अभिकर्मक दक्षता। हालांकि, अतिरिक्त हार्डवेयर की आवश्यकता होती है, और निलंबन में और एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं electrotransfection द्वारा transfect करने के लिए मुश्किल हो जाता है। वर्तमान परख का असली ताकत है, तथापि, इस तरह के Sj GnRH ligand के जवाब में Sj GnRHR के internalization के रूप में तीव्र जोड़तोड़, के बाद समान संस्कृति शर्तों के तहत एक ही कोशिकाओं में परिवर्तन के बीच तुलना में निहित है।

Internalization 11 उत्तेजना करने के उचित सेलुलर प्रतिक्रियाओं सुनिश्चित करने के लिए संकेत GPCR नियंत्रित प्रमुख तंत्रों में से एक है। हम आसानी से कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के माध्यम से internalization में परिवर्तन देख सकते हैं। एक खुराक और समय पर निर्भर ढंग से Sj GnRHR के internalization स्पष्ट रूप से चित्र 4 में पता चला है।

प्रोटोकॉल हम वर्णन किया है आसानी से अन्य यूकेरियोटिक जनसंपर्क के subcellular ट्रेसिंग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताजैसे परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर 17 के रूप में oteins,। हालांकि, प्रोटोकॉल में कुछ कदम की अनुकूलन इस्तेमाल किया विशेष प्रकार की कोशिकाओं है, जो आगे की खोज और अभ्यास की आवश्यकता होगी के आधार पर, आवश्यक होगा। फिर भी, यह देखते हुए कि प्रोटीन की subcellular स्थान जीन, प्रोटीन संशोधनों की पहचान पर काफी प्रभाव है, और रास्ते संकेत, इस प्रोटोकॉल, प्रकाशित शोध के आधार पर, विश्वसनीय डेटा और जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cell line 
DMEM/High glucose Hyclone SH30022.01 High glucose 4.0 mM L-glutamine
Fetal Bovine Serum (FBS) PuFei 1101-100
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genom GNM10010
Penicillin-Streptomycin Genom GNM15140
0.25% Trypsin & 0.02% EDTA Genom GNM25200
Opti-MEM (1x) GIBCO, by Life Technologies 31985-062 reduced serum media
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027 Reagent 1
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche 6366236001 Reagent 2
DAPI Staining Solution Beyotime C1006
DiI Beyotime C1036
Antifade Mounting Medium Beyotime P0126
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) 80096618
100 mm cell culture CORNING 430167
6-well plate  ExCell Bio CS016-0092
12-well plate  ExCell Bio CS016-0093
Cover Glass NEST 801007
Microscope Slides Citoglas 10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubator Thermo 3111
TCS SP5II laser scanning confocal microscope Leica  5100001311

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
  4. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
  5. Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
  6. Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
  7. von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
  8. Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
  9. Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
  10. Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
  11. Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
  12. Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
  13. Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
  14. Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
  15. Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
  16. Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
  17. Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 122 subcellular स्थानीयकरण internalization GPCR GnRHR GFP कोंफोकल माइक्रोस्कोपी
Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा लिगेंड सक्रिय जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर internalization की जांच
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Yan, Y., Xiang, X., Xu,… More

Yang, J., Yan, Y., Xiang, X., Xu, Y., Zhou, N., Wang, T. Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55514, doi:10.3791/55514 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter