Summary
Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.
Introduction
Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke 1, 2. Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran - Rezeptoren, wie G - Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg 3.
Die Expression von Fusionsproteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert aus Qualle Aequorea victoria, direkte Fluoreszenznachweistechniken kombiniert werden , hat breite Akzeptanz in Protein-Targeting Research 4, 5, 6 gewonnen. GFP-basierte DETECTIauf den Vorteil der Echtzeit - Abbildung von lebenden Zellen ermöglicht , während Fixations Artefakte vermieden 7. Eine Reihe von vielseitigen Klonierungsvektoren wurde in verschiedenen Zellen 8, 9 , die Expression von Proteinfusionen auf GFP zu erleichtern konstruiert. Der pEGFP-N1-Vektor ist ein weit verbreiteter und kommerzialisierte Plasmidvektor ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodieren, die für hellere Fluoreszenz und höhere Expression in Säugerzellen von Wildtyp-GFP optimiert wurde. Um das Fluoreszenzsignal von EGFP zu beobachten in Säugerzellen exprimiert, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit einer Anregung bei 488 nm und der Emission bei 507 nm, vorzugsweise mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden.
Überwachung der subzellulären Lokalisation und Ligand-vermittelte Internalisierung der Rezeptoren ist eine übliche Technik , die die Signaltransduktion und Funktion von GPCRs 10 zu untersuchen , 11. In den meisten Fällen führt zu Internalisierung Desensibilisierung der GPCRs (die Dämpfung der Reizantwort , trotz der Anwesenheit von Agonisten) 12, 13. Die internalisierten Rezeptoren können in die Lysosomen aufgenommen werden und abgebaut werden, oder sie können wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden, abhängig von der Art der Rezeptoren und die in den Experimenten verwendeten Zelllinien.
Die Gonadotropin-Releasing - Hormon - Rezeptoren (GnRHRs) gehören zu der GPCR - Familie und haben eine typische GPCR - Proteinstruktur, mit einer extrazellulären aminoterminalen, ein intrazelluläres -COOH - Terminal, und sieben Transmembran (TM) -Domäne 14. Die Transfektion des rekombinanten Plasmids Sj GnRHR-EGFP (mit den GnRHR - Genen aus Sepiella japonica) und der konfokalen Mikroskopie Nachweis von EGFP-markierten Sj GnRHR (in HEK293 - Zellen exprimiert) wurden berichtet früsly und GFP - Fluoreszenz wurde 15 als Reporter für Transmembranprotein Lokalisierungs Assays etabliert. Nun wird die Internalisierung von Sj GnRHR, aktiviert durch S. japonica Gonadotropin-Releasing - Hormon (GnRH Sj) wurde in zeit- und dosisabhängigen Art und Weise durch konfokale Mikroskopie demonstriert.
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Protocol
1. Zellpräparation
- Zellgewinnung
- Übertragen der kryokonservierten menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (HEK293) aus einem Flüssigstickstofftank zu einem 37 ° C Wasserbad und schütteln kontinuierlich für 1 bis 2 min.
- 10 ml äquilibriertem Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) zu einer 10-cm Zellkulturschale. fügen Sie vorsichtig die aufgetauten Zellen auf das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium.
- Inkubieren die Zellen in einem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO 2 für 2 - 4 Stunden.
- Nach 2 bis 4 Stunden, überprüfen Sie, dass die Zellen gebunden sind. Ersetzen Sie das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium und Kultur für eine weitere 24 bis 48 h.
HINWEIS: Um das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium zu ändern, ist nützlich, weil es Dimethylsulfoxid entfernt (DMSO) und schützt vor Zellschäden.
- <strong> Zellpassage
- Nach 24 bis 48 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht.
- Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA (Kochsalzlösung, 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA). Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen die Trypsin-EDTA-Lösung. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator für 3 min.
HINWEIS: In dieser Zeit bereitet drei neue 10-cm-Zellkulturschalen und 10 ml Medium zu jedem ins Gleichgewicht gebracht Wachstums hinzuzufügen. - Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, festzustellen, ob die Zellen vom Boden der Schale angehoben haben. In 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in die Schale. Mischen durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,6 ml der Zellsuspension zu jeder der neuen Gerichte. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren.
2. Zell Seeding
- Nach 24 bis 48 h, wenn die passagierten Zellen nahe Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml PBS waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht.
- Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA. Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen den Trypsin-EDTA. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO 2 -Inkubator für 3 min.
HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine 6-Well-Platte durch Zugabe von 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in jeder Vertiefung. - 1 ml Wachstumsmedium equilibriert in die Schale, wenn, unter mikroskopischer Beobachtung, um die Zellen von der Schale Boden abgehoben zu haben. Mischte durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,1 ml der Zellsuspension (das Volumen wird so eingestellt, entsprechend die Zellwachstumsdichte) zu jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 6 Vertiefungen (cell-less 6-Well-Platte mit 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium). Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellenbei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren.
3. Zelltransfektion
- Transfektionsverfahren 1, mit Liposomformulierungen
HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 1.- Am folgenden Tag, stellen Sie sicher, dass die Zellen 85 sein sollte - 95% konfluent.
- Hinzufügen 3 ug Plasmid-DNA (500 ng / ul) und 100 ul reduzierten Serummedien in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten 9 & mgr; l Reagenz 1 und 100 & mgr; l der reduzierten Serummedium in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
- Kombinieren des verdünnten Gemisches mit Plasmid verdünnt Reagenz 1 (Gesamtvolumen = 215 ul). Vorsichtig mischen und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
- Aspirat Medium aus Zellen kultiviert Platte, und 1,5 ml frisches DMEM ohne FBS hinzuzufügen.
- In 215 & mgr; l DNA-transfection Reagenzmischung zu jeder Vertiefung tropft und vorsichtig mischen, indem die Platte wirbelnden.
- Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 - 8 h. Ersetzen mit frischem DMEM mit 10% FBS.
- Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für weitere 24 bis 48 h , bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird .
- Transfektionsverfahren 2, mit Liposomformulierungen
HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 2.- Fügen Sie 2 ug Plasmid-DNA (500 ng / & mgr; l), 4 & mgr; l Reagenz 2 und 100 & mgr; l reduzierten Serummedium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen in tropfenweise.
- Nach der Transfektion inkubieren Zellen für 24 bis 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2, bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird .
4. Zellkultur auf Deckgläser
- Rebewegen, um das Wachstumsmedium aus der Kultur 6-Well-Platte.
- Waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS ohne Calcium und Magnesium.
- In 0,5 ml Trypsin-EDTA. Schwenken Sie die Schale vorsichtig und absaugen Trypsin-EDTA. Inkubieren der Kulturplatte für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Die tatsächliche Inkubationszeit variiert mit der Zelllinie verwendet.
HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine neue 12-Well-Platte und 15 mm Durchmesser hinzuzufügen sterile Abdeckung zu jeder Vertiefung rutscht. Deckplättchen beschichtet mit Lysin, Laminin oder Kollagen kann Zellanheftung für HEK293-Zellen verbessern, die sich leicht lösen. - Wenn Zellen abgelöst sind, 1 ml vorgewärmtem vollständige Wachstumsmedium in jeder Vertiefung. Mischen durch Pipettieren und sofort übertragen, um die erforderliche Anzahl von Zellen in die 12-Well-Platte mit Deckgläsern. In frisches vollständiges Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung das Gesamtvolumen auf 1 ml einzustellen
- Inkubieren der Zellen für 16 bis 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
HINWEIS: Nach 30 -60 min, haben die Mehrzahl der Zellen in den sterilen Deckgläschen geklebt.
5. konfokale Mikroskopie Nachweis
- zelluläre Lokalisation
- Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, fügen die Membransonde DiI, in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 5 & mgr; M ergibt. Lassen Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren.
- Nach 30 min Entfernen des Wachstumsmediums ins Gleichgewicht gebracht und die Zellen zweimal in kaltem PBS waschen (2 - 8 ° C).
- Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren.
Achtung: Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Einatmen und als wahrscheinlich krebserzeugend beim Menschen bezeichnet. Chemikalien Abzugshauben, belüftete Balance-Gehäuse oder anderen Schutzmaßnahmen werden während des Wiegens und die Handhabung von Paraformaldehyd verwendet werden. </ Li> - Waschen der fixierten Zellen zweimal in PBS. Hinzufügen 200-300 uL DAPI (4' , 6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung (0,5 ug / ml) in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht aus überschüssigem PBS. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien.
- Cellular Internalisierung
- Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, das äquilibrierte Wachstumsmedium entfernen und frische hinzufügen, erwärmt DMEM-Medium (37 ° C). Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Behandeln , um die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen (0, 10 -12, 10 -9 und 10 -6 M) von Liganden für 30 min und behandelt sie mit 10 -6 M Ligand für verschiedene Zeiten (0,10, 30 und 60 min).
- Wasche die Zellen zweimal in kaltem PBS (2 - 8 ° C). Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren.
- Wasche die Zellen zweimal in PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht die überschüssige PBS ab. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien.
- Die konfokale Mikroskopie
- Schalten Sie die Hardware der konfokalen Mikroskop, einschließlich der Quecksilberlampenleistung, PC Mikroskop, Scanner und Laser. Login für das Betriebssystemkonto, um die Software starten, überprüfen Sie die Konfiguration und wählt Laser. Schalten Sie die verschiedenen Einheiten der konfokalen Mikroskopie-System in der Reihenfolge entsprechend den Anweisungen.
- Legen Sie die vorbereiteten Folien auf dem Mikroskoptisch. Platzieren Sie die Probe über die Objektivlinse unter Verwendung der Stufensteuerung. Einen Tropfen Zedernöl aufzu Deckglas, wenn die Linse Ölkapselung ausgewählt ist. Legen Sie die Deckgläser auf Objektträger der Linse gegenüber.
- Finden Sie die Zellen von Interesse unter der Fluoreszenzmikroskopie.
- Schalten Sie Modus zu scannen. Wählen Sie die Laserleistung und den spektralen Emissionsbereich des Fluorophors. Erfassen Sie die hohe Qualität konfokale Bilder von Tuning Laserintensität und andere Parameter.
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Representative Results
Figur 1 zeigt ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystems. Abbildung 2 zeigt die Expression von pEGFP-N1 in HEK293 - Zellen. Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und Zellkern nachgewiesen werden. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GnRH von S. japonica in HEK293 - Zellen, im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 15. Das Fusionsprotein mit dem EGFP - Tag am C-Terminus von Sj GnRH (Sj GnRH-EGFP) erschien grün in diesem Experiment , wenn sie unter CLSM. Der Kern mit DAPI gefärbt wurde in blau aufgedeckt. DiI-Färbung markiert die Zellmembran in rot. Das Gelb - Signal auf der Zelloberfläche in dem fusionierten Bild zeigte die Koinzidenz von rot und grün, die Plasmamembran Lokalisierung von Sj GnRHR demonstriert.
Die 4 und 5 Anzeigedie Ergebnisse der Sj GnRH Internalisierung Assays in HEK293 - Zellen. Zur Visualisierung wurden die Internalisierung von Sj GnRHR, Zellen mit Gonadotropin-Releasing - Hormon (Sj GnRH) 15 bei verschiedenen Konzentrationen für 30 min (4) behandelt, oder sie wurden mit einer einzigen Konzentration behandelt (10-6 M) für verschiedene Zeitdauern ( Abbildung 5). In Abwesenheit von Sj GnRH, die Steuerung (CTL) Rezeptor - Fusions hatte Plasmamembranlokalisierung. Wie in 4 gezeigt , bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen verlief die Internalisierung des Sj GnRHR in einer dosisabhängigen Art und Weise, und der Rezeptor wurde vollständig von der Zelloberfläche mit den internalisierten 10-6 M - Liganden. Wie in 5 gezeigt, die Ergebnisse der Zeitverlaufsanalyse der Rezeptor - Internalisierung mit 10 - gezeigt , dass 6 M Ligand internalisiertSj GnRHR nachweisbar war 10 min nach Stimulation Agonisten und extreme Internalisierung aufgetreten von 60 min. Beobachtung mit konfokaler Mikroskopie von diesen beiden Figuren ergab , dass das Fluoreszenz Sj GnRHR-EGFP - Fusionsprotein wurde in der Plasmamembran lokalisiert und in erster Linie war drastisch und schnell in die Zelle als Reaktion auf den Sj GnRH - Peptid in HEK293 Zellen internalisiert.
Abbildung 1. Ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystem. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die konfokale Mikroskopie von GFP - Protein in der Kontrolle pEGFP-N1-HEK293 - Zellen . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Lokalisierung von Sj GnRH-EGFP - Fusionsprotein in HEK293 - Zellen durch konfokale Mikroskopie. Der Kern mit DAPI gefärbt ist blau dargestellt. Dil Färbung in rot dargestellt, unterstreicht die Zellmembran. Sj GnRH-EGFP - Fusionsprotein wird in grün dargestellt. In dem fusionierten Bild, Gelb zeigt die Koinzidenz der roten und grünen Signale. Alle Bilder repräsentieren mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. Die Internalisierung von Sj GnRH-EGFP - Fusionsprotein in HEK293 Zellen in einem Zeitverlauf durch konfokale Mikroskopie. HEK293 - Zellen transfiziert mit Sj GnRHR-EGFP - Plasmid wurden für 30 Minuten durch Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von GnRH aktiviert. Der Steuerfall war ohne GnRH-Stimulation (CTL). Alle Bilder repräsentieren mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Internalisierung von Sj GnRH-EGFP - Fusionsprotein in HEK293 - Zellen in einer dosisabhängigen Weise durch konfokale Mikroskopie. Für verschiedene d 6 M Ligand - HEK293 - Zellen transfiziert mit Sj GnRHR-EGFP - Plasmid wurden mit 10 aktiviert durch Behandlungfigurationen. Der Steuerfall war ohne GnRH-Stimulation (CTL). Alle Bilder repräsentieren mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen 16.
Die erfolgreiche Anwendung dieser leistungsstarken Assay beruht auf einige Schlüsselfaktoren. Foremost ist die gute Gesundheit der Zellen, die für eine effiziente Transfektion und die Datenqualität wesentlich ist. Die Transfektionseffizienz Inkubationszeit, das Intervall zwischen Transfektion und anderen Experimenten und den Durchgang von transfizierten Zellen rutscht vor der Bildgebung zu bedecken, sind alle Schritte, bei denen eine Beschädigung der kultivierten Zellen möglich ist. Daher ist für alle Schritte eine wichtige Voraussetzung in diesem Experiment die gute Gesundheit der Zellen beibehalten. Darüber hinaus ist die Vermeidung dicht gedrängte Zellen in dichten Kulturen von entscheidenden Bedeutung, um qualitativ hochwertige Bilder mit dem konfokalen Mikroskopie zu erwerben. Um den Einfluss der Fluoreszenzmarkierung auf der Lokalisierung der GPCRs zu minimieren, haben wir einen Rezeptor mit EGFP an den intrazellulären C-Terminus fusionierte. Die erfolgreiche und effiziente Transfektion des Gens in die Zellen ist ebenfalls wichtig. Die Transfektionseffizienz in verschiedenen Zelllinien stark variieren kann. Daher kann die Optimierung bestimmter Schritte in dem Protokoll erforderlich sein, abhängig von dem speziellen verwendeten Zelltyp. Zum Beispiel wird in Transfektionsverfahren 1 könnte die Inkubationsdauer von transfizierten Zellen in DMEM ohne FBS entsprechend den Zellzustand optimiert werden. Zusätzlich zu der Dosierung des DNA-Plasmid, die Dosierung des Liposomreagenz und reduzierte Serummedien sollen nach bestimmten Zelllinien eingestellt werden. Andernfalls könnte der Elektrotransfektion Technik anstelle von Liposomreagenz vermittelte Transfektion f durchgeführt werden,oder akzeptable Transfektionseffizienz in einer bestimmten Zelllinie. Allerdings ist zusätzliche Hardware erforderlich, und Zellen in Suspension und in einem kleinen Volumen sind schwer von Elektrotransfektion zu transfizieren. Die wahre Stärke des Stroms Assay liegt jedoch in dem Vergleich zwischen den Veränderungen in den gleichen Zellen unter gleichen Kulturbedingungen nach akuter Manipulation, wie beispielsweise die Internalisierung von Sj GnRHR in Reaktion auf die Sj GnRH - Liganden.
Internalisierung ist eines der vorherrschenden Mechanismen steuern GPCR Signalisieren der geeigneten zellulären Antworten , um sicherzustellen , 11 auf Reize. Wir können leicht Änderungen in Internalisierung durch Bildgebung mit der konfokalen Mikroskopie beobachten. Die Internalisierung von Sj GnRH in einer dosis- und zeitabhängig ist in Abbildung 4 deutlich offenbart.
Das Protokoll wir beschrieben haben leicht auf subzellulärer Tracing von anderen eukaryotischen pr angepasst werdenoteins, wie der Kern Estrogenrezeptor 17. Allerdings wird die Optimierung bestimmter Schritte in dem Protokoll notwendig sein, abhängig von den speziellen Zelltypen verwendet, die weitere Erforschung und Praxis erfordern. Dennoch, wenn man bedenkt, dass die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen auf der Identifizierung von Genen, Proteinmodifikationen einen großen Einfluss hat, und Signalweg, dieses Protokoll auf der Grundlage der Forschung veröffentlicht, kann zuverlässige Daten und Informationen zur Verfügung stellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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