Индукция мезенхимных-эпителиальных переходы в клетках саркомы
Summary
Мы представляем здесь способ культивирования клеток для индукции мезенхимальных-эпителиальные переходы (MET) в клетках саркомы на основе комбинированного эктопической экспрессии микроРНК-200 членов семьи и grainyhead-типа 2 (GRHL2). Этот метод подходит для лучшего понимания биологического воздействия фенотипической пластичности на агрессивности рака и лечении.
Abstract
Фенотипическая пластичность относится к явлению, в котором клетка транзиторна получить черты другого рода. Во время прогрессирования рака, фенотипическая пластичность дисков вторжения, распространение и метастазирование. В самом деле, в то время как большинство исследований фенотипической пластичности было в контексте эпителиальных полученных карцином, оказывается, саркомы, которые являются мезенхимальными по происхождению, также демонстрируют фенотипическую пластичность, с подмножеством сарком переживают феномен, который напоминает mesenchymal- эпителиальный переход (МЕТЫ). Здесь, мы разработали способ, включающий семейство микроРНК-200 и grainyhead-типа 2 (GRHL2), чтобы имитировать этот MET-подобный феномен, наблюдаемый в саркому пациента samples.We последовательно выразить GRHL2 и семейство микроРНК-200 клеток с помощью трансдукции и трансфекции, соответственно, , чтобы лучше понять молекулярные основы этих фенотипических переходов в клетках саркомы. Саркома клетки, экспрессирующие MIR-200s и GRHL2 продемонстрировал повышенную эпителиальной characteristИКС в морфологии клеток и изменения эпителиальных и мезенхимальных биомаркеров. Дальнейшие исследования с использованием этих методов могут быть использовано, чтобы лучше понять последствия фенотипических из МЕТ-подобных процессов на клетки саркомы, такие как миграция, инвазия, метастатическая склонность и устойчивость к терапии.
Introduction
Фенотипическая пластичность относится к обратимому переходу между клеточными фенотипами, и обычно делится на два типа, эпителиально-к-мезенхимальный (ЕМТ) переходы и мезенхимальных-к-эпителиальные переходы (Met). Это фенотипическая пластичность играет важную роль в нормальных процессах многоклеточных организмов, такие как развитие и заживление ран 1; Однако, эти же пути и программа экспрессии генов также могут привести к болезни, такие как фиброз (обзор в 2, 3, 4) и карциноме метастазы (обзор в ссылках 5, 6, 7, 8). Во время метастазирования, например, ЕМТ нарушает полярность клеток, межклеточные взаимодействия, а также способствует инвазии 9, 10. Вместе EMT вкладs в фенотипическое состояние, что способствует распространению раковых клеток. Кроме того, ЕМТ также приводит к целому ряду других фенотипических изменений , которые ведут агрессивный фенотип, в то числе дерегуляции раковых клеток метаболизма 6, развития лекарственной устойчивости 11, 12, увеличенная способностью опухоли инициации 13, 14 и принимающей иммунное уклонение от 15.
Фенотипическая пластичность хорошо изучена в прогрессировании рака; Однако, саркомы также демонстрируют фенотипическую пластичность. Интересно, что кажется, как будто некоторые из тех же водителей фенотипической пластичности в карциномах также способствуют саркомам пластичности и агрессивности. Так , например, циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) у пациентов с саркомой , как были показаны , чтобы выразить EpCAM, белок клеточной поверхности , которые , как правило , найденные на эпителиальные клетках 16. Аддиционно, 250 мягких тканей саркома образцы были классифицированы как эпителиальные-типа или мезенхимальные-как на основе экспрессии генов. Пациенты в эпителиального типа биомаркеров подписи имели лучший прогноз , чем у пациентов с мезенхимальной типа биомаркеров подписи 17. Это согласуется со многими карцином, в которых пациенты с более эпителиальных карцином , как имеют лучшие результаты по сравнению с пациентами с более мезенхимальных подобных опухолей 18.
В то время как некоторые саркомы отображения биомаркеров и экспрессии генов пути в соответствии с MET, молекулярные подкрепления этой фенотипической пластичности остаются мало изучены. Изучить механизмы и движущие MET саркомы мы разработали модель MET индукции с использованием двух факторов эпителиальных конкретным, микроРНК (микроРНК) -200 семьи и grainyhead типа 2 (GRHL2). В MIR-200s представляют собой семейство небольших некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов путем связывания с 3'-UTRs в MESSENгер РНК и предотвращения перевода в белок. МикроРНК-200 семейство состоит из двух подгрупп – один, содержащий MIR-141 и MIR-200a, а другой в том числе MIR-200b, MIR-200c, и MIR-429. Члены семейства микроРНК-200 обогащены эпителиальных тканей, а потеря MIR-200s связан с метастазами в карцином 19. Семейство микроРНК-200 также подавляется в сарком мягких тканей по сравнению с нормальной тканью 20. Подобно MIR-200s, GRHL2 является ключевым регулятором , который имеет важное значение для развития эпителиальных 21. Фактор транскрипции GRHL2 действует в двух способах активируют эпителиальные гены, такие как E-кадгерин: 1) В эпителиальных клетках, GRHL2 непосредственно репрессирует главный регулятор ЕМТА, ZEB1 22; и 2) GRHL2 непосредственно активирует транскрипцию генов эпителиальных 23. Наши предыдущие исследования показали, что комбинированное выражение MIR-200s и GRHL2 в клетках саркомыиндуцирует МЕТ-подобный фенотип 24. Здесь мы представляем подробный протокол для создания модели ин витро MET индукции в клетках саркомы с помощью эктопической экспрессии микроРНК-200s и GRHL2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Саркомы являются редкими, но очень агрессивные раковые мезенхимной линии. Несмотря на их мезенхимальное происхождение, подмножество сарком, как представляется, пройти фенотипический переход к более эпителиальным подобным состояниям. Это МЕТ-подобный переключатель имеет прогностиче…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAS признает поддержку со стороны Института Дьюка рака, мочеполовой онкологической лаборатории Duke University и Университета Дьюка отдела ортопедии. HL была поддержана Национальным научным фондом (NSF) Центр теоретической биологической физики (НФС PHY-1427654) и NSF DMS-1361411, а также в качестве CPRIT (Профилактика рака и Научно-исследовательский институт Техас) Scholar в Cancer Research штата Техас в университете Райса. KEW была поддержана NIH F32 CA192630 MKJ и HL выгоду от полезных дискуссий с Мэри C Фарак-Carson, JN Onuchic Самир M Ханаш, Кеннет J Пиента и Дональд S Коффи.
Materials
| Countess automated counter | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplate | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blocking Buffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-based blocking buffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10X Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Running buffer |
| 10X Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transfer buffer |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA mimic negative control #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | serum-free media |
| anti-Ecadherin antibody | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-mouse AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μm filter for flow |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blue tetrazolium | Sigma | N5514 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | polybrene |
| 3 mL syringe | BD Bioscience | 309657 | |
| Sterile syringe filter | VWR | 28145-505 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tube | 352063 | flow cytometry tubes | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4368814 | reverse transcription kit |
| 4% paraformaldyhyde | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 |
References
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
- Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
- Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
- Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
- Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
- Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
- Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
- Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
- Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39 (2013).
- Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
- Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962 (2014).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241 (2014).
- Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395 (2015).
- Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
- Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
- Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
- Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
- Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
- Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
- Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
- Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
- Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
- Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
- Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998 (2014).
- Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
- Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
- Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904 (2016).
