Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma
Summary
Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell'impatto biologico della plasticità fenotipica sull'aggressività cancro e trattamenti.
Abstract
plasticità fenotipica si riferisce a un fenomeno in cui le cellule transitoriamente ottenere tratti di un altro lineage. Durante la progressione del carcinoma, plasticità fenotipica spinge l'invasione, la diffusione e le metastasi. Infatti, mentre la maggior parte degli studi di plasticità fenotipica sono stati nel contesto di carcinomi epiteliali derivate, si scopre sarcomi, che sono mesenchimali in origine, anche esibire plasticità fenotipica, con un sottoinsieme di sarcomi subire un fenomeno che assomiglia a un mesenchymal- transizione epiteliale (TEM). Qui, abbiamo sviluppato un metodo comprendendo la famiglia miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) per imitare questo fenomeno MET-come osservato nel sarcoma paziente samples.we sequenzialmente esprimono GRHL2 e la famiglia miR-200 utilizzando la trasduzione delle cellule e trasfezione, rispettivamente , per meglio comprendere le basi molecolari di queste transizioni fenotipiche in cellule di sarcoma. cellule di sarcoma che esprimono miR-200 e GRHL2 hanno dimostrato una maggiore caratteristica atmosfera epitelialeCI della morfologia cellulare e le modificazioni del epiteliali e mesenchimali biomarker. Studi futuri usando questi metodi possono essere utilizzati per comprendere meglio le conseguenze fenotipiche dei processi MET simili su cellule di sarcoma, quali la migrazione, invasione, propensione metastatica, e resistenza alla terapia.
Introduction
plasticità fenotipica si riferisce ad una transizione reversibile tra fenotipi cellulari, ed è generalmente suddiviso in due tipi, epiteliali-to-mesenchimale (EMT) transizioni e mesenchimali-to-epiteliale transizioni (TEM). Questa plasticità fenotipica gioca un ruolo importante nei normali processi di organismi multicellulari, come lo sviluppo e la guarigione della ferita 1; tuttavia, questi stessi percorsi e programmi di espressione genica può anche portare a malattie come la fibrosi (valutata in 2, 3, 4) e carcinoma metastasi (valutata in riferimento 5, 6, 7, 8). Durante la metastasi, per esempio, EMT sconvolge la polarità delle cellule, le interazioni cellula-cellula, e promuove l'invasione 9, 10. Insieme, EMT contribuires ad uno stato fenotipico che facilita la diffusione delle cellule tumorali. Inoltre, EMT comporta anche una serie di altre alterazioni fenotipiche che guidano un fenotipo aggressivo, tra deregolazione del metabolismo delle cellule del cancro 6, lo sviluppo di resistenza ai farmaci 11, 12, maggiore capacità tumore-apertura 13, 14 e ospitare evasione immune 15.
plasticità fenotipica è stato ben studiato nella progressione carcinoma; Tuttavia, sarcomi presentano inoltre plasticità fenotipica. È interessante notare che sembra come se alcuni degli stessi conducenti di plasticità fenotipica in carcinomi contribuiscono anche al sarcoma plasticità e l'aggressività. Ad esempio, è stato dimostrato cellule tumorali circolanti (CTC) di pazienti con sarcoma di esprimere EpCAM, una proteina di superficie cellulare che si trova in genere su cellule epiteliali 16. Addizionale, 250 campioni sarcomi dei tessuti molli sono stati classificati come epiteliali simile o mesenchimali come base di espressione genica. I pazienti nella firma biomarker epiteliale simile hanno avuto una prognosi migliore rispetto ai pazienti con la firma biomarcatore mesenchimali simil-17. Ciò è coerente con molti carcinomi, in cui i pazienti con più carcinomi epiteliali-come hanno risultati migliori rispetto ai pazienti con più tumori mesenchimali simil-18.
Mentre alcuni sarcomi visualizzano biomarker e percorsi di espressione genica coerenti con il TEM, le basi molecolari di questa plasticità fenotipica rimangono poco compresi. Per studiare i meccanismi e gli autisti di MET nel sarcoma abbiamo sviluppato un modello di induzione MET usando due fattori specifici epiteliali, il microRNA (miR) -200 famiglia e grainyhead-like 2 (GRHL2). I miR-200 sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione genica legandosi alla UTR di messen 3'ger RNA e prevenire traduzione in proteina. La famiglia miR-200 è costituito da due sottogruppi – uno contenente miR-141 e miR-200a, e l'altro tra cui miR-200b, 200c-miR, e miR-429. I membri della famiglia miR-200 sono arricchite nei tessuti epiteliali, e la perdita di miR-200 è associata con metastasi nei carcinomi 19. La famiglia miR-200 è anche downregulated in sarcomi dei tessuti molli rispetto al tessuto normale 20. Simile alle MIR-200s, GRHL2 è un regolatore chiave che è importante per lo sviluppo epiteliale 21. Il fattore di trascrizione GRHL2 agisce in due modi per upregulate geni epiteliali, come E-caderina: 1) Nelle cellule epiteliali, GRHL2 reprime direttamente il principale regolatore EMT, ZEB1 22; e 2) GRHL2 direttamente attiva la trascrizione dei geni epiteliali 23. Le nostre indagini precedenti hanno dimostrato che l'espressione combinata di miR-200 e GRHL2 in cellule di sarcomainduce un fenotipo MET simile 24. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per creare un modello in vitro del TEM induzione in cellule di sarcoma usando l'espressione ectopica di miR-200 e GRHL2.
Protocol
Representative Results
Discussion
I sarcomi sono rari, ma altamente aggressivi tumori di un lignaggio mesenchimale. Nonostante la loro lignaggio mesenchimali, un sottogruppo di sarcomi sembra subire una transizione fenotipica ad un epiteliale stato simile più. Questo interruttore TEM-like ha rilevanza prognostica, come pazienti con più tumori epiteliali-simili sono meno aggressivi 24. Nonostante la loro rilevanza clinica, ci sono pochi studi che riguardano i meccanismi molecolari mappa queste transizioni fenotipiche in sarcomi….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAS riconosce il sostegno del duca Cancer Institute, The Duke University genito-urinario Laboratorio di Oncologia, e il Dipartimento di Ortopedia dell'Università Duke. HL è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Centro di Fisica Teorica biologica (NSF PHY-1.427.654) e NSF DMS-1.361.411, e come un CPRIT (prevenzione del cancro e Research Institute del Texas) Scholar Ricerca sul Cancro dello Stato del Texas alla Rice University. KEW stato supportato dal NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiato utili discussioni con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.
Materials
| Countess automated counter | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplate | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blocking Buffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-based blocking buffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10X Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Running buffer |
| 10X Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transfer buffer |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA mimic negative control #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | serum-free media |
| anti-Ecadherin antibody | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-mouse AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μm filter for flow |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blue tetrazolium | Sigma | N5514 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | polybrene |
| 3 mL syringe | BD Bioscience | 309657 | |
| Sterile syringe filter | VWR | 28145-505 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tube | 352063 | flow cytometry tubes | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4368814 | reverse transcription kit |
| 4% paraformaldyhyde | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 |
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