La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma
Summary
Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.
Abstract
plasticidad fenotípica se refiere a un fenómeno en el que las células transitoriamente adquieren rasgos de otro linaje. Durante la progresión de carcinoma, la plasticidad fenotípica impulsa la invasión, la difusión y la metástasis. De hecho, mientras que la mayoría de los estudios de plasticidad fenotípica han sido en el contexto de los carcinomas epiteliales derivadas, resulta que los sarcomas, que son de origen mesenquimal, también exhiben plasticidad fenotípica, con un subconjunto de los sarcomas de someterse a un fenómeno que se asemeja a un mesenchymal- transición epitelial (MET). Aquí, hemos desarrollado un método que comprende la familia miR-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2) para imitar este fenómeno MET-como observados en paciente sarcoma samples.We expresan secuencialmente GRHL2 y la familia miR-200 usando la transducción de células y transfección, respectivamente , para entender mejor las bases moleculares de estas transiciones fenotípicas en células de sarcoma. células de sarcoma que expresan de miR-200 y GRHL2 demostraron mejorada, ambie epitelialics en la morfología celular y la alteración de epiteliales y mesenquimales biomarcadores. Futuros estudios utilizando estos métodos se pueden utilizar para comprender mejor las consecuencias fenotípicas de procesos MET-como en células de sarcoma, como la migración, invasión, la propensión metastásica, y resistencia a la terapia.
Introduction
plasticidad fenotípica se refiere a una transición reversible entre fenotipos celulares, y es comúnmente dividido en dos tipos, epitelial-a-mesenquimal (EMT) transiciones y transiciones-mesenquimal-a epitelial (MET). Esta plasticidad fenotípica juega un papel importante en los procesos normales de los organismos multicelulares, como el desarrollo y la cicatrización de la herida 1; sin embargo, estas mismas vías y programas de expresión génica también pueden conducir a la enfermedad, tales como fibrosis (revisado en 2, 3, 4) y metástasis de carcinoma (revisado en las referencias 5, 6, 7, 8). Durante la metástasis, por ejemplo, EMT interrumpe la polaridad celular, interacciones célula-célula, y promueve la invasión 9, 10. En conjunto, contribuyen EMTs de un estado fenotípico que facilitan la divulgación de las células cancerosas. Además, EMT también conduce a una serie de otras alteraciones fenotípicas que impulsan un fenotipo agresivo, incluyendo la desregulación del metabolismo de la célula de cáncer 6, el desarrollo de resistencia a los medicamentos 11, 12, mayor capacidad tumor-iniciación 13, 14 y el anfitrión de la evasión inmune 15.
plasticidad fenotípica se ha estudiado bien en la progresión del carcinoma; sin embargo, sarcomas también exhiben plasticidad fenotípica. Curiosamente, parece como si algunos de los mismos controladores de plasticidad fenotípica en los carcinomas también contribuyen a la plasticidad del sarcoma y agresividad. Por ejemplo, se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) de pacientes con sarcoma de expresar EpCAM, una proteína de superficie celular que se encuentra típicamente en las células epiteliales 16. Addicionalmente, 250 muestras de sarcoma de tejido blando se clasificaron como de tipo epitelial o mesenquimal-como basado en la expresión génica. Los pacientes de la firma biomarcador epitelial tuvieron un mejor pronóstico que los pacientes con la firma biomarcador mesenquimal 17. Esto es coherente con muchos carcinomas, en los que los pacientes con más carcinomas epiteliales-como tienen mejores resultados en comparación con los pacientes con más tumores mesenquimales-como 18.
Mientras que algunos sarcomas muestran biomarcadores y vías de expresión génica consistentes con MET, las bases moleculares de esta plasticidad fenotípica siguen siendo poco conocidos. Para estudiar los mecanismos y los conductores de MET en el sarcoma hemos desarrollado un modelo de inducción MET utilizando dos factores-epiteliales específica, el microRNA (MIR) -200 familia y Grainyhead-como 2 (GRHL2). El MIR-200 son una familia de pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica mediante la unión a los 3' UTRs de messenger ARN y la prevención de traducción en proteína. La familia miR-200 se compone de dos subgrupos – uno que contiene miR-141 y miR-200a, y el otro incluyendo miR-200b, miR-200c, y miR-429. Los miembros de la familia miR-200 se enriquecen en tejidos epiteliales, y la pérdida de miR-200 se asocia con metástasis en carcinomas 19. La familia miR-200 también es downregulated en sarcomas de tejidos blandos en comparación con el tejido normal 20. Al igual que en los miR-200, GRHL2 es un regulador clave que es importante para el desarrollo del epitelio 21. El factor de transcripción GRHL2 actúa de dos formas de regular por incremento genes epiteliales, tales como E-cadherina: 1) en las células epiteliales, GRHL2 directamente reprime el regulador maestro EMT, ZEB1 22; y 2) GRHL2 activa directamente la transcripción de genes epiteliales 23. Nuestras investigaciones anteriores han demostrado que la expresión combinada de miR-200 y GRHL2 en las células del sarcomainduce un fenotipo MET-como 24. A continuación, presentamos un protocolo detallado para crear un modelo in vitro de la inducción de MET en células de sarcoma usando la expresión ectópica de miR-200 y GRHL2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los sarcomas son cánceres raros, pero altamente agresivas de un linaje mesenquimal. A pesar de su linaje mesenquimal, un subconjunto de sarcomas parece experimentar una transición fenotípica a un estado más epitelial-similares. Este interruptor MET-como tiene relevancia pronóstica, ya que los pacientes con más tumores epiteliales como son menos agresivos 24. A pesar de su importancia clínica, hay pocos estudios sobre los mecanismos moleculares de conducción estas transiciones fenotípicas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAS reconoce el apoyo del Instituto del Cáncer de Duke, El Laboratorio de Oncología genitourinario Universidad de Duke, y el Departamento de Ortopedia de la Universidad de Duke. HL fue apoyada por la National Science Foundation (NSF) Centro de Física Biológica Teórica (NSF PHY-1427654) y NSF DMS-1361411, y como CPRIT Académico (Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas) en la Investigación del Cáncer del Estado de Texas en la Universidad Rice. KEW fue apoyado por el NIH F32 CA192630 MKJ y HL benefició de discusiones útiles con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, y Donald S. Coffey.
Materials
| Countess automated counter | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplate | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blocking Buffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-based blocking buffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10X Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Running buffer |
| 10X Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transfer buffer |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA mimic negative control #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | serum-free media |
| anti-Ecadherin antibody | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-mouse AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μm filter for flow |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blue tetrazolium | Sigma | N5514 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | polybrene |
| 3 mL syringe | BD Bioscience | 309657 | |
| Sterile syringe filter | VWR | 28145-505 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tube | 352063 | flow cytometry tubes | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4368814 | reverse transcription kit |
| 4% paraformaldyhyde | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 |
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