Summary

L'induction de mésenchymateuses-épithélial Transitions dans les cellules Sarcome

Published: April 07, 2017
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Summary

Nous présentons ici une méthode de culture cellulaire pour induire des transitions mésenchymateuses-épithéliale (MET) dans les cellules de sarcome basées sur l'expression ectopique combinée de microARN-200 membres de la famille et comme grainyhead 2 (GRHL2). Cette méthode est adaptée pour mieux comprendre l'impact biologique de la plasticité phénotypique sur l'agressivité du cancer et des traitements.

Abstract

La plasticité phénotypique se réfère à un phénomène dans lequel les cellules acquièrent transitoirement les traits d'une autre lignée. Au cours de la progression du cancer, la plasticité phénotypique conduit l'invasion, la diffusion et les métastases. En effet, alors que la plupart des études de la plasticité phénotypique ont été dans le contexte des cancers épithéliaux, il se trouve sarcomes, qui sont mésenchymateuses d'origine, présentent également la plasticité phénotypique, avec un sous-ensemble de sarcomes subissant un phénomène qui ressemble à un mesenchymal- transition épithéliale (MET). Ici, nous avons développé un procédé comprenant le miR-200 et la famille grainyhead-like 2 (GRHL2) pour simuler ce phénomène MET-comme observé chez les patients du sarcome samples.We expriment séquentiellement GRHL2 et la famille miR-200 en utilisant la transduction et de transfection cellulaire, respectivement , pour mieux comprendre les fondements moléculaires de ces transitions phénotypiques dans les cellules de sarcome. les cellules exprimant Sarcome miR-200s et GRHL2 ont démontré une meilleure épithéliale caractéristique etics dans la morphologie des cellules et l'altération des marqueurs biologiques épithéliales et mésenchymateuses. Les études futures utilisant ces méthodes peuvent être utilisées pour mieux comprendre les conséquences phénotypiques des processus MET-comme sur les cellules de sarcomes, tels que la migration, l'invasion, la propension métastatique, et une résistance au traitement.

Introduction

plasticité phénotypique se réfère à une transition réversible entre les phénotypes cellulaires, et est généralement divisé en deux types, les transitions épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et les transitions mésenchymateuses-à-épithéliale (MET). Cette plasticité phénotypique joue un rôle important dans les processus normaux d'organismes multicellulaires, tels que le développement et la cicatrisation des plaies 1; cependant, ces mêmes voies et les programmes d'expression génique peuvent également conduire à des maladies, telles que la fibrose (revue dans 2, 3, 4) et les métastases de carcinome (revue dans les références 5, 6, 7, 8). Au cours de métastases, par exemple, EMT perturbe la polarité cellulaire, les interactions entre cellules et favorise l' invasion 9, 10. Ensemble, EMT contribuents à un état phénotypiques qui facilite la diffusion des cellules cancéreuses. En outre, EMT conduit également à une foule d'autres modifications phénotypiques qui entraînent un phénotype agressif, y compris la dérégulation du métabolisme des cellules cancéreuses 6, le développement de la résistance aux médicaments 11, 12, une augmentation de la capacité d'initiation de la tumeur 13, 14 et l' hôte évasion immunitaire 15.

La plasticité phénotypique a été bien étudiée dans la progression du cancer; cependant, les sarcomes présentent également la plasticité phénotypique. Fait intéressant, il semble que certains des mêmes facteurs de plasticité phénotypique dans les cancers contribuent également à la plasticité du sarcome et l'agressivité. Par exemple, les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients atteints de sarcome ont été montrés pour exprimer EpCAM, une protéine de surface cellulaire qui se trouve généralement sur les cellules epitheliales 16. Addinellement, 250 échantillons de sarcomes des tissus mous ont été classés comme epithelial ou mésenchymateuses comme basé sur l'expression des gènes. Les patients dans la signature des marqueurs biologiques epithelial avaient un meilleur pronostic que les patients avec la signature de marqueurs biologiques mésenchymateuses comme 17. Ceci est en accord avec de nombreux cancers, où les patients ayant plus carcinomes epithelial ont de meilleurs résultats par rapport aux patients avec plus de tumeurs mésenchymateuses comme 18.

Alors que certains sarcomes affichent des biomarqueurs et des voies d'expression des gènes compatibles avec MET, restent mal compris les fondements moléculaires de cette plasticité phénotypique. Pour étudier les mécanismes et les conducteurs de MET sarcomes, nous avons développé un modèle d'induction MET en utilisant deux facteurs spécifiques à l'épithélium, la microARN (miR) -200 famille et comme grainyhead 2 (GRHL2). Les miR-200 sont une famille de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes en se liant à la 3' UTR de MessenGer ARN et en empêchant la traduction en protéine. La famille miR-200 se compose de deux sous-groupes – contenant une miR-141 et miR-200a, et l'autre comprenant miR-200b, miR-200c, et miR-429. Les membres de la famille miR-200 sont enrichis dans les tissus épithéliaux, et la perte de miR-200s est associée à des métastases dans les cancers 19. La famille miR-200 est également downregulated dans les sarcomes des tissus mous par rapport aux tissus normaux 20. Tout comme les miR-200s, GRHL2 est un régulateur clé qui est important pour le développement de l' épithélium 21. Le facteur de transcription GRHL2 agit de deux manières de réguler à la hausse des gènes épithéliaux, tels que la E-cadhérine: 1) Dans les cellules epitheliales, GRHL2 refoule directement le régulateur maître EMT, ZEB1 22; et 2) GRHL2 active directement la transcription de gènes 23 epitheliales. Nos enquêtes précédentes ont montré que l'expression combinée de miR-200s et GRHL2 dans les cellules de sarcomeinduit un phénotype de type 24 MET. Nous présentons ici un protocole détaillé pour créer un modèle in vitro d'induction MET dans les cellules de sarcome en utilisant l' expression ectopique de miR-200s et GRHL2.

Protocol

1. Préparation des réactifs Préparer DMEM pour la culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine (5000 U / ml) à 500 ml de DMEM. Ce milieu peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à six mois. Remettre en suspension les amorces lyophilisées dans de l'eau sans nuclease à une concentration finale de 10 uM. amorces remises en suspension à -20 ° C. Préparer test de radio-immunoprécipitation (RIPA) du tampon (150 mM …

Representative Results

Schéma pour l'induction MET dans les cellules de sarcome Un calendrier général pour l'induction de changements MET-comme dans les cellules de sarcome est représenté sur la Figure 1. Le protocole commence par transduction GRHL2 (figure 1A), suivie par la transfection de la famille miR-200 (figure 1B). GRHL2 ou membres de la famille miR-200 ne sont pas en mesure d'…

Discussion

Les sarcomes sont des cancers rares, mais très agressifs d'une lignée mésenchymateuses. En dépit de leur lignée mésenchymateuses, un sous-ensemble de sarcomes semble subir une transition phénotypiques à un état plus de type épithélial. Ce commutateur MET semblable a un intérêt pronostique, comme les patients ayant plus de tumeurs épithéliales ressemblant sont moins agressifs 24. En dépit de leur pertinence clinique, il existe peu d'études portant sur les mécanismes molé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAS reconnaît le soutien du Duke Cancer Institute, l'Université d'oncologie génito Laboratoire Duke, et le duc département de chirurgie orthopédique de l'Université. HL a été soutenu par la National Science Foundation (NSF) Centre de Biophysique théorique (NSF PHY-1427654) et NSF DMS-1361411, et comme CPRIT (Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas) Scholar en recherche sur le cancer de l'État du Texas à l'Université Rice. KEW a été soutenu par le NIH F32 CA192630 MKJ et HL a bénéficié de discussions utiles avec Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta et Donald S. Coffey.

Materials

Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
Odyssey Fc LI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
PCR microplate Corning 321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
10X Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
10X Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
DPBS Life technologies 14190-144
0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
DMEM Life technologies 11995-065
Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
anti-ZO1 Invitrogen 402200
IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
3 mL syringe BD Bioscience 309657
Sterile syringe filter VWR 28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
Triton-X100 Sigma 93443
bovine serum albumin Sigma A7906

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Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

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