Summary

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

Published: April 07, 2017
doi:

Summary

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

Abstract

גמישות פנוטיפית מתייחסת לתופעה שבה תא להשיג זמני תכונות של שושלת אחרת. במהלך התקדמות קרצינומה, גמישות פנוטיפית שמניע הפלישה, הפצת גרורות. ואכן, בעוד רוב המחקרים של גמישות פנוטיפית כבר בהקשר של קרצינומות נגזרות האפיתל, מתברר סרקומות, אשר המזנכימה במקורו, גם להפגין גמישות פנוטיפית, עם תת-קבוצה של סרקומות עוברת תופעה דומה mesenchymal- מעבר אפיתל (MET). הנה, פיתחנו שיטה המרכיבות את המשפחה miR-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2) לחקות תופעה זו נתקלה דמוי שנצפתה החולה סרקומה samples.We ברצף להביע GRHL2 ומשפחת miR-200 באמצעות התמרה התא transfection, בהתאמה , כדי להבין את הבסיס המולקולרי טוב יותר של מעברים פנוטיפי אלה בתאי סרקומה. תאי סרקומה להביע miR-200s ו GRHL2 הפגינו characterist האפיתל משופרICS במורפולוגיה התא ושינוי של סמנים ביולוגיים אפיתל mesenchymal. מחקרים עתידיים באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להבין את ההשלכות פנוטיפי טוב יותר של תהליכים MET-כמו על תאי סרקומה, כגון הגירה, פלישה, נטייה גרורתי, והתנגדות טיפול.

Introduction

גמישות פנוטיפית מתייחסת מעבר הפיך בין פנוטיפים הסלולר, והוא מחולק בדרך כלל לשני סוגים, האפיתל אל המזנכימה (EMT) מעברים מעברי המזנכימה אל האפיתל (MET). גמישות פנוטיפית זה ממלא תפקיד חשוב בתהליכים נורמליים של יצורים רב-תאיים, כגון פיתוח ריפוי פצעים 1; עם זאת, מסלולים אותם ותוכניות ביטוי גנים יכולים גם לגרום למחלות, כגון סיסטיק (הנסקרת ב 2, 3, 4) וגרורות קרצינומה (הנסקרת ב אזכור 5, 6, 7, 8). במהלך גרורות, למשל, EMT משבש קוטביות בתא, תאי תאי אינטראקציות, ומקדמת פלישה 9, 10. יחד, EMT לתרוםהים למדינה פנוטיפי המאפשר הפצת תאים סרטניים. בנוסף, EMT גם מוביל שורה של שינויים פנוטיפי אחרים שמניעים פנוטיפ אגרסיבי, כולל הסרת הפיקוח של מטבוליזם תאי סרטן 6, התפתחות עמידות לתרופות 11, 12, יכולת גידול-ייזום מוגברת 13, 14 ו לארח התחמקות החיסון 15.

גמישות פנוטיפית נחקרה היטב להתקדמות קרצינומה; עם זאת, סרקומות גם להפגין גמישות פנוטיפית. מעניין, נראה כאילו חלק מאותם נהגים של גמישות פנוטיפית בקרצינומות גם לתרום פלסטיות סרקומה ואגרסיביות. למשל, בתאי הגידול במחזור (CTCs) מחולים סרקומה הוכחו להביע EpCAM, חלבון על פני התא שנמצא בדרך כלל ב- תאי האפיתל 16. Additionally, 250 דגימות סרקומה של רקמות רכות סווגו בתור אפיתל דמוי או המזנכימה דמוי מבוסס על ביטוי גנים. מטופלי החתימה ביומרקרים דמוי אפיתל היה פרוגנוזה טוב יותר מאשר חולה עם החתימה ביומרקרים דמוי המזנכימה 17. זה עולה בקנה אחד עם קרצינומה רב, בם חולה עם יותר קרצינומות דמויות אפיתל יש תוצאות טובות יותר בהשוואה לחולים עם גידולים המזנכימה דמוית יותר 18.

בעוד שחלק סרקומות להציג סמנים ביולוגיים ומסלולי ביטוי גנים עקביים עם MET, את הבסיס המולקולרי של גמישות פנוטיפית זה להישאר ממעטים להבין. כדי לחקור את המנגנונים ואת הנהגים של נפגשו סרקומה פיתחנו מודל של אינדוקציה MET באמצעות שני גורמים ספציפיים אפיתל, microRNA (Mir) -200 בני משפחה grainyhead דמוי 2 (GRHL2). מיר-200s הם משפחה של RNA ללא קידוד קטן המווסתים ביטוי גנים באמצעות קשירה 3' UTRs של messenger RNA ותרגום מניעה לתוך חלבון. משפחת miR-200 מורכבת משתי קבוצות משנה – אחד המכיל miR-141 לבין מיר-200a, והשני כולל miR-200B, miR-200C, ומיר-429. בני משפחת miR-200 מועשרים ברקמות האפיתל, ואת אובדן miR-200s קשורה גרורות קרצינומה 19. משפחת miR-200 הוא downregulated גם סרקומות של רקמות רכות לעומת הרקמות הבריאות 20. בדומה מיר-200s, GRHL2 הוא הרגולטור, כי הוא מפתח חשוב לפיתוח האפיתל 21. גורם שכפול GRHL2 פועל בשתי דרכים כדי upregulate גני האפיתל, כגון E-cadherin: 1) בתאי האפיתל, GRHL2 ישירות מדחיק את רגולטור EMT, ZEB1 22; ו 2) GRHL2 מפעיל תעתיק ישירות של גנים האפיתל 23. החקירות הקודמות שלנו הראו כי ביטוי משולב של miR-200s ו GRHL2 בתאי סרקומהגורם פנוטיפ MET-כמו 24. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל במבחנה של אינדוקציה נפגשו תאי סרקומה באמצעות ביטוי אקטופי של miR-200s ו GRHL2.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים הכן DMEM עבור תרבית תאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר (FBS) ו 5 מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין (5000 U / mL) 500 מ"ל של DMEM. המדיום הזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. <li style=";text-alig…

Representative Results

סכימה לזירוז נפגש תאי סרקומה ציר זמן בכלל עבור האינדוקציה של שינויי MET דמויי תאי סרקומה מוצג באיור 1. פרוטוקול מתחיל transducing GRHL2 (איור 1A), ואחריו transfection של משפחת miR-200 (איור 1B).</st…

Discussion

סרקומות הן נדירות, אבל מאוד סוגי סרטן אגרסיביים של השושלת המזנכימה. למרות השושלת המזנכימה שלהם, קבוצת משנה של סרקומות מופיע לעבור במעבר פנוטיפי למצב אפיתל דמוי יותר. יש מתג MET-ככה רלוונטי פרוגנוסטיים, כמו חולים עם גידולים אפיתל דמוית יותר הם פחות אגרסיביים 24…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAS מודה תמיכה ממכון הסרטן Duke, המעבדה לאונקולוגיה המין והשתן אוניברסיטת דיוק, ואת מחלקת אורתופדיה אוניברסיטת דיוק. HL נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) המרכז לפיסיקה ביולוגית תיאורטית (NSF PHY-1,427,654) ו- NSF DMS-1,361,411, וכתוצאה CPRIT (מניעת סרטן ולמחקר במכון טקסס) Scholar ב Cancer Research של מדינת טקסס בבית רייס האוניברסיטה. KEW נתמכה על ידי MKJ NIH F32 CA192630 ו HL נהנו מן הדיונים שימושי עם מרי ג Farach-קרסון, JN Onuchic, סמיר M. Hanash, קנת ג'יי Pienta, ו דונלד ס קופי.

Materials

Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
Odyssey Fc LI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
PCR microplate Corning 321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
10X Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
10X Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
DPBS Life technologies 14190-144
0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
DMEM Life technologies 11995-065
Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
anti-ZO1 Invitrogen 402200
IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
3 mL syringe BD Bioscience 309657
Sterile syringe filter VWR 28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
Triton-X100 Sigma 93443
bovine serum albumin Sigma A7906

References

  1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
  2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
  3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
  4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
  5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
  6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
  7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
  8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
  9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
  10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
  11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39 (2013).
  12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
  13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962 (2014).
  14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241 (2014).
  16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395 (2015).
  17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
  18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
  20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
  21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
  22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
  23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
  24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
  25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
  26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
  27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
  28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998 (2014).
  29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
  30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
  31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

View Video