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Developmental Biology

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

doi: 10.3791/55520 Published: April 7, 2017

ERRATUM NOTICE

Summary

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2(GRHL2)の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行(MET)を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。

Abstract

表現型の可塑性は、細胞が一過別系統の形質を獲得する現象をいいます。癌の進行中に、表現型可塑性が侵略、普及および転移を駆動します。表現型の可塑性の研究のほとんどは、上皮由来の癌の文脈でされているが実際に、それはmesenchymal-に似た現象を受け肉腫のサブセットで、また、表現型の可塑性を示し、起源に間葉ある肉腫を、判明します上皮移行(MET)。ここで、我々は、それぞれ、順次GRHL2およびmiR-200ファミリーは、細胞形質導入およびトランスフェクションを使用して発現肉腫患者samples.Weで観察されたこのMET状現象を模倣するためのmiR-200ファミリーとgrainyhead様2(GRHL2)を含む方法を開発しました、より良い肉腫細胞におけるこれらの表現型の遷移の分子基盤を理解します。 miR-200SとGRHL2を表現肉腫細胞が強化された上皮characteristを実証しました細胞形態および上皮および間葉バイオマーカーの変化にICS。これらのメソッドを使用して今後の研究では、より良い、このような移動、浸潤、転移性の傾向、および治療抵抗として肉腫細胞にMETのようなプロセスの表現型の結果を理解するために使用することができます。

Introduction

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表現型の可塑性は、細胞の表現型との間の可逆的な遷移を指し、一般に二つのタイプ、上皮 - 間葉(EMT)遷移と間葉ツー上皮移行(MET)に分割されています。この表現型の可塑性は、このような開発や創傷治癒1と多細胞生物の正常なプロセスにおいて重要な役割を果たしています。しかしながら、これらの同じ経路および遺伝子発現プログラムはまた、線維症のような疾患につながることができ、(2に概説、3、4)、癌転移(参考文献5、6、7、8に概説)。転移の間に、例えば、EMTは、細胞極性、細胞-細胞相互作用を破壊、および浸潤9,10促進します。一緒に、EMTが貢献します癌細胞の普及を促進する表現型状態秒。また、EMTはまた、癌細胞の代謝6の規制緩和、薬物抵抗11、12の開発を含む積極的な表現型を駆動する他の表現型の変化、増加腫瘍開始能13,14及び免疫回避15をホストのホストにつながります。

表現型可塑性はよく癌の進行に研究されてきました。しかし、肉腫はまた、表現型の可塑性を示します。癌における表現型の可塑性の同じドライバーのいくつかはまた、肉腫の可塑性と積極性に貢献しているかのよう興味深いことに、それが表示されます。例えば、肉腫患者からの循環腫瘍細胞(CTCのは)のEpCAM、典型的には上皮細胞16に見出される細胞表面タンパク質を発現することが示されています。 ADDItionally、250個の軟部組織肉腫サンプルは遺伝子発現に基づいて、上皮様または間葉様に分類しました。上皮様バイオマーカーの署名の患者は間葉様バイオマーカーの署名17の患者よりも良い予後を持っていました。これは、より多くの上皮様癌の患者は、より間葉様腫瘍18の患者と比較して、より良い結果を持っている多くの癌腫、と一致しています。

いくつかの肉腫は、バイオマーカーおよびMETと一致した遺伝子発現の経路を表示しますが、この表現型可塑性の分子基盤はよくわかっていないまま。肉腫にMETのメカニズムおよびドライバを研究するために、我々は2上皮固有の要因を使用してMET誘導のモデルを開発し、マイクロRNA(MIR)-200家族とgrainyheadのような2(GRHL2)。 MIR-200S messenの3' のUTRに結合することによって遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAのファミリーでありますGERのRNAとタンパク質への翻訳を阻止します。 miR-141およびmiR-200Aを含むもの、およびmiR-200B、MIR-200C、およびmiR-429を含む他の - のmiR-200ファミリーは、2つのサブグループから成ります。 miR-200ファミリーのメンバーは、上皮組織に富んでいる、とのmiR-200Sの損失は癌19に転移と関連しています。 miR-200ファミリーはまた、正常組織20と比較して、軟組織肉腫にダウンレギュレートされます。 miR-200Sと同様に、GRHL2は、上皮の開発21のために重要である重要な調節因子です。例えばE-カドヘリンなどの上皮の遺伝子をアップレギュレートする2つの方法でGRHL2転写因子が作用する:1)上皮細胞において、GRHL2直接EMTマスタレギュレータ、ZEB1 22を抑制する。 2)GRHL2直接上皮遺伝子23の転写を活性化します。私たちの以前の研究は、肉腫細胞におけるmiR-200SとGRHL2の組み合わせ表現を示していますMET様表現型24を誘導します。ここで、我々は、miR-200SとGRHL2の異所性発現を使用して肉腫細胞におけるMET誘導のin vitroモデルを作成するための詳細なプロトコルを提示します。

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Protocol

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試薬の調製

  1. ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン - ストレプトマイシン(5,000 U / mL)をDMEMの500mLのに5mlを50ミリリットルを添加することによって、細胞培養のためのDMEMを調製します。この媒体は最大6ヶ月間4℃で保存することができます。
  2. 10μMの最終濃度にヌクレアーゼフリー水で凍結乾燥されたプライマーを再懸濁します。 -20℃で保存して再懸濁したプライマー。
  3. 放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液(150mMのNaCl、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50mMトリス、pH8.0)に調製します。使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足し、使用時には氷の上のバッファを維持します。 4°Cで保存。
  4. 0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを用いて滅菌水およびシリンジフィルター中10mg / mLのポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)を準備。ソリューションは、最大6ヶ月間4℃で保存することができます。
  5. PBSの10mLの中10mgを溶解することによりニトロブルーテトラゾリウムクロリドの1mg / mlのワーキング溶液を調製します。 4°Cで保存。

GRHL2 2.レンチウイルス形質導入

1日目

  1. プレート補充DMEM 2mL中の6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 HEK293T細胞。自動細胞カウンターを用いて細胞を定量化します。 5%CO 2で37℃で一晩培養した後、60%コンフルエント-細胞は40でなければなりません。

2日目

  1. 1.8pΔ8.9μgのとのpCMV-VSV0.2μgのと共に無血清培地200μlの2空ベクターμgの(のpCMV-UBC-EGFP)又は2のpCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24μg、25希釈-Gヘルパープラスミド。別個のチューブにおいて、トランスフェクションあたり無血清培地の200μL(二つのサンプル400μL8μL)中の脂質ベースのトランスフェクション試薬の4μLに希釈します。各プラスミド溶液に、トランスフェクション試薬混合物の200μLを加え、室温で20分間インキュベートします。
  2. incuba中、ンは、真空吸引によって培地を除去し、PBS 1mLで細胞を洗浄することによりHEK293T細胞を洗浄します。無血清培地の800μLとPBSを交換してください。 5%CO 2中で37℃で2時間細胞を各ウェルにステップ2.2滴下からのプラスミド混合物をインキュベートし、20分後、トランスフェクション試薬の200μLを加えます。
  3. 慎重に真空吸引によりトランスフェクション培地を除去して補充したDMEMの2mLで交換してください。一晩の培養インキュベーターにセルを返します。
    注:HEK293T細胞は緩く付着しています。メディアの交換は、皿またはフラスコの底から細胞を除去することを制限するように注意して行わなければなりません。

3日目

  1. 補充DMEM 2 mlにトランスフェクトされたHEK293T細胞とプレートの6ウェルプレートのウェルあたり3×10 5 RD細胞を培地をリフレッシュ。一晩の培養細胞。 RD細胞は、市販のヒト横紋筋肉腫細胞株です。

4日目

  • HEK293T細胞からのウイルスのメディアを収集します。新しい15 mLコニカルにHEK293T細胞および場所からDMEM培地をピペット。慎重に新しいDMEM培地に交換し、次の日のために戻っインキュベーターでHEK293T細胞を置きます。
  • 二つの新しい50mlにウイルス培地1mL当たりの10mg / mLのポリブレンコニカルチューブ(空ベクタートランスフェクション用とGRHL2トランスフェクションのための別)の2μLを加えます。 3mLのシリンジからプランジャーを取り外し、先端に0.45μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けることにより、シリンジフィルターウイルス媒体。
    1. 注射器のバレルにステップ2.6に収集ウイルスメディアを追加し、そしてポリブレンを含有する新しい50 mLコニカルチューブに培地を突入。真空吸引によってRD細胞から培地を除去し、RD細胞濾過ウイルスメディアを追加します。
  • 5日目

    1. ウイルスのメディアが収集された後に繰り返して4日目HEK293T細胞を破棄することができます。

    7日目

    1. PBS 1mlで洗浄RD細胞およびウェルあたり0.05%トリプシンの200μLを加えます。 、5分間37℃でインキュベート補充した培地2 mLを加え、そして新しい15 mLコニカルに細胞懸濁液を移動させます。室温と吸引メディアで5分間250×gで遠心分離細胞。 DMEM 1mLの(5%FBSおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを補充した)中に再懸濁します。
      注:FBSの高い割合を使用するには、フローサイトメトリーの間に目詰まりを起こすことがあり
      1. フローサイトメトリーのためのフィルタセル。氷上のチューブと場所チューブ、フローサイトメトリーに30μmのフィルターを通して1mLのRD細胞懸濁液を適用するためにピペットを使用。
      2. DMEMの0.5 mLを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブにソート+ EGFP細胞26は、氷上で、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン及び場所を補充しました。プレートEGFP +培養インキュベーター中、12ウェルプレート及び場所の単一のウェルに添加したDMEM 1mLの合計で細胞を選別しました。
        ;注:フローサイトメトリーからこの形質導入後のEGFP +細胞の収率は、通常、低い(50,000〜100,000細胞)です。ステップ3に進む前に、14日 - 細胞は、10培養する必要があるかもしれません。

    miR-200Sの3リバーストランスフェクション

    1. 反復凍結/融解サイクルを回避するために、-20℃で、ヌクレアーゼフリーのH 2つの Oアリコートストック及びストアを使用したmiR-200模倣体の50μMのストックを調製。
    2. 300μlの無血清培地を無血清培地300μLまたは50μM陰性対照miRNAの9μLを各50μMのmiR-200模倣(MIR-200A、のmiR-200B、およびmiR-200C)の3μLを加えます。
    3. 無血清培地の600μLに対するsiRNA特異的トランスフェクション試薬の6μLを添加し、2本のチューブ、ステップ3.2からの二つのmiR混合物の各々のための1つに、この混合物の300μLを分割します。トランスフェクション試薬の300μLの混合物でステップ3.2からそれぞれのmiR混合物の300μLを組み合わせます。部屋TEで20分間インキュベートmperature。
    4. インキュベートしながら、処置あたり無血清培地の2.4mLの(250個の細胞/μL)でセクション2で作成したEVやGRHL2を発現60万EGFP + RD細胞の細胞懸濁液を調製します。
    5. 24ウェルプレートでは、6つのウェルにステップ3.3からのmiR-200の混合物または陰性対照ミックスウェル当たり100μLを追加し、それぞれのmiRミックスの3つのウェルに各細胞懸濁液400μLを加えます。
    6. 一晩CO 2 5%で37℃で細胞をインキュベートし、完全に次の日DMEMを補完するために、メディアを変更します。適切な緩衝液(下記参照)を使用して分析のために2日後に細胞を回収。 METを受けRD肉腫細胞のタイムラプスイメージングは​​、補足資料として提供されています。画像の自動化生細胞イメージャ27を使用して10倍を目的とした各ウェルごとに2時間。

    4. RNA抽出、逆転写、および定量PCR

    1. 標準RNAを使用して、製造業者の指示に従ってRNAを抽出抽出キット24。抽出されたRNAは、-80℃で保存することができます。
    2. RNA濃度を定量化します。解凍し、氷上でRNAで動作します。 RNA濃度を定量化するために、製造業者のプロトコルに従ってプレートリーダー分光光度計を用いて260nmでのUV吸光度を測定します。ヌクレアーゼフリー水で最低の濃度になるように、全ての試料を希釈します。
    3. 相補的DNA(cDNA)にトータルRNAの逆転写を行います。 20μlの反応容量24に転写し、ヌクレアーゼフリー水、逆PCRバッファ、dNTPミックス(100ミリモル)、ランダムヘキサマープライマーを用いてトータルRNAのない未満100 ngのを結合しません。製造者のプロトコールに従ってRTサイクルを実行します。 cDNAを-20℃で長期保存することができます。
    4. ヌクレアーゼを含まないH 2 Oの80μL100μLに20μLの反応を希釈
    5. 蛍光ベースの挿入色素2倍のqPCRマスターミックスの5μL、各10μMプライマーの0.06μLを混合サンプルあたりの希釈RT反応のND 2μL。
    6. 蛍光ベースのマスターミックスのための製造業者のプロトコルに従って、定量PCRを実行します。
    7. デルタCT法によるmRNAの相対量を定量化し、GAPDHに正規化します。各治療群の標準偏差±生物学的複製の平均mRNA発現をプロットします。
      注:RNAを扱う場合には、特別な注意事項は、RNaseフリーのプラスチックおよび試薬を使用するなどのRNase、との接触を避けるように注意する必要があります。非使い捨て機器は、RNアーゼを削除するには、使用前に処理しなければなりません。

    5.免疫蛍光染色

    1. 次のステップ3.6、24ウェルフォーマットでRD細胞からの真空吸引により吸引媒体。
    2. ウェル当たり4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500μLを加えることによって細胞を固定し、室温(RT)で15分間インキュベートします。必要に応じて固定後、リン酸場所細胞を4℃で一晩生理食塩水(PBS)とストアバッファリング。
    3. 透過処理PBS + 0.2%のTriton-X100の500μLを添加し、RTで30分間インキュベートすることにより細胞。真空吸引によって、透過化緩衝液を除去し、PBSで3回洗浄します。
    4. 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/ PBS 500μLでブロックし、室温で30分間、細胞をインキュベートします。必要であれば、細胞を4℃で一晩保存することができます。
    5. 一次抗体の希釈を準備します。 15 mLコニカルに5%BSAのピペットを200μL/ウェルPBS(12個のウェル= 2.4 mL)および5%BSA 1mLあたり一次抗体の1μLを追加/ PBSは、必要に応じ。真空吸引によってブロッキングバッファーを除去し、各ウェルに希釈した一次抗体200μLを分注します。
      1. 室温で又は一晩4℃で1時間、5%BSA / PBS中で一次抗体を希釈千:1で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSで細胞を2回洗浄します。
    6. 上記のように5%BSA / PBSの同じ体積の二次抗体の希釈液を調製。 2000希釈:1を使用して遠赤色色素結合二次抗体を追加します。さらに追加ミックスにHoechst色素を1μg/ mLです。 PBSを削除し、各ウェルにミックスの200μLを追加します。
      1. 暗所で室温で1時間インキュベートします。 PBSで3回洗浄し、PBSで細胞を残し、そして箔を用いた光から細胞を保護します。必要であれば、細胞を4℃で保存することができます。
    7. 650nmの - 励起波長594を有する倒立落射蛍光顕微鏡で400倍総合倍率で画像セル。

    6.ウェスタンブロッティング

    1. 氷冷PBSで2回3.6から細胞を洗浄します。氷の上に、1×RIPA緩衝液の50μLで溶解細胞は、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。
    2. 15分間4℃でロック溶解物を、1.5mLのチューブにライセートを収集し、そしてサンプルを明確に5分間高速(2万XG)で遠心分離。必要に応じて細胞溶解物を-80℃で長期保存することができます。
    3. ブラッドフォードアッセイを用いて総タンパク質を定量し、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに等量のタンパク質をアリコート。ブリン2-メルカプトエタノールを補充したRIPA緩衝液と3倍のLaemmliローディング緩衝液を用いて等量のg個のサンプル。
    4. 95℃で5分間、1XのLaemmliサンプルローディングバッファーでサンプルをインキュベートし、45分間200 Vで4-12%のトリス - グリシンゲルを用いてSDS-PAGEを実行します。タンパク質の量は、細胞株に応じた範囲をロードしました。いくつかのケースでは、全タンパク質の50〜100μgの間葉系細胞株におけるE-カドヘリンを検出するために必要とされます。
    5. 1×トリス - グリシントランスファー緩衝液中の50 Vで2時間ニトロセルロース膜に転写タンパク質。
    6. BSAベースのブロッキング緩衝液中で室温または一晩、4℃で1時間ブロック膜。
    7. 、ブロッキング緩衝液5ml 1,000濃度を膜に希釈液を追加し、穏やかに室温で又は一晩4℃で1時間、揺らしながらインキュベート:1で一次抗体を希釈します。 0.05%Tween-20を用いて膜をPBSで3回洗浄します。
    8. 赤外蛍光結合secondarと共にRTで1時間膜をインキュベート1のY抗体:上記のようにブロッキング緩衝液20,000希釈。
    9. 0.05%のTween-20を含むPBS中で膜を2回洗浄し、PBS中で次に一度。
    10. 標準の赤外蛍光検出を用いた画像の膜。

    7.足場非依存性増殖アッセイ

    注:詳細軟寒天アッセイプロトコルの場合、28を参照してください。

    1. 湯浴中で42°Cまで暖かい滅菌2X DMEM培地。この間、熱が3分間マイクロ波中で1%アガロースを事前オートクレーブ。必要に応じて、一度に又は完全に溶融するまでさらに30秒間電子レンジ。 42°Cの水浴にアガロース移動します。
    2. 無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置き、1で1%アガロース及び2X DMEM培地を混ぜる:6ウェルプレートにウェルあたり混合物1.5mlのための1比アカウンティング。必ずピペッティング誤差を考慮して、気泡を避けるために、余分なDMEM /アガロースを準備します。
    3. に混合物を追加ウェルの側面、気泡フォームを確保せず、室温で30分間放置。
    4. 底層が固化されている間、培地を吸引し、1mLのPBSで1回洗浄することにより、ステップ3でトランスフェクトされたRD細胞の各群を準備します。吸引PBSと0.05%トリプシンの0.2 mLを加え、5分間37℃でインキュベートします。
    5. 単一細胞懸濁液を形成するために、メディア及び粉砕物細胞の0.8 mLのトリプシンを中和します。 15 mLコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。
    6. 細胞を数え、ウェルあたり10,000個の細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算します。
    7. 完全に溶融するまでの時間で30秒、続いて3分間マイクロ波で0.6%アガロースを加熱します。 42°Cの水浴にアガロース移動します。
    8. 無菌フード内の42℃の水を用いてビーカー中で50 mLコニカルチューブを置きます。 6ウェルプレートにウェル当たり混合物の1.5mLのを準備するために1:1の比で0.6%アガロース希釈細胞懸濁液を混合します。必ずピペッティング誤差を考慮して混ぜアガロース/余分な細胞懸濁液を調製し、泡を避けるために。
      注:ここは42°Cで動作することが重要です。温度が低すぎると、混合物は、めっき前に固化し、42°C以上の温度では細胞生存率に影響を与えます。
    9. 細胞を数回粉砕することによってよく混合し、気泡フォームを保証しない、ウェルに細胞混合物を添加し、RTで20分間凝固させ。
    10. 各ウェルに添加した培地2 mLを加え、インキュベーターにプレートを移動させます。
      1. 3-4週間または多細胞コロニーが形成するまで、週に一度メディアを変更します。真空吸引により培地を除去する際の寒天に触れないように注意してください。代替的に、液体媒体の最上層を除去するために、P1000を使用します。
      2. ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液の200μL(PBS中1mg / ml)を添加することによって、軟寒天プレートを染色し、37℃で一晩プレートをインキュベートします。撮像のためにPBSで翌日のメディアを交換してください。
      3. 倒立顕微鏡で40倍総合倍率での画像ウェル。
      4. コロニー面積と数のためのImageJの分析を行います。プロットは、標準偏差±生物学的複製のコロニー数を意味します。

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    Representative Results

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    肉腫細胞におけるMETの誘導のためのスキーマ

    肉腫細胞におけるMET状変化の誘導のための一般的なタイムラインは、 図1に示されています。プロトコルは、miR-200ファミリー( 図1B)のトランスフェクションに続いてGRHL2( 図1A)を 、形質導入することによって開始します。 GRHL2またはmiR-200ファミリーメンバーは、単独で発現された場合に、RD細胞の外観に影響を与えることができなかったが、一緒にGRHL2及びmiR-200Sの異所性発現RD細胞における上皮様形態学的変化をもたらします。増加した細胞-細胞接触( 図1C)とより丸みを帯びた外観に紡錘状の形態からの細胞転移。

    肉腫細胞におけるMETのような変化の誘導

    GRHL2とのmiR-200の際にRD細胞における形態変化過剰発現は、上皮マーカーE-カドヘリン( 図2A)のアップレギュレーションを伴っていました。 MIR-200Sの添加は、単独で、E-カドヘリンをアップレギュレートするが、相乗的に増強さE-カドヘリン発現( 図2A、logスケールではない)のmiR-200SとGRHL2過剰発現を組み合わせます。加えて、( 図2B)(また、透明帯occludens 1、ZO-1としても知られる)、上皮接着分子、のEpCAMおよびTJP1、白矢印の細胞-細胞接合部で増加しました。

    METの誘導は、肉腫細胞のコロニー形成能を低下させます

    上皮タンパク質のアップレギュレーションは、間葉系遺伝子のmiR-200の標的として知られているZEB1とのNotch1( 図3A)のダウンレギュレーションを伴っていました。コロニー数( 図3B)によって測定されるMETの誘導は、RD細胞の足場非依存性増殖を減少させました。このGRO阻害WTHのみでのmiR-200Sによるものでした。 GRHL2の過剰発現は、足場非依存性増殖( 図3)の増加につながりました。これは、足場非依存性増殖誘導する22 GRHL2発現を示す以前の報告と一致しています。

    図1
    1:GRHL2 過剰発現及びmiR-200トランスフェクションとMET誘導のタイムライン。標的細胞におけるGRHL2の異所性過剰発現の(A)のタイムライン。 (B)標的細胞におけるmiR-200ファミリーメンバーの逆トランスフェクションを介して、MET誘導のタイムライン。 (C)GRHL2及びmiR-200過剰発現METと一致する標的細胞の形態の変化をもたらしました。スケールバー=75μmのこちらをクリックしてください。この図の拡大版を表示します。

    図2
    図2は:GRHL2 およびmiR-200Sの同時過剰発現は、標的細胞におけるMETにつながりました。 GRHL2及びmiR-200Sの組み合わせの発現は、mRNA(±標準偏差平均値)とタンパク質レベルの両方でのE-カドヘリン発現に対する相乗効果を生じながら、MIR-200Sの(A)式は、上昇したE-カドヘリン発現を導きました。 (B)GRHL2及びmiR-200Sの合成発現は、細胞-細胞接触(矢印)でのEpCAMおよびTJP1の発現の増加につながりました。 =20μmのスケールバー。 * Tukeyの事後correction.This図は、参照24から変更されていると0.05はANOVAを用いて分析<Pを示しています。微生物学、 分子細胞生物学 、ボリューム36、問題19、2503年から2513年、2のための著作権©アメリカの社会016 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    3:MIR-200S 抑制する間葉系マーカーの発現及び肉腫細胞における足場非依存性増殖を減少。 (A)オーバー- MIR-200Sの表現ではなくGRHL2はZEB1およびNotch1のmRNA発現(平均値±標準偏差)を阻害しました。 (B)のmiR-200Sの発現オーバーなくGRHL2は肉腫細胞においてアノイキス耐性を阻害しました。染色されたコロニー(スケールバー= 200ミクロン)及びコロニー数(平均値±標準偏差値)の定量化の代表的な画像が示されています。 * P <0.05は、rから変更されたTukeyの事後correction.This数字でANOVAを用いて分析を示していますリファレンス24。微生物学、 分子細胞生物学 、ボリューム36、問題19、2503年から2513年、2016年の著作権©アメリカの社会は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    補足ビデオ:RD細胞は、空のベクターおよび陰性対照miRNAを表現します。ビデオは、自動化された生細胞のイメージャーを使用して2時間ごとに取得し、空のベクターおよび陰性対照のmiRNAをトランスフェクトしたRD細胞の画像からコンパイルされました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには右クリックします。)

    図3 />
    補足動画2:GRHL2-EGFPおよび陰性対照miRNAを発現しRD細胞。ビデオは、自動化された生細胞のイメージャーを使用して2時間ごとに取得しGRHL2-EGFPおよび陰性対照のmiRNAをトランスフェクトしたRD細胞の画像からコンパイルされました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには右クリックします。)

    図3
    補足ビデオ3:空のベクターとmiR200 miRNAを発現しRD細胞。ビデオは、空のベクター及びmiR200のmiRNAをトランスフェクトしたRD細胞の画像からコンパイルされた自動化された生細胞のイメージャーを使用して2時間ごとに取得しました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには右クリックします。)

    NT」FO:キープtogether.withinページ= "1"> 図3
    補足ビデオ4:RD細胞はGRHL2-EGFPおよびmiR200 miRNAを表現。 GRHL2-EGFPおよびmiR200のmiRNAをトランスフェクトしたRD細胞の画像からコンパイルされたビデオは、自動化された生細胞のイメージャーを使用して2時間ごとに取得しました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには右クリックします。)

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    Discussion

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    肉腫はまれですが、間葉系細胞系譜の非常に攻撃的な癌。彼らの間葉系統にもかかわらず、肉腫のサブセットは、より多くの上皮様状態への表現型の転移を起こすように見えます。より多くの上皮様腫瘍の患者は、24あまり積極的であるとして、このMET-のようなスイッチは、予後関連性を持っています。その臨床的関連性にもかかわらず、肉腫でこれらの表現型の遷移を駆動する分子メカニズムを扱ういくつかの研究があります。

    肉腫細胞におけるMETのような遷移を調べるために、我々は、上皮要因GRHL2とのmiR-200ファミリーの発現を組み合わせることによって、MET-誘導モデルを開発しました。この方法は、急速に上皮様形態および遺伝子発現の変化によって測定されるようになること肉腫細胞を誘導します。肉腫細胞にMETを誘導するためにこのプロトコルを使用すると、このような、肉腫の侵略を駆動表現型のこれらの遷移の影響の研究を促進します移動、浸潤、増殖と死の抵抗として、どのように生物学におけるこれらの変化のそれぞれは、薬剤耐性に影響を与えることができます。

    上皮由来の癌の文脈において、1つの間葉系因子の発現は、多くの場合、EMT 14を誘導するのに十分です。しかし、MET 2つの上皮因子、GRHL2およびmiR-200Sの発現のこの肉腫由来のモデルでは、必要とされます。 GRHL2はロバストZEB1 24のような、唯一の上皮遺伝子リプレッサーのMIR-200ベースの抑制の存在下で上皮遺伝子を活性化することができたしながら興味深いことに、MIR-200Sは、単独で、GRHL2よりMETのほとんどのバイオマーカーに強い影響を与えました。いくつかの間葉系細胞タイプの上皮遺伝子は、METを駆動する( 例えば介し GRHL2)脱抑制( 例えば 介したmiR-200S)および活性化の両方である必要があることが可能です。

    私たちは、異なるセル画またがっGRHL2発現のレベルの変化を経験していますLライン。これを克服するために、我々はまた、実験前にEGFP陽性細胞をフローサイトメトリーでソートするEGFP 25を表現GRHL2発現プラスミドを使用していました。異なる種類の細胞でのmiR-200SとGRHL2の機能を検証することも重要です。 EMTは、したがって、我々はのmiR-200又はGRHL2によって調節5つの遺伝子を分析などの細胞株、癌の種類、治療、に基づいて、コンテキスト依存変化を有することができ、上皮および間葉関連遺伝子の発現に基づいてスペクトルとみなされますセルコンテキスト依存の変化を考慮。このアッセイのもう1つの注意点は、METの誘導のためのmiR-200Sの一過性トランスフェクションへの依存です。複数の反復トランスフェクションが必要になったときにこのように、長期的な実験は、高価で複雑になることができます。これは、miR-200の発現プラスミドを使用することによって克服することができます。

    他の研究はまた、肉腫におけるMETの証拠を報告しています。例えば、METはleiomyosaのサブセットにおいて観察されましたrcomasとは、患者のための良好な生存と関連していました。機構的に、Yangら。 siRNAでのスラグの平滑筋肉腫細胞株阻害MET状変化29を誘導するのに十分であることがわかりました。同様に、間葉系幹細胞におけるさらに別の間葉要因、カタツムリの枯渇は、マウス30で肉腫の形成を減少させました。したがって、細胞型によって変化し得るMET様表現型への複数の経路があることが文献から明らかです。これはMETを誘導するための唯一の方法はありませんが、我々は、横紋筋肉腫(RD細胞)及び骨肉腫(143B細胞)を含む2つの肉腫の亜型でMETを誘導するために私達の方法を使用しています。今後は、肉腫細胞の広い範囲で、これらの異なる方法を比較するために興味深いものになるだろう。例えば、特定の肉腫のサブタイプは、多かれ少なかれ影響を受けやすいMET誘導にそれらを作る基本的な遺伝的またはエピジェネティックな変化がありますか?

    METの影響を特定肉腫細胞における生物学的出力のさまざまなより上皮様肉腫の患者は予後の改善を持っている理由のより良い理解を提供することができます。また、状態間の表現型の遷移を駆動に対する治療の影響を理解することは私たちの生物学的理解を深めなり、肉腫患者の現在の治療への応答に知らせます。

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    Disclosures

    著者は、開示することは何もありません。

    Acknowledgments

    JASはデュークがん研究所、デューク大学泌尿生殖器腫瘍学研究所、および整形外科のデューク大学の学部からの支援を認めています。 HLは、理論生物物理学のための国立科学財団(NSF)センターによってサポートされていました(NSF PHY-1427654)およびNSF DMS-1361411、およびテキサス州の癌研究におけるCPRITとして(がん予防とテキサス州の研究所)奨学生ライス大学。 KEWはメアリー・C・ファラック-カーソン、JN Onuchic、サミル・M・ハナッシュ、ケネス・J・ピエンタ、ドナルドS. Coffeyのに有用な議論の恩恵を受けたNIH F32 CA192630 MKJ及びHLによって支持されました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
    Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
    SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
    Odyssey Fc LI-COR Inc
    ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
    PCR microplate Corning 321-29-051
    KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
    Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
    Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
    10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
    10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
    RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
    Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
    Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
    Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
    Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
    Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
    DPBS Life technologies 14190-144
    0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
    DMEM Life technologies 11995-065
    Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
    Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
    Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
    miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
    hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
    has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
    has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
    Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
    anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
    anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
    anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
    anti-ZO1 Invitrogen 402200
    IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
    IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
    anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
    anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
    Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
    Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
    Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
    GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
    GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
    Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
    Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
    ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
    ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
    NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
    NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
    nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
    hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
    3 mL syringe BD Bioscience 309657
    Sterile syringe filter VWR 28145-505
    5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
    High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
    4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
    Triton-X100 Sigma 93443
    bovine serum albumin Sigma A7906

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    References

    1. Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33, (3), 311-318 (2012).
    2. Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341, (1), 24-29 (2013).
    3. Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347, (1), 103-116 (2012).
    4. Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293, (3), L525-L534 (2007).
    5. Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25, (11), 675-686 (2015).
    6. Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
    7. Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27, (20), 2192-2206 (2013).
    8. Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33, (2-3), 441-468 (2014).
    9. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34, (18), 3486-3499 (2014).
    10. Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16, (3), 321-331 (2015).
    11. Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39 (2013).
    12. Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11, (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
    13. Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11, (101), 20140962 (2014).
    14. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, (4), 704-715 (2008).
    15. Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241 (2014).
    16. Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). 697395 (2015).
    17. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. (2016).
    18. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18, (3), 256-263 (2015).
    19. Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6, (9), 6472-6498 (2015).
    20. Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51, (11), 982-996 (2012).
    21. Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95, (3), 308-314 (2014).
    22. Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288, (32), 22993-23008 (2013).
    23. Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137, (22), 3835-3845 (2010).
    24. Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36, (19), 2503-2513 (2016).
    25. Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287, (44), 37282-37295 (2012).
    26. Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
    27. Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5, (9), 2499-2512 (2014).
    28. Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998 (2014).
    29. Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9, (11), 2405-2413 (2010).
    30. Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16, (5), 413-421 (2014).
    31. Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11, (6), e0156904 (2016).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
    Posted by JoVE Editors on 07/03/2018. Citeable Link.

    An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.

    One of the authors' names was corrected from:

    Shenghan Xu

    to:

    Shengnan Xu

    肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導
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    Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).More

    Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

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