Summary

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

Published: April 07, 2017
doi:

Summary

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

Abstract

표현형 소성은 세포가 일시적으로 다른 혈통의 특성을 얻을하는 현상을 말한다. 암 진행하는 동안, 표현형의 가소성은 침공, 보급 및 전이를 구동한다. 표현형 가소성 연구의 대부분은 상피 유래 암의 맥락에서되었지만 실제로, 그것은 mesenchymal- 유사한 현상을 겪고 육종의 부분 집합으로, 또한 표현형의 가소성을 전시, 기원 중간 엽 있습니다 육종을 밝혀 상피 성 전이 (MET). 여기서는 각각 순차적 GRHL2 및 미르 200 패밀리는 세포 형질 도입 및 형질 전환을 이용하여 표현 육종 환자 samples.We 관찰이 메티오닌과 같은 현상을 모방 미르-200 가족 grainyhead 같은 2 (GRHL2)를 포함하는 방법을 개발 더 나은 육종 세포에서 이러한 형질 전환의 분자 토대를 이해합니다. 미르 200S 및 GRHL2 표현 육종 세포는 상피 향상된 characterist 입증세포 형태와 상피와 중간 엽 바이오 마커의 변화에 ​​ICS. 이러한 방법을 사용하여 앞으로의 연구는 더 나은 등의 이동, 침윤, 전이 성향 및 치료 저항 등의 육종 세포에 대한 MET-같은 프로세스의 표현형의 결과를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

표현형 가소성 세포 표현형 사이의 가역적 인 변화를 의미하고, 일반적으로 두 가지 유형, 상피 간 간엽 (EMT) 전환 및 중간 엽 간 상피 천이 (MET)로 분할된다. 이 표현형의 가소성은 개발 및 상처 치유 1과 다세포 생물의 정상적인 과정에서 중요한 역할을한다; 그러나,이 같은 경로 유전자 발현 프로그램 또한 섬유증, 질병을 초래할 수있다 (검토를 2, 3, 4), 암 전이 (참고 문헌 5, 6, 7의 평가 8). 전이 동안, 예를 들어, EMT 세포 극성, 세포 – 세포 상호 작용을 방해하고, 침략 9, 10 추진하고 있습니다. 함께, EMT 기여암 세포의 보급을 촉진하는 표현형 상태로의. 또한 EMT는 암 세포 대사 (6)의 규제 완화 약물 저항 (11), (12)의 개발을 포함 공격적인 표현형을 유도 다른 표현형 변화, 증가 된 종양 개시 능력 (13), (14)와 면역 회피 15 호스트의 호스트로 이끈다.

표현형 소성 잘 암의 진행에서 연구되고있다; 그러나, 육종은 표현형의 가소성을 나타낸다. 암의 표현형 가소성 같은 드라이버 중 일부는 또한 육종 소성 및 공격성에 기여하는 것처럼 흥미롭게도,이 나타납니다. 예를 들어, 육종 환자의 순환 성 종양 세포 (CTCS은)는 EpCAM, 일반적으로 상피 세포 (16)에서 발견되는 세포 표면 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. ADDI전통적으로, 250 개 연조직 육종 샘플 상피 형상 또는 간엽 같은 유전자 발현에 기초로 분류 하였다. 상피와 같은 바이오 마커의 서명이있는 환자는 중간 엽 같은 바이오 마커의 서명 (17)을 가진 환자보다 더 나은 예후를했다. 이것은 더 상피와 같은 암 환자보다 중간 엽 같은 종양 18 환자에 비해 더 나은 결과를 보유하고있는 많은 암과 일치한다.

일부 육종이 생체와 MET와 일치 유전자 발현 경로를 표시하지만,이 표현형 가소성의 분자 토대는 잘 이해되지 유지. 육종 MET의 메커니즘과 드라이버를 연구하기 위해 우리는 두 가지 상피 특정 요소를 사용하여 MET 유도의 모델을 개발, 마이크로 RNA (은 miR) -200 가족과 grainyhead 같은 2 (GRHL2). 미르-200S는 messen의 3 '의 UTRs에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는 작은 비 RNA를 코딩하는 가족게르 RNA와 단백질에 방지 번역. 미르 141, 미르 (200A)를 포함 하나, 미르-200B, 200C 미르, 미르-429을 포함한 타 – 미르-200 가족 개의 서브 그룹들로 구성된다. 미르-200 계열의 구성원은 상피 조직에 충실 미르-200S 손실은 암 (19)의 전이와 관련된다. 미르-200 계열은 정상 조직에 비해 20 연조직 육종에서 하향 조절된다. 미르-200S 유사하게, GRHL2 상피 개발 (21)에 대한 중요 핵심 레귤레이터이다. GRHL2 전사 인자는 E-cadherin의 상피 유전자를 상향 조절하는 방법은 두 가지 작용 1) 상피 세포에서 GRHL2 직접 EMT 마스터 레귤레이터 억압을 ZEB1 22; 2) GRHL2 직접 상피 유전자 (23)의 전사를 활성화합니다. 우리의 이전 연구는 것으로 나타났습니다 육종 세포 미르-200S와 GRHL2의 결합 된 표현MET-같은 표현형 (24)를 유도한다. 여기서는은 miR-200S 및 GRHL2의 이소성 발현하여 육종 세포에서 MET 유도 시험 관내 모델을 작성하는 구체적인 프로토콜을 제안한다.

Protocol

시약의 제조 1. 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 – 스트렙토 마이신 (5,000 U / ㎖) 500 ㎖의 DMEM에 5 mL의 50 ㎖를 첨가하여 세포를 DMEM 배양을 준비한다. 이 매체는 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 10 μM의 최종 농도 핵산 분해 효소가없는 물에 동결 건조 된 프라이머를 재현 탁. 저장 -20 ° C에서 프라이머를 재 – 중단. radioimmunoprecipitation 분석 (RIPA) 완충액 (150 mM의 염화나…

Representative Results

육종 세포에서 MET 유도를위한 스키마 육종 세포에서 MET와 같은 변화의 도입을위한 일반적인 타임 라인은도 1에 도시되어있다. 프로토콜은 미르-200 계열 (도 1b)의 형질 GRHL2 하였다 (도 1a)을 열 변환하는 것으로 시작한다. GRHL2 또는은 miR-200 가족만으로는 표현할 때 RD 세포의 모양에 영향을 ?…

Discussion

육종은 중간 엽 계보의 희귀하지만, 매우 공격적인 암이다. 자신의 중간 엽 혈통에도 불구하고, 육종의 부분 집합은 더 상피와 같은 상태로 형질 전환을 겪을 것으로 보인다. 더 상피와 같은 종양을 가진 환자가 24 덜 공격적으로이 MET-같은 스위치는, 예후 관련이있다. 임상 관련성에도 불구하고, 육종 이러한 형질 전환을 운전하는 분자 메커니즘을 해결 몇몇 연구가있다.

<p cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JAS는 듀크 암 연구소, 듀크 대학 비뇨 생식기 종양학 연구소 및 정형 외과의 듀크 대학교의 지원을 인정합니다. HL은 이론 생물 물리학에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation, NSF) 센터에 의해 지원되었다 (NSF PHY-1427654)와 NSF DMS-1361411, 텍사스 주 암 연구에 CPRIT로 (암 예방 및 텍사스 연구소) 학술 라이스 대학 (Rice University)에서. KEW는 NIH F32 CA192630 MKJ 지원하고 HL 메리 C. Farach-카슨 JN Onuchic 사미르 M. Hanash, 케네스 J 피엔타, 도널드 S. 코피 유용한 논의 혜택.

Materials

Countess automated counter Life technologies AMQAX1000
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher A24811
Odyssey Fc LI-COR Inc
ViiA7 Real Time PCR System Thermo Fisher 4453536
PCR microplate Corning 321-29-051
KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit KAPA Biosystems KK4602
Starting Block (PBS) Blocking Buffer Thermo Fisher 37538 BSA-based blocking buffer
Agarose General Purpose LE Genesee Scientific 20-102
10X Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0732 Running buffer
10X Tris/Glycine Buffer Bio-Rad Laboratories Inc 161-0734 Transfer buffer
RIPA Buffer Sigma Life Sciences SLBG8489
Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose GE Healthcare Lifesciences 10600012
Quick-RNA MiniPrep Kit Genesee Scientific 11-358
Laemmli Sample Buffer (4X) Bio-Rad Laboratories Inc 1610747
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1703930
Mini-Protean Tetra Cell Bio-Rad Laboratories Inc 1658005EDU
DPBS Life technologies 14190-144
0.05% Trypsin-EDTA Life technologies 11995-065
DMEM Life technologies 11995-065
Lipofectamine RNAi Max Thermo Fisher 13778150
Lipofectamine 2000 Ragents Thermo Fisher 11668019
Penicillin Streptomycin Life technologies 15140-122
miRVana miRNA mimic negative control #1 Thermo Fisher 4464058 neg miRNA
hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4464066 miR200A
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200B
has-miR-200 mirVana miRNA mimic Thermo Fisher 4404066 miR200C
Opti-MEM Life technologies 11088-021 serum-free media
anti-Ecadherin antibody BD Bioscience 610182
anti-beta actin Santa Cruz Biotechnology sc-69879
anti-EpCam Ab Serotec MCA18706
anti-ZO1 Invitrogen 402200
IRDye 800W LI-COR Inc 925-32210
IRDye 680 LI-COR Inc 926-32223
anti-mouse AlexaFluor 647 Thermo Fisher A211241
anti-rabbit AlexaFluor 647 Thermo Fisher ab150075
Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor Thermo Fisher 1861281
Precision Plus Protein Dual Color Bio-Rad Laboratories Inc 161-0374
Partec CellTrics Sysmex 04-004-2326 30 μm filter for flow
GAPDH-F IDT AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH-R IDT GCCCAATACGACCAAATCC
Ecadherin-F IDT TGGAGGAATTCTTGCTTTGC
Ecadherin-R IDT CGCTCTCCTCCGAAGAAAC
ZEB1-F IDT GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC
ZEB1-R IDT CGATTACACCCAGACTGC
NOTCH-F IDT GGCAATCCGAGGACTATGAG
NOTCH-R IDT CTCAGAACGCACTCGTTGAT
nitro blue tetrazolium  Sigma N5514
hexadimethrine bromide Sigma H9268 polybrene
3 mL syringe BD Bioscience 309657
Sterile syringe filter VWR 28145-505
5mL polypropylene round-bottom tube 352063 flow cytometry tubes
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher 4368814 reverse transcription kit
4% paraformaldyhyde Santa Cruz Biotechnology sc-281612
Triton-X100 Sigma 93443
bovine serum albumin Sigma A7906

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Ware, K. E., Gilja, S., Xu, S., Shetler, S., Jolly, M. K., Wang, X., Bartholf Dewitt, S., Hish, A. J., Jordan, S., Eward, W., Levine, H., Armstrong, A. J., Somarelli, J. A. Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. J. Vis. Exp. (122), e55520, doi:10.3791/55520 (2017).

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