Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi
Summary
Biz burada mikroRNA-200 aile üyeleri ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) kombine ektopik ifadesine dayalı sarkom hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişler (MET) uyarılması için bir hücre kültürü yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem kanser agresiflik ve tedavileri hakkında fenotipik esneklik biyolojik etkilerini daha iyi anlamak için uygundur.
Abstract
Fenotipik plastisite hücreleri geçici olarak başka bir soy özellikleri elde ettiği bir olguya karşılık gelir. karsinoma ilerleme sırasında, fenotipik plastisite işgali, yayılmasını ve metastaz sürer. fenotipik plastisite çalışmaların çoğu epitel türetilmiş karsinom bağlamında olmuştur Nitekim, bir mesenchymal- benzer bir fenomen geçiren sarkomlar bir alt kümesi ile de fenotipik plastisite sergiler, mezenkimal kaynaklı olan sarkomu, çıkıyor epitel geçiş (MET). Burada, sırasıyla ardışık GRHL2 ve miR-200 ailesi, hücre transdüksiyonunu ve transfeksiyon kullanılarak ifade sarkom hasta samples.We gözlemlenen bu MET benzeri fenomen taklit etmek için miR-200 aile ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) içeren bir yöntem geliştirdi daha iyi sarkom hücrelerinde bu fenotipik geçişlerinin moleküler temellerini anlamak. miR-200S ve GRHL2 ifade sarkomu hücreleri gelişmiş epitel characterist gösterdiHücre morfolojisi ve epitel ve mezenkimal biyobelirteçlerinin değiştirilmesinin ics. Bu yöntemleri kullanarak gelecekteki çalışmalar ile göç, invazyon, metastatik eğilimi ve tedavi direnci gibi sarkom hücreleri üzerinde MET benzeri işlemler, fenotipik sonuçlarını anlamak için kullanılabilir.
Introduction
Fenotipik plastisite hücre fenotipleri arasında tersinir bir geçiş anlamına gelir ve genel olarak iki tip epitelyal-to-mezenşimal (EMT) geçişler ve mezenkimal-için-epitel geçişler (MET) bölünür. Bu fenotipik plastisite bu gelişme ve yara iyileşmesi 1 olarak çok hücreli organizmalardan normal süreçlerde önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, bu aynı yollar ve gen ekspresyonu programları da fibroz, hastalığa yol açabilir (inceleme 2, 3, 4) ve karsinoma metastazı (referanslar 5, 6, 7 gözden, 8). Metastaz sırasında, örneğin, EMT hücre polarite, hücre-hücre etkileşimleri bozar ve istila 9, 10 destekler. Birlikte, EMT katkıdaKanser hücresi yayılmasını kolaylaştıran bir fenotipik durumuna s. Buna ek olarak, EMT aynı zamanda kanser hücre metabolizması 6 deregülasyonu, ilaç direnci 11, 12 geliştirilmesi dahil olmak üzere agresif fenotipi sürücü diğer fenotipik değişiklikler, artmış tümör başlatma yeteneğine 13, 14 ve bağışıklık kaçırma 15 ev sahibi bir dizi yol açar.
Fenotipik esneklik de karsinoma ilerlemesinde çalışılmıştır; Bununla birlikte, sarkomlar da fenotipik plastisite sergiler. karsinom fenotipik esneklik aynı sürücülerin bazıları da sarkom plastisite ve agresiflik katkıda sanki İlginçtir, o görünür. Örneğin, sarkom hastaların dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) EpCAM'ı, tipik olarak, epitel hücreleri 16 üzerinde bulunan bir hücre yüzeyi proteinini ifade etmek için gösterilmiştir. Addiarası olarak, 250 yumuşak doku sarkomu örnekleri epitelyal benzeri veya mezenşimal benzeri gen ifadesine dayalı olarak sınıflandırılmıştır. Epitel benzeri biyomarker imzadaki hastalar mezenkimal benzeri biyomarker imza 17 olan hastalarda daha iyi bir prognozu vardı. Bu, daha fazla epitel benzeri karsinom olan hastaların daha mezenkimal benzeri tümörler 18 olan hastalarla karşılaştırıldığında daha iyi sonuçlar sahip olduğu birçok karsinom, tutarlıdır.
Bazı sarkomlar biyolojik ve MET tutarlı gen sentezleme yolları gösterilirken, bu fenotipik esneklik moleküler temelleri yeterince anlaşılamamıştır. sarkomda MET mekanizmaları ve sürücüleri incelemek için iki epitel özgü faktörleri kullanılarak MET indüksiyon bir model geliştirdi, mikroRNA (miR) -200 ailesi ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2). miR-200S Messen 3' UTR bağlanarak gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar ailesidirger RNA ve protein içine önleme çevirisi. miR-141 ve miR-200a ihtiva eden bir ve miR-200b, miR-200c ve miR-429 de dahil olmak üzere – diğer miR-200 ailesi, iki alt grup oluşur. MiR-200 ailesinin üyeleri epitel dokuları açısından zengindirler ve miR-200s kaybı karsinomları 19 metastaz ile ilişkilidir. MiR-200 ailesi de normal doku 20 ile karşılaştırıldığında yumuşak doku sarkomları aşağı regüle edilir. MiR-200'ler benzer şekilde, GRHL2 epitel gelişimi 21 için önemli olan düzenlenmesinde anahtar rol oynar. GRHL2 transkripsiyon faktörü, E-kadherin gibi epitel genleri, yukarıya doğru düzenlemek için iki şekilde hareket eder: 1) epitel hücrelerinde, GRHL2 şirketinden EMT ana regülatör bastırmaktadır, ZEB1 22; ve 2) GRHL2 direkt olarak epitel genlerin 23 transkripsiyonunu aktive eder. Bizim önceki araştırmalar göstermiştir ki sarkom hücrelerinde miR-200'ler ve GRHL2 birleşik ifadesiBir MET benzeri fenotip 24 indükler. Burada, miR-200S ve GRHL2 ektopik ekspresyonu ile sarkom hücrelerindeki MET indüksiyon in vitro bir model oluşturmak için ayrıntılı protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sarkomları bir mezenkimal kökenli nadir fakat son derece agresif kanserlerdir. bunların mezenkimal kökenli rağmen, sarkom bir alt kümesi, bir daha epitel benzeri bir duruma fenotipik dönüşmesine görünmektedir. Daha fazla epitel benzeri tümörlü hastaların 24 daha az agresif olduğu gibi bu MET benzeri anahtarı, prognostik bir önemi vardır. klinik önemine rağmen, sarkomlarda bu fenotipik geçişlerini sürüş moleküler mekanizmalar çok az çalışma vardır.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAS Duke Kanser Enstitüsü, Duke Üniversitesi Genitoüriner Onkoloji Laboratuvarı ve Ortopedi Duke Üniversitesi Bölümü'nden destek kabul eder. HL Teorik Biyolojik Fizik Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Merkezi tarafından desteklenmiştir (NSF FİZ-1.427.654) ve NSF DMS-1361411, ve Texas Eyaleti Kanser Araştırma bir CPRIT olarak (Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü) Akademik Rice University'de. KEW NIH F32 CA192630 MKJ tarafından desteklenen ve HL Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta ve Donald S. Coffey ile yararlı tartışmalar yararlanmıştır.
Materials
| Countess automated counter | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Real Time PCR System | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplate | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Starting Block (PBS) Blocking Buffer | Thermo Fisher | 37538 | BSA-based blocking buffer |
| Agarose General Purpose LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10X Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Running buffer |
| 10X Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Transfer buffer |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μm nitrocellulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillin Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA mimic negative control #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA mimic | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | serum-free media |
| anti-Ecadherin antibody | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-mouse AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease and Phosphatesse Inhibitor | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μm filter for flow |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blue tetrazolium | Sigma | N5514 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | polybrene |
| 3 mL syringe | BD Bioscience | 309657 | |
| Sterile syringe filter | VWR | 28145-505 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tube | 352063 | flow cytometry tubes | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | 4368814 | reverse transcription kit |
| 4% paraformaldyhyde | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 |
References
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm. Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).
- Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. The role of EMT in renal fibrosis. Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).
- Willis, B. C., Borok, Z. TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).
- Ye, X., Weinberg, R. A. Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression. Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).
- Li, L., Li, W. Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation. Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).
- Tsai, J. H., Yang, J. Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis. Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).
- Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).
- Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).
- Mathow, D., et al. Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism. EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).
- Ware, K. E., et al. A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop. Oncogenesis. 2, e39 (2013).
- Yauch, R. L., et al. Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).
- Jolly, M. K., et al. Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness. J R Soc Interface. 11 (101), 20140962 (2014).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Chen, L., et al. Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression. Nat Commun. 5, 5241 (2014).
- Nicolazzo, C., Gradilone, A. Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma. Anal Cell Pathol (Amst). , 697395 (2015).
- Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2. Mol Cell Biol. , (2016).
- Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer. J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
- Humphries, B., Yang, C. The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy. Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).
- Renner, M., et al. MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas. Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).
- Petrof, G., et al. Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome. Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).
- Werner, S., et al. Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).
- Werth, M., et al. The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex. Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).
- Somarelli, J. A., et al. Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2. Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).
- Varma, S., et al. The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation. J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).
- Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry. Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).
- Zhao, Z., et al. A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation. Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).
- Borowicz, S., et al. The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. (92), e51998 (2014).
- Yang, J., et al. Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug. Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).
- Alba-Castellon, L., et al. Snail1 expression is required for sarcomagenesis. Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).
- Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells. PLoS One. 11 (6), e0156904 (2016).
