CAPRRESI: Chimera Assembly ved Plasmid Recovery og Restriction Enzyme Site Insertion
Summary
Her presenterer vi kimærmontering ved plasmidgjenoppretting og restriksjonsenzymstedinnsetting (CAPRRESI), en protokoll basert på innsetting av restriksjonsenzymsteder i synonym-DNA-sekvenser og funksjonell plasmidutvinning. Denne protokollen er en rask og rimelig metode for fusjon av proteinkoding-gener.
Abstract
Her presenterer vi kimærmontering ved plasmidgjenoppretting og restriksjon av enzyminnlegg (CAPRRESI). CAPRRESI drar fordel av mange styrker av den opprinnelige plasmidgjenvinningsmetoden og introduserer restriktionsenzymfordøyelse for å lette DNA-ligeringsreaksjoner (kreves for kimærmontering). For denne protokollen klones brukere av wildtype-gener i det samme plasmidet (pUC18 eller pUC19). Etter at silikoseleksjonen av aminosyresekvensregioner hvor kimærene skulle settes sammen, oppnår brukere alle de synonym-DNA-sekvensene som koder for dem. Ad hoc Perl skript gir brukere mulighet til å bestemme alle synonyme DNA-sekvenser. Etter dette trinnet søker et annet Perl-skript for restriktionsenzymsteder på alle synonym-DNA-sekvenser. Dette i silikoanalyse utføres også ved bruk av ampicillinresistensgenet ( ampR ) funnet på pUC18 / 19 plasmider. Brukere utformer oligonukleotider inne i synonymområder for å forstyrre wildtype- og ampR- gener ved PCR. Etter obtAining og rensing av komplementære DNA-fragmenter, oppnås restriksjon enzym-fordøyelse. Kimærsammenstilling oppnås ved å ligere passende komplementære DNA-fragmenter. PUC18 / 19 vektorer er valgt for CAPRRESI fordi de tilbyr tekniske fordeler, som for eksempel liten størrelse (2 686 basepar), høy kopiantal, fordelaktige sekvenseringsreaksjonsfunksjoner og kommersiell tilgjengelighet. Bruken av restriksjonsenzymer for kimærsammensetning eliminerer behovet for DNA-polymeraser som gir truende produkter. CAPRRESI er en rask og rimelig metode for fusjon av proteinkoding gener.
Introduction
Kimære gensamlinger har blitt mye brukt i molekylærbiologi for å belyse proteinfunksjon og / eller bioteknologiske formål. Forskjellige metoder eksisterer for fusjonsgener, slik som overlappende PCR-produktforsterkning 1 , plasmidutvinning 2 , homolog rekombinasjon 3 , CRISPR-Cas9-systemer 4 , stedregistrert rekombinasjon 5 og Gibson-samling 6 . Hver av disse tilbyr forskjellige tekniske fordeler; For eksempel fleksibiliteten til overlappende PCR-design, in vivo- valget av konstruksjoner under plasmidutvinning eller høy effektivitet av CRISPR-Cas9- og Gibson-systemer. På den annen side kan det oppstå noen vanskeligheter når du utfører noen av disse metodene; For eksempel er de to første tilnærmingene avhengig av stumpede DNA-fragmenter, og ligering av disse typer produkter kan være teknisk utfordrende sammenlignet med stikkKy-endig ligering. Site-directed rekombination kan etterlate spor av ekstra DNA-sekvenser (arr) på originalen, som i CrecoxP- systemet 5 . CRISPR-Cas9 kan noen ganger endre andre genomregioner i tillegg til målstedet 4 .
Her presenterer vi chimera-montering ved plasmidgjenoppretting og restriksjonsenzymstedinnsetting (CAPRRESI), en protokoll for fusing proteinkoding gener som kombinerer plasmidgjenvinningsmetoden (PRM) med innsetting av restriksjonsenzymsteder på synonym-DNA-sekvenser, forbedrende ligeringseffektivitet . For å sikre aminosyresekvensintegritet settes restriksjonsenzymsteder inn på synonym-DNA-sekvensstrøk. Blant fordelene med CAPPRESI er at den kan utføres ved hjelp av vanlige laboratoriereagenser / verktøy ( f.eks . Enzymer, kompetente celler, løsninger og termocykler) og at det kan gi raske resultater (når de aktuelle enzymer brukes). Stole på begrensningEnzymsteder som kommer fra synonym-DNA-sekvenser kan begrense valget av de eksakte fusjonspunktene inne i proteiene av interesse. I slike tilfeller bør målgener bli fusjonert ved bruk av overlappende oligonukleotider, og restriktionsenzymsteder bør settes inn på resistensgenet til vektoren.
CAPRRESI består av syv enkle trinn ( figur 1 ): 1) utvalg av kloningsvektoren, pUC18 eller pUC196; 2) i silikoanalyse av wildtype-sekvensene som skal smeltes; 3) utvalg av bryteområder for kimærsammenstilling og plasmidforstyrrelse; 4) i silico- generasjon av synonym-DNA-sekvenser som inneholder restriksjonsenzymsteder; 5) uavhengig kloning av wildtype-gener til det valgte plasmid; 6) plasmidforstyrrelse ved PCR, etterfulgt av restriktionsenzym fordøyelse; Og 7) plasmidutvinning ved bruk av DNA-ligering og bakteriell transformasjon. Kimære gener fremstilt ved denne teknikken bør verifiseres wEtter sekvensering.
PUC18 / 19 vektorer tilbyr tekniske fordeler for kloning og kimærmontering, for eksempel liten størrelse ( dvs. 2 686 basepar), høykopi-nummer, fordelaktige sekvenseringsreaksjonsfunksjoner og kommersiell tilgjengelighet 7 . Her ble en Escherichia coli vert brukt til å samle og håndtere chimærene fordi bakteriekulturer er billige og vokser raskt. På grunn av dette vil etterfølgende kloning av fusjonsfragmentene i de endelige målplasmiderne være nødvendig ( eks. Ekspresjonsvektorer som pRK415 i bakterier eller pCMV i pattedyrceller).
CAPRRESI ble testet for å fusere to primære sigmafaktorgener: E. colirpoD og Rhizobium etlisigA . Primær sigmafaktorer er RNA-polymerasubenheter som er ansvarlige for transkripsjonsinitiering, og de består av fire domener ( dvs. σ1, σ2, σ3 og σ4) 8 . Aminosyresekvensen lengterH av proteiner kodet av rpoD og sigA er henholdsvis 613 og 685. RpoD og SigA deler 48% identitet (98% dekning). Disse primære sigmafaktorene ble delt inn i to komplementære fragmenter mellom regioner σ2 og σ3. To kimære gener ble samlet i henhold til denne konstruksjonen: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) og kimær 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusjonsprodukter ble verifisert ved sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI ble designet som et alternativ til PRM 2 . Den opprinnelige PRM er en kraftig teknikk; Det tillater fusjon av DNA-sekvenser langs hvilken som helst del av de valgte gener. For PRM bør wildtype-gener klones inn i det samme plasmidet. Deretter er oligonukleotider konstruert inne i wildtype- og antibiotikaresistensgener funnet på plasmidet. Plasmidforstyrrelse oppnås ved PCR ved bruk av stump-endede, høyfidelis-DNA-polymeraser og tidligere utformede oligonukleotider. Ligeringen av kompl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia og Tecnología, CONACYT, México (stipendnummer 154833) og Universidad Nacional Autónoma de México. Forfatterne ønsker å takke Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos og Soledad Juárez for deres administrative og tekniske råd.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
