CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi
Summary
Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.
Abstract
Burada, plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. CAPRRESI orijinal plazmid geri kazanım yönteminin pek çok avantajından yararlanır ve DNA ligasyon reaksiyonlarını kolaylaştırmak için kısıtlama enzimi sindirimini sağlar (kimera montajı için gerekli). Bu protokol için, kullanıcılar aynı plazmite vahşi tip genleri klonlamışlardır (pUC18 veya pUC19). Kimeraların birleştirilmesi gereken amino asit dizisi bölgelerinin in silico seçiminden sonra, kullanıcılar şifreleyen tüm eşanlamlı DNA dizilerini elde eder. Geçici Perl betiği, kullanıcıların tüm eş anlamlı DNA dizilerini belirlemelerini sağlar. Bu adımdan sonra, başka bir Perl betiği tüm eş anlamlı DNA dizileri üzerinde kısıtlama enzim siteleri arar. Bu siliko analiz de pUC18 / 19 plazmidlerinde bulunan ampisilin direnç genini ( ampR ) kullanarak gerçekleştirilir. Kullanıcılar, PCR ile wildfit ve ampR genlerini parçalamak için eşanlamlı bölgeler içerisindeki oligonükleotidleri tasarlarlar . Obt'dan sonraTamamlayıcı DNA fragmanlarını arındırma ve saflaştırma, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilir. Şimera montajı, uygun tamamlayıcı DNA fragmanlarının bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Küçük ebat (2.686 baz çifti), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik gibi teknik avantajlar sundukları için CAPRRESI için pUC18 / 19 vektörleri seçilmiştir. Kimera montajı için restriksiyon enzimlerinin kullanımı, künt uçlu ürünler üreten DNA polimerazlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. CAPRRESI, protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.
Introduction
Kimerik gen montajı, protein fonksiyonunu ve / veya biyoteknolojik amaçları aydınlatmak için moleküler biyolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Çakışan PCR ürün amplifikasyonu 1 , plasmid geri kazanım 2 , homolog rekombinasyon 3 , CRISPR-Cas9 sistemleri 4 , bölgeye yönelik rekombinasyon 5 ve Gibson topluluğu 6 gibi genleri kaynaştırmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bunların her biri farklı teknik avantajlar sunmaktadır; Örtüşen PCR tasarımının esnekliği, plazmid geri kazanım sırasında yapıların in vivo seçimi veya CRISPR-Cas9 ve Gibson sistemlerinin yüksek etkinliği. Öte yandan, bu yöntemlerin bazılarını yerine getirirken bazı zorluklar ortaya çıkabilir; Örneğin, ilk iki yaklaşım kör uçlu DNA fragmanlarına dayanır ve bu tür ürünlerin ligasyonu stik ile karşılaştırıldığında teknik açıdan zor olabilirKy-bitişli ligasyon. Site yönlendirmeli rekombinasyon, CreoLuxP sisteminde olduğu gibi, orijinal üzerinde fazladan DNA dizileri izi bırakabilir ( 5) . CRISPR-Cas9 bazen hedef bölgeye ek olarak diğer genom bölgelerini de değiştirebilir 4 .
Burada, plasmid geri kazanım yöntemini (PRM) eşanlamlı DNA dizileri üzerindeki kısıtlama enzimi alanlarının eklenmesi ile birleştiren protein kodlayıcı genlerin kaynaştırılması için bir protokol olan plazmid kurtarma ve restriksiyon enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajı başlattığımızdan, ligasyon verimliliğini arttırıyoruz . Amino asit dizilimi bütünlüğünü sağlamak için, sınırlama enzimi sahaları, eş anlamlı DNA sekansı uzantılarına eklenir. CAPPRESI'nin yararları sıradan laboratuar reaktifleri / araçları ( örneğin enzimler, yetkili hücreler, çözeltiler ve termosikleler) kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve hızlı enzim (uygun enzim kullanıldığında) hızlı sonuçlar verebilmesidir. Kısıtlamaya güvenmekEş anlamlı DNA sekanslarından çıkan enzim siteleri, ilgi proteinleri içindeki tam füzyon noktalarının seçimini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, hedef genler örtüşen oligonükleotidler kullanılarak kaynaştırılmalı ve sınır enzimi alanları vektörün direnç geni üzerine eklenmelidir.
CAPRRESI yedi basit adımdan oluşur ( Şekil 1 ): 1) klonlama vektörü, pUC18 veya pUC196'nın seçilmesi; 2) kaynaştırılacak olan vahşi tipli dizilerin in silico analizinde; 3) kimera montajı ve plasmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçilmesi; 4) sınırlama enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretilmesi; 5) vahşi tiplendirilmiş genlerin seçilen plazmite bağımsız olarak klonlanması; 6) PCR ile plasmid parçalanması, ardından kısıtlama enzimi sindirimi; Ve 7) DNA ligasyonu ve bakteri dönüşümü kullanılarak plazmid geri kazanım. Bu teknikle üretilen kimerik genler,Sıralama.
PUC18 / 19 vektörleri, küçük boy ( yani 2,686 baz çiftleri), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik 7 gibi klonlama ve kimera montajı için teknik avantajlar sunar. Burada, kimera bir araya getirmek ve işlemek için bir Escherichia coli ana ürünü kullanıldı, çünkü bakteri kültürleri ucuzdur ve hızlı büyürler. Bu durumda, füzyon fragmanlarının nihai hedef plasmidlere daha sonra klonlanması gerekecektir ( örn., Bakterilerde pRK415 veya memeli hücrelerinde pCMV gibi ifade vektörleri).
CAPRRESI, iki primer sigma faktörü geninin füzyonu için test edildi: E. colirpoD ve Rhizobium etlisigA . Birincil sigma faktörleri, transkripsiyonun başlatılmasından sorumlu RNA polimeraz altbirimleridir ve bunlar dört alan ( yani, σ1, σ2, σ3 ve σ4) 8'den oluşur . Amino asit dizisi lengtRpoD ve sigA tarafından kodlanan proteinlerin sırasıyla sırasıyla 613 ve 685'dir . RpoD ve SigA% 48 kimliğe sahiptir (% 98 kapsama alanı). Bu primer sigma faktörleri, bölgeler σ2 ve σ3 arasında iki tamamlayıcı parçaya ayrıldı. Bu tasarıma göre iki şimerik gen toplandı: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ve kimerik 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA füzyon ürünleri sıralamayla doğrulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI, PRM 2'ye alternatif olarak tasarlandı. Orijinal PRM güçlü bir tekniktir; Seçilen genlerin herhangi bir kısmı boyunca DNA sekanslarının kaynaşmasına izin verir. PRM için, vahşi tipli genler aynı plazmid içine klonlanmalıdır. Bundan sonra, oligonükleotidler, plasmidde bulunan vahşi tip ve antibiyotik direnç genleri içinde tasarlanır. Plazmid parçalanması, künt uçlu, yüksek doğrulukta DNA polimerazları ve önceden tasarlanmış oligonükleotitler kullanıla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, Meksika (hibe numarası 154833) ve Universidad Nacional Autónoma de Mexico tarafından desteklendi. Yazarlar, Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos ve Soledad Juarez'e idari ve teknik tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorlar.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
