Summary

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

Published: June 25, 2017
doi:

Summary

Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Abstract

Burada, plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. CAPRRESI orijinal plazmid geri kazanım yönteminin pek çok avantajından yararlanır ve DNA ligasyon reaksiyonlarını kolaylaştırmak için kısıtlama enzimi sindirimini sağlar (kimera montajı için gerekli). Bu protokol için, kullanıcılar aynı plazmite vahşi tip genleri klonlamışlardır (pUC18 veya pUC19). Kimeraların birleştirilmesi gereken amino asit dizisi bölgelerinin in silico seçiminden sonra, kullanıcılar şifreleyen tüm eşanlamlı DNA dizilerini elde eder. Geçici Perl betiği, kullanıcıların tüm eş anlamlı DNA dizilerini belirlemelerini sağlar. Bu adımdan sonra, başka bir Perl betiği tüm eş anlamlı DNA dizileri üzerinde kısıtlama enzim siteleri arar. Bu siliko analiz de pUC18 / 19 plazmidlerinde bulunan ampisilin direnç genini ( ampR ) kullanarak gerçekleştirilir. Kullanıcılar, PCR ile wildfit ve ampR genlerini parçalamak için eşanlamlı bölgeler içerisindeki oligonükleotidleri tasarlarlar . Obt'dan sonraTamamlayıcı DNA fragmanlarını arındırma ve saflaştırma, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilir. Şimera montajı, uygun tamamlayıcı DNA fragmanlarının bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Küçük ebat (2.686 baz çifti), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik gibi teknik avantajlar sundukları için CAPRRESI için pUC18 / 19 vektörleri seçilmiştir. Kimera montajı için restriksiyon enzimlerinin kullanımı, künt uçlu ürünler üreten DNA polimerazlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. CAPRRESI, protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Introduction

Kimerik gen montajı, protein fonksiyonunu ve / veya biyoteknolojik amaçları aydınlatmak için moleküler biyolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Çakışan PCR ürün amplifikasyonu 1 , plasmid geri kazanım 2 , homolog rekombinasyon 3 , CRISPR-Cas9 sistemleri 4 , bölgeye yönelik rekombinasyon 5 ve Gibson topluluğu 6 gibi genleri kaynaştırmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bunların her biri farklı teknik avantajlar sunmaktadır; Örtüşen PCR tasarımının esnekliği, plazmid geri kazanım sırasında yapıların in vivo seçimi veya CRISPR-Cas9 ve Gibson sistemlerinin yüksek etkinliği. Öte yandan, bu yöntemlerin bazılarını yerine getirirken bazı zorluklar ortaya çıkabilir; Örneğin, ilk iki yaklaşım kör uçlu DNA fragmanlarına dayanır ve bu tür ürünlerin ligasyonu stik ile karşılaştırıldığında teknik açıdan zor olabilirKy-bitişli ligasyon. Site yönlendirmeli rekombinasyon, CreoLuxP sisteminde olduğu gibi, orijinal üzerinde fazladan DNA dizileri izi bırakabilir ( 5) . CRISPR-Cas9 bazen hedef bölgeye ek olarak diğer genom bölgelerini de değiştirebilir 4 .

Burada, plasmid geri kazanım yöntemini (PRM) eşanlamlı DNA dizileri üzerindeki kısıtlama enzimi alanlarının eklenmesi ile birleştiren protein kodlayıcı genlerin kaynaştırılması için bir protokol olan plazmid kurtarma ve restriksiyon enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajı başlattığımızdan, ligasyon verimliliğini arttırıyoruz . Amino asit dizilimi bütünlüğünü sağlamak için, sınırlama enzimi sahaları, eş anlamlı DNA sekansı uzantılarına eklenir. CAPPRESI'nin yararları sıradan laboratuar reaktifleri / araçları ( örneğin enzimler, yetkili hücreler, çözeltiler ve termosikleler) kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve hızlı enzim (uygun enzim kullanıldığında) hızlı sonuçlar verebilmesidir. Kısıtlamaya güvenmekEş anlamlı DNA sekanslarından çıkan enzim siteleri, ilgi proteinleri içindeki tam füzyon noktalarının seçimini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, hedef genler örtüşen oligonükleotidler kullanılarak kaynaştırılmalı ve sınır enzimi alanları vektörün direnç geni üzerine eklenmelidir.

CAPRRESI yedi basit adımdan oluşur ( Şekil 1 ): 1) klonlama vektörü, pUC18 veya pUC196'nın seçilmesi; 2) kaynaştırılacak olan vahşi tipli dizilerin in silico analizinde; 3) kimera montajı ve plasmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçilmesi; 4) sınırlama enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretilmesi; 5) vahşi tiplendirilmiş genlerin seçilen plazmite bağımsız olarak klonlanması; 6) PCR ile plasmid parçalanması, ardından kısıtlama enzimi sindirimi; Ve 7) DNA ligasyonu ve bakteri dönüşümü kullanılarak plazmid geri kazanım. Bu teknikle üretilen kimerik genler,Sıralama.

PUC18 / 19 vektörleri, küçük boy ( yani 2,686 baz çiftleri), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik 7 gibi klonlama ve kimera montajı için teknik avantajlar sunar. Burada, kimera bir araya getirmek ve işlemek için bir Escherichia coli ana ürünü kullanıldı, çünkü bakteri kültürleri ucuzdur ve hızlı büyürler. Bu durumda, füzyon fragmanlarının nihai hedef plasmidlere daha sonra klonlanması gerekecektir ( örn., Bakterilerde pRK415 veya memeli hücrelerinde pCMV gibi ifade vektörleri).

CAPRRESI, iki primer sigma faktörü geninin füzyonu için test edildi: E. colirpoD ve Rhizobium etlisigA . Birincil sigma faktörleri, transkripsiyonun başlatılmasından sorumlu RNA polimeraz altbirimleridir ve bunlar dört alan ( yani, σ1, σ2, σ3 ve σ4) 8'den oluşur . Amino asit dizisi lengtRpoD ve sigA tarafından kodlanan proteinlerin sırasıyla sırasıyla 613 ve 685'dir . RpoD ve SigA% 48 kimliğe sahiptir (% 98 kapsama alanı). Bu primer sigma faktörleri, bölgeler σ2 ve σ3 arasında iki tamamlayıcı parçaya ayrıldı. Bu tasarıma göre iki şimerik gen toplandı: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ve kimerik 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA füzyon ürünleri sıralamayla doğrulanmıştır.

Protocol

1. CAPRRESI Protokolü NOT: Şekil 1 , genel CAPRRESI protokolünü gösterir. Bu teknik, siliko tasarıma ve arzulanan kimeraların oluşturulmasına dayanır. Klonlama plasmidinin seçimi, pUC18 veya pUC19. Teknik taleplere en iyi uyan pUC vektörünü seçin. NOT: Her iki vektör birden fazla klonlama alanının yönlendirilmesi haricinde aynı sıraya sahiptir. Bu, oligonükleotidlerin tasarımı ve PCR plazmiti parça…

Representative Results

Şekil 1 , CAPRRESI'yi tasvir etmektedir. Bu yöntemi kullanarak, iki kimerik gen, iki bakteriyel primer sigma faktörünün alanlarını değiştirerek ( yani, E. coli RpoD ve R. etli SigA) toplandı. RpoD ve sigA genlerinin DNA dizileri sırasıyla GenBank genom dosyalarından Artemis Genome Browser 14 kullanılarak NC_000913 ve NC_007761'den elde edildi. PUC18 vektörünün DNA sekan…

Discussion

CAPRRESI, PRM 2'ye alternatif olarak tasarlandı. Orijinal PRM güçlü bir tekniktir; Seçilen genlerin herhangi bir kısmı boyunca DNA sekanslarının kaynaşmasına izin verir. PRM için, vahşi tipli genler aynı plazmid içine klonlanmalıdır. Bundan sonra, oligonükleotidler, plasmidde bulunan vahşi tip ve antibiyotik direnç genleri içinde tasarlanır. Plazmid parçalanması, künt uçlu, yüksek doğrulukta DNA polimerazları ve önceden tasarlanmış oligonükleotitler kullanıla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, Meksika (hibe numarası 154833) ve Universidad Nacional Autónoma de Mexico tarafından desteklendi. Yazarlar, Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos ve Soledad Juarez'e idari ve teknik tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorlar.

Materials

Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304011 Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit Roche 11754785001 Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit Roche 11732676001 Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme New England Biolabs R0520L Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3142L Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3133L Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme New England Biolabs R0145L Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166-5G Antibiotics
Nalidixic acid Sigma Aldrich N8878-5G Antibiotics
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625-1KG Bacterial cell culture
Casein peptone Sigma Aldrich 70171-500G Bacterial cell culture
NaCl Sigma Aldrich S9888-1KG Sodium chloride
Agar Sigma Aldrich 05040-1KG Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme Thermo Fisher FD0684 Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme Thermo Fisher FD0524 Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200S Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme Thermo Fisher FD0834 Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme Thermo Fisher FD1253 Fast digest SpeI enzyme

References

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  5. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
  8. Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
  9. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  10. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
  11. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
  12. Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).

Play Video

Cite This Article
Santillán, O., Ramírez-Romero, M. A., Dávila, G. CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion. J. Vis. Exp. (124), e55526, doi:10.3791/55526 (2017).

View Video