CAPRRESI: Chimären Assembly durch Plasmid Recovery und Restriktion Enzym Site Insertion
Summary
Hier präsentieren wir die Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI), ein Protokoll, das auf der Insertion von Restriktionsenzymstellen in Synonym-DNA-Sequenzen und funktionelle Plasmid-Recovery basiert. Dieses Protokoll ist eine schnelle und kostengünstige Methode zum Fixieren von Protein-kodierenden Genen.
Abstract
Hier präsentieren wir die Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI). CAPRRESI profitiert von vielen Stärken der ursprünglichen Plasmid-Wiedergewinnungsmethode und führt eine Restriktionsenzym-Verdauung ein, um DNA-Ligationsreaktionen zu erleichtern (erforderlich für die Chimären-Assemblierung). Für dieses Protokoll klonieren Benutzer Wildtyp-Gene in das gleiche Plasmid (pUC18 oder pUC19). Nach der in Silico- Selektion von Aminosäuresequenzregionen, in denen Chimären zusammengesetzt werden sollen, erhalten die Benutzer alle Synonym-DNA-Sequenzen, die sie codieren. Ad-hoc Perl-Skripte ermöglichen es Benutzern, alle Synonym-DNA-Sequenzen zu bestimmen. Nach diesem Schritt sucht ein anderes Perl-Skript nach Einschränkungsenzytsites auf allen Synonym-DNA-Sequenzen. Diese in der Silico- Analyse wird auch unter Verwendung des Ampicillin-Resistenzgens ( ampR ), das auf pUC18 / 19-Plasmiden gefunden wurde, durchgeführt. Benutzer entwickeln Oligonukleotide in Synonymregionen, um Wildtyp- und AmpR- Gene durch PCR zu stören. Nach obtAining und reinigen komplementäre DNA-Fragmente, Restriktionsenzym-Verdauung wird erreicht. Die Chimärenanordnung wird durch Ligieren geeigneter komplementärer DNA-Fragmente erreicht. PUC18 / 19-Vektoren sind für CAPRRESI ausgewählt, weil sie technische Vorteile wie kleine Größe (2.686 Basenpaare), hohe Kopienzahl, vorteilhafte Sequenzierungsreaktionsmerkmale und kommerzielle Verfügbarkeit bieten. Die Verwendung von Restriktionsenzymen für die Chimärenanordnung eliminiert die Notwendigkeit von DNA-Polymerasen, die stumpfendige Produkte ergeben. CAPRRESI ist eine schnelle und kostengünstige Methode zur Fusion von Protein-kodierenden Genen.
Introduction
Die chimäre Gen-Assemblierung wurde in der Molekularbiologie weit verbreitet, um die Proteinfunktion und / oder für biotechnologische Zwecke zu erhellen. Es gibt verschiedene Verfahren zum Fixieren von Genen, wie etwa die überlappende PCR-Produktverstärkung 1 , die Plasmidrückgewinnung 2 , die homologe Rekombination 3 , die CRISPR-Cas9-Systeme 4 , die ortsgerichtete Rekombination 5 und die Gibson-Anordnung 6 . Jeder von ihnen bietet verschiedene technische Vorteile. Zum Beispiel die Flexibilität der überlappenden PCR-Konstruktion, die in vivo Auswahl von Konstruktionen während der Plasmid-Wiedergewinnung oder die hohe Effizienz von CRISPR-Cas9- und Gibson-Systemen. Auf der anderen Seite können einige Schwierigkeiten auftreten, während einige dieser Methoden durchgeführt werden; Zum Beispiel beruhen die ersten beiden Ansätze auf stumpfendigen DNA-Fragmenten, und die Ligation dieser Art von Produkten könnte technisch anspruchsvoll im Vergleich zu Stic seinKy-ended ligation. Die ortsgerichtete Rekombination kann Spuren von zusätzlichen DNA-Sequenzen (Narben) auf dem Original hinterlassen, wie im Cre- loxP- System 5 . CRISPR-Cas9 kann manchmal auch andere Genomregionen zusätzlich zum Zielort 4 modifizieren.
Hier stellen wir eine Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI) vor, ein Protokoll zum Fixieren von Protein-kodierenden Genen, das die Plasmid-Recovery-Methode (PRM) mit der Insertion von Restriktionsenzymstellen auf Synonym-DNA-Sequenzen kombiniert, wodurch die Ligationseffizienz erhöht wird . Um die Aminosäuresequenz-Integrität zu gewährleisten, werden Restriktionsenzymstellen auf Synonym-DNA-Sequenz-Strecken eingefügt. Zu den Vorteilen von CAPPRESI gehören, dass es mit gewöhnlichen Laborreagenzien / -werkzeugen ( z. B. Enzymen, kompetenten Zellen, Lösungen und Thermocyclern) durchgeführt werden kann und dass es schnelle Ergebnisse liefern kann (wenn die entsprechenden Enzyme verwendet werden). Unter Berufung auf BeschränkungEnzym-Stellen, die aus Synonym-DNA-Sequenzen hervorgehen, können die Auswahl der exakten Fusionspunkte innerhalb der interessierenden Proteine einschränken. In solchen Fällen sollten Zielgene unter Verwendung von überlappenden Oligonukleotiden fusioniert werden, und Restriktionsenzymstellen sollten auf das Resistenzgen des Vektors insertiert werden.
CAPRRESI besteht aus sieben einfachen Schritten ( Abbildung 1 ): 1) Auswahl des Klonierungsvektors, pUC18 oder pUC19 6 ; 2) bei der Silico- Analyse der zu fusionierenden Wildtyp-Sequenzen; 3) Auswahl von Bruchregionen zur Chimärenanordnung und Plasmidstörung; 4) in der Silico- Erzeugung von Synonym-DNA-Sequenzen, die Restriktionsenzymstellen enthalten; 5) unabhängiges Klonieren der Wildtyp-Gene in das ausgewählte Plasmid; 6) Plasmidstörung durch PCR, gefolgt von Restriktionsenzymverdauung; Und 7) Plasmid-Wiedergewinnung unter Verwendung von DNA-Ligation und Bakterien-Transformation. Chimäre Gene, die durch diese Technik hergestellt wurden, sollten überprüft werdenIth Sequenzierung.
Die pUC18 / 19-Vektoren bieten technische Vorteile für die Klonierung und Chimärenmontage, wie z. B. kleine Größe ( dh 2.686 Basenpaare), hohe Kopienzahl, vorteilhafte Sequenzreaktionsmerkmale und kommerzielle Verfügbarkeit 7 . Hier wurde ein Escherichia coli- Wirt verwendet, um die Chimären zu montieren und zu behandeln, weil Bakterienkulturen billig sind und schnell wachsen. Angesichts dieser Tatsache wird die anschließende Klonierung der Fusionsfragmente in die endgültigen Zielplasmide benötigt ( zB Expressionsvektoren als pRK415 in Bakterien oder pCMV in Säugetierzellen).
CAPRRESI wurde auf die Verschmelzung von zwei primären Sigma-Faktor-Genen getestet: E. colirpoD und Rhizobium etlisigA . Primäre Sigma-Faktoren sind RNA-Polymerase-Untereinheiten, die für die Transkriptionsinitiierung verantwortlich sind, und sie bestehen aus vier Domänen ( dh σ1, σ2, σ3 und σ4) 8 . Die Aminosäuresequenz lengtH von von rpoD und sigA kodierten Proteinen sind 613 bzw. 685. RpoD und SigA teilen 48% Identität (98% Deckung). Diese primären Sigma-Faktoren wurden in zwei komplementäre Fragmente zwischen den Regionen σ2 und σ3 aufgeteilt. Zwei chimäre Gene wurden nach diesem Entwurf zusammengesetzt: Chimäre 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) und Chimäre 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-Fusionsprodukte wurden durch Sequenzierung verifiziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAPRRESI wurde als Alternative zum PRM 2 konzipiert . Die ursprüngliche PRM ist eine leistungsfähige Technik; Es ermöglicht die Verschmelzung von DNA-Sequenzen entlang eines beliebigen Teils der ausgewählten Gene. Für PRM sollten Wildtyp-Gene in das gleiche Plasmid kloniert werden. Danach werden Oligonukleotide innerhalb von Wildtyp- und Antibiotika-Resistenzgenen, die auf dem Plasmid gefunden wurden, entworfen. Die Plasmidstörung wird durch PCR unter Verwendung von stumpfendigen, hochaufl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (Stipendium 154833) und Universidad Nacional Autónoma de México unterstützt. Die Autoren danken Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos und Soledad Juárez für ihre administrativen und technischen Beratung.
Materials
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304011 | Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products |
| High pure plasmid isolation kit | Roche | 11754785001 | Used for all plasmid purification reactions |
| High pure PCR product purification kit | Roche | 11732676001 | Used for all PCR purification reactions from agarose gels |
| AflII restriction enzyme | New England Biolabs | R0520L | Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3142L | Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C |
| SpeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3133L | Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C |
| XbaI restriction enzyme | New England Biolabs | R0145L | Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166-5G | Antibiotics |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N8878-5G | Antibiotics |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625-1KG | Bacterial cell culture |
| Casein peptone | Sigma Aldrich | 70171-500G | Bacterial cell culture |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | Sodium chloride |
| Agar | Sigma Aldrich | 05040-1KG | Bacterial cell culture |
| XbaI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0684 | Fast digest XbaI enzyme |
| KpnI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0524 | Fast digest KpnI enzyme |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Fast DNA ligation kit |
| AflII restriction enzyme | Thermo Fisher | FD0834 | Fast digest AflII enzyme |
| SpeI restriction enzyme | Thermo Fisher | FD1253 | Fast digest SpeI enzyme |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
- Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
- Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , 1-22 (2002).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
- Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).
